הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

Biology
 

Summary

Microarrays רקמות מאפשר שיטה יעילה לקבל מידע מקבילים ממספר רב של רקמות. חלקים מייצגים של רקמות נאספו לידי בלוק פרפין אחת. קטעים מתוך בלוק משמשים אימונוהיסטוכימיה וניתוח דפוסי ביטוי חלבון. סריקה דיגיטלית מייצר תמונות המתאימות להפצה של נתונים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

רקמת microarray (TMA) הטכנולוגיה מספקת את האמצעים לניתוח תפוקה גבוהה של רקמות תאים רבים. הטכניקה משמשת במסגרת פרוייקט האדם חלבון אטלס לניתוח העולמי הביטוי דפוסי חלבון ברקמות אדם נורמליים, סרטן שורות תאים. כאן אנו מציגים את הרכבה של 1 מ"מ ליבות, לאחזר מרקמות נציג שנבחרו מיקרוסקופית, לתוך בלוק אחד הנמען TMA. מספר וגודל ליבות בבלוק TMA יכולים להיות מגוונים מ כ 40 מ"מ עד 2 ליבות מאות ליבות 0.6 מ"מ. היתרון של שימוש בטכנולוגיה TMA היא כי כמות גדולה של נתונים במהירות יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול immunostaining אחת, כדי למנוע השתנות ניסיוני. חשוב לציין, רק כמות מוגבלת של רקמות נדירים יש צורך, המאפשר ניתוח של קבוצות חולים גדולות 1 2. כ 250 קטעים רצופים (4 מיקרומטר עבה) ניתן לחתוך מבלוק TMA ושימשו staini immunohistochemicalng לקבוע דפוסים מסוימים ביטוי החלבון על 250 נוגדנים שונים. בפרויקט האדם חלבון אטלס, נוצרים נוגדנים כלפי כל החלבונים האנושיים נהג לרכוש פרופילים חלבונים המתאימים בשתי רקמות אדם נורמלי מ 144 אנשים ורקמות סרטן מ 216 חולים שונים, המייצגים את 20 הצורות הנפוצות ביותר של סרטן אנושי. מוכתמים Immunohistochemically סעיפים TMA על שקופיות הזכוכית נסרקים ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה שממנו פתולוגים יכול לפרש ויסמנו את התוצאה של אימונוהיסטוכימיה. תמונות יחד עם הפתולוגיה מבוססי הנתונים המתאימים הסברים זמינים בפומבי למען הקהילה המחקר באמצעות חלבון אנושי אטלס הפורטל ( www.proteinatlas.org ) (איור 1) 3 4. אטלס החלבון האנושי מספק מפה המראה את הפיזור והשפע היחסי של החלבונים בגוף האדם. גרסה הנוכחישיאון מכיל מעלה מ -11 מיליון תמונות עם הביטוי נתונים חלבון עבור 12.238 חלבונים ייחודיים, המתאימים יותר מ 61% מכלל החלבונים המקודדים על ידי הגנום האנושי.

Protocol

1. כיצד להכין רקמות לייצור microarray רקמות (אנימציה 1)

  1. בחר חומר רלוונטי פורמלין פרפין קבוע המוטבע (דגימות רקמה או תאים) כולל סעיף hematoxylin המקביל רקמה צבעונית.
  2. סמן האזור הרלוונטי בקטע הרקמה. מומלץ יש לקצץ בסעיף זה עתה hematoxylin צבעונית המתאים בלוק פרפין.
  3. עיצוב תבנית המשמש לייצור TMA. באופן אקראי דגימות בתוך התבנית, כדי למנוע חפצים הנגרמת על ידי בעיות טכניות, כגון כיסוי של הנוגדן על סעיף TMA כל בעיות חתך. הוספת סמנים אוריינטציה נוספים לתבנית על הכיוון.
  4. ארגן את הרקמות על פי התבנית.

2. רקמות ידנית הפקה microarray (חיוני עבור הצילומים)

  1. כדי להיות מסוגל לקבל באורך סטנדרטי של ליבות רקמות, סמן stylet למשל 4.5 מ"מ (איור 2). Guidelאינס על המרווח בין מרכזי מדגם:
    גודל הליבה 0.6 מ"מ - 0.8-1.0 מ"מ
    גודל הליבה 1.0 מ"מ - 1.8-2.0 מ"מ
    גודל הליבה 1.5 מ"מ - 2.0-3.0 מ"מ
    גודל הליבה 2.0 מ"מ - 2.5-4.0 מ"מ
    מומלץ להשאיר שוליים 2.5-3.0 מ"מ בכל צד של בלוק פרפין כדי למנוע פיצוח של פרפין.
    1. הר את המכות שנבחרו לשמש. התחל על ידי שחרור הברגים שקע hex שמחזיק את האגרוף במקום. אגרוף ממוקם כהלכה כאשר חריץ רכזת אגרוף ממוקם היטב פלסטיק V-בלוק על מוט מתכת. הדקו את הברגים וודא קצה קליפ המתכת הוא אופקי.
    2. מקבל אגרוף (מסומן בירוק ואדום, ספציפית עבור מפיץ) צריך להיות ממוקם בצד שמאל. התורם אגרוף (מסומן ירוק וכחול, ספציפית עבור מפיץ), אשר יש קוטר מעט גדול יותר, צריך להיות ממוקם בצד ימין (איור 3).
    1. להעביר את המכות לאורך ה-X ו-Y למוצרי צירים באמצעות כפתורים התאמה XY. ידית כוונון נכון מעביר את המכות לאורך ציר ה-x ו את כפתור כוונון שמאל מעביר את המכות לאורך ציר ה-Y.
      יש readout מיקרומטר דיגיטלי משני כפתורים התאמה. אלה מופעלים בעת מעבר הכפתורים.
    2. איפוס → לחץ על הלחצן אפס / ABS.
      לעבור בין סנטימטרים מ"מ → לחץ על כפתור / מ"מ.
      רווח בין החורים צריך להיות 2.0 מ"מ (נמדד בין מרכזי החורים) בעת שימוש אגרוף 1 מ"מ עבור תבנית 9x8.
    1. על מנת להבטיח כי אתה לא דוחף את האגרוף רחוק מדי אל תוך הרחוב, להכות את הקלטת והורסים את האגרוף, את קלטת ללא פרפין בעריסה ולהגדיר את המיקום התחתון של הנמען אגרוף 1 מ"מ מעל החלק התחתון של קלטת באמצעות בורג להפסיק עומקבפינה השמאלית העליונה של Z-guide (איור 3).
    2. מכניסים את גוש הנמען בעל ולהשתמש במברג הקטן ביותר להדק את הברגים. אין להדק את הברגים כדי חזק או פרפין יכול להשתחרר מן הקלטת.
    3. לדחוף את המחץ הנמען כלפי מטה כ 5 מ"מ לתוך גוש הנמען ולהשתמש בידית של אגרוף כדי לסובב את האגרוף הלוך ושוב פעם אחת (איור 3). החור יהיה 5 מ"מ עמוק כאשר דוחפים את האגרוף עד לתוך בלוק ככל האפשר.
    4. לשחרר את הלחץ דוחף כלפי מטה באיטיות, כך המעיינות יכול להזיז את האגרוף למעלה. השתמש stylet לרוקן את האגרוף וזורקים את הגרעין פרפין.
  2. להזיז את הצריח כדי לעבור התורם אגרוף (איור 3).
  3. מניחים את גשר גוש התורם עם בלוק תורם על בעל בלוק הנמען (איור 3).
    1. דחוף את punc התורםH לאזור הנבחר של גוש התורם. השתמש hematoxylin המתאים שקופיות eosin מוכתם שם אזור של אינטרס סומן כדי לאתר את הרקמה יש שנדגמו. באופן ידני להחזיק בלוק תורם בעמדה עם יד שמאל ולדחוף את האגרוף עם יד ימין. שים לב, אתה לא צריך ללחוץ על stylet. התחנה עומק אינו חוסם את התנועה אגרוף במיקום הנכון עבור בלוק התורם, ולכן חשוב כי אתה מפסיק לדחוף כאשר סימן 2 הוא נראה stylet.
    2. סובב את הידית על אגרוף פעם אחת (איור 3). לאט לאט לשחרר את הלחץ כלפי מטה ועדיין מחזיק בלוק התורם על גשר אבן התורם.
    3. רקמות התורם הוא אגרוף רצוי 0.5 מ"מ קצר יותר מאשר ליבת הנמען. תהליך זה יבטיח יישור מתכווננת של גרעינים על פני בלוק הנמען, מניעת אובדן רקמות נציג יקר.
  4. הסר את הגשר גוש התורם. לעשותבטוח התורם אגרוף מיושר עם חור שנעשה קודם לכן (נקודה 4). עליך להתאים את המיקום באמצעות אגרוף את הברגים להגדיר אם אגרוף התורם חור בבלוק הנמען לא מיושרים.
  5. בזהירות לדחוף אגרוף כלפי מטה עד קצהו מגיע החלק העליון של החור בבלוק הנמען. בעוד מחזיק בעמדה זו, השתמש stylet לרוקן את הליבה רקמה לתוך הבור. משטח הליבה צריך להיות בקנה אחד עם משטח אבן.
  6. להזיז את הצריח כדי אגרוף הנמען.
  7. מעבר לתפקיד הבא עם ידיות התאמה XY.
  8. חזור מ 4C נקודות מעל עד מערך הושלמה.
  9. כאשר הנמען בלוק שלם נגמר, שחררו את הברגים של מחזיק בלוק הנמען. אופים את הבלוק 42 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. שים בלוק עם שטח חתך כלפי מטה על זכוכית שקופית. מניחים את שקף זכוכית עם בלוק על גבי בעל מבחן צינור (או בניה מתאים אחר) ומניחים tהוא התנור. לאחר האפייה מוציאים את בעל מבחנה מהתנור ולשטח את פני השטח של גוש ידי מלטפת בעדינות את השקף זכוכית.
  10. מניחים את גוש עם שקופיות זכוכית על מגש קירור במשך 10 דקות.
    על מנת להבטיח רקמות נציג ברחבי TMA בקרת איכות על כל סעיף 50 ה מבוצע.

3. כיצד TMAs בפסקה (אנימציה 2)

  1. חותכים 4 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות microtome עם מערכת בסעיף ההעברה (HM 355S, Microm). המערכת יכולה לשמש עם כל microtomes רוטרי הנוכחי. המערכת כוללת של המוביל להב עם גשר העברה משולבת, אמבטיה מים מחוממת יחידת הבקרה. מ להב הסעיפים להחליק על משטח רטוב העברה באמצעות גשר העברה לאמבטיה מים.
  2. חלקים יש לקחת מן האמבטיה במים מיד אחרי שהם מתוחות, כדי למנוע התכה של נקודות רגישות רקמות (רקמות השומנים למשל עשירים כמו השד והמוח). PLACE סעיף בשקופית כוס superfrost. זמן בסעיפים ניתן להשאיר במים תלוי בסוג של פרפין בשעווה בשימוש, טמפרטורת המים. השימוש במעבדה שלנו פרפין שעווה HistoLab מוצרים AB, אשר יש נקודת ההתכה של 56-58 מעלות צלזיוס, מומלץ לעשות אמבטיה במים בטמפרטורה של 37-39 ° C.
  3. מניחים את שקופיות בעל שקופית לייבוש בטמפרטורת החדר (RT) במשך הלילה.
  4. השקופיות אופים 50 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות. שימוש microtom ללא STS אתה צריך להעביר את קטע להב לאמבטיה מים באופן ידני על ידי שימוש במברשת למשל.

4. הבדיקה נוהל טיטרציה עבור אימונוהיסטוכימיה (אנימציה 3)

נוגדן זה הוא נתון בהליך בדיקה סטנדרטית באמצעות בייחוד TMAs שנועדו המכילים תערובת של רקמות תאים מסוגים שונים. המטרה היא להעריך את פרוטוקול immunostaining אישית אופטימיזציה עבור כל נוגדן. בתחילה 1 דילול, בהתבסס על נמליםריכוז ibody המניות של הנוגדן הראשוני נבדק. התוצאה של מכתים את המבחן הזה משמש להנחות דילולים נוספים ואופטימיזציה של פרוטוקול.

  1. Deparaffinization והידרציה באתנול קסילן ו מדורג למים מזוקקים מבוצעות לפני immunostaining.
  2. צעד חסימת להרוות peroxidase endogeneous מבוצעת 0.3% H 2 O 2 באתנול 95% במשך 5 דקות.
  3. חום מושרה epitope אחזור (הייר) מתבצעת ב-pH חיץ אחזור 6, באמצעות הדוד בלחץ (תא Decloaking, Biocare רפואי) כמקור חום במשך 4 דקות ב 125 ° C. לאחר השלמת רותחים, שקופיות להישאר בדוד לחץ מותר לקרר עד 90 ° C. זמן העיבוד הכולל של הייר הוא כ 45 דקות.
  4. אם אין תוצאה חד משמעית מתקבל במבחן הראשוני, בדיקות נוספות מתבצעות על בסיס דפוס מכתים הנצפית 5 6. מחקר פיילוט, בתוך HPA תפוקה גבוהה הגדרת, הראוכי אחזור אנטיגן שימושי ביותר שבו הייר pH 6, אבל אחזור שיטות אחרות כגון הדגירה מראש עם מיקרוגל proteinase, ואת רותחים במאגר עם pH גבוה או נמוך יכול כמובן לשמש. למשל על ידי שינוי מצב IHC שינוי דגירה נוגדנים פעמים, דילולים נוגדנים ואת Diaminobenzidine (DAB) פעמים דגירה דפוס מכתים יכול לתת תוצאות חותכות יותר.

5. תוכנית צביעה, Autostainer 480 (תרמו פישר סיינטיפיק)

Incubations כל נעשים על RT ופרוטוקול זה יכול לשמש גם בתור התקנה ידנית עם חומרים כימיים אותם.

  1. יש לשטוף במאגר הכביסה.
  2. הדגירה עם בלוק V Ultra במשך 5 דקות.
  3. יש לשטוף במאגר הכביסה.
  4. הדגירה עם נוגדן ראשוני במשך 30 דקות.
  5. יש לשטוף בכביסה חיץ (X2).
  6. הדגירה עם צנון סוס שכותרתו peroxidase פולימר במשך 30 דקות.
  7. יש לשטוף בכביסה חיץ (X2).
  8. פיתוח פתרון DABבמשך 10 דקות.
  9. יש לשטוף בכביסה חיץ (X2).
  10. Counterstaining ב מאירס hematoxylin עבור * 5 דקות. בעת שימוש בשיטת צביעה מתקדמת (למשל מאירס hematoxylin) עוצמת תלוי זמן ואין בידול נדרש. שיטה רגרסיבית מכתים למשל האריס hematoxylin דורש בידול להסיר צבע עודפי רקמות כדי להדגיש את המבנה.
  11. יש לשטוף ב * מי ברז.
  12. יש לשטוף במים ליתיום קרבונט, בדילול 01:05 מפתרון רווי עבור * 1 דקה.
  13. יש לשטוף במי ברז למשך 5 דקות *.
  14. השקופיות הן מיובש באתנול מדורג ומגלשות הם coverslipped (PERTEX, Histolab)

ריאגנטים כל מוחלים בהיקף של 300 μl לכל שקופית.
* Quick שלבים 10-14 נעשים כלי histostaining (Autostainer XL, לייקה) ואת coverslipping נעשית בנוסף במערכת coverslipper (coverslipper זכוכית אוטומטי CV5030, לייקה).

6. כיצד לסרוקSlide

השיטה של ​​שקופיות סריקה תלויה סורק דיגיטלי מנוצל, פרוטוקול זה רק מגדיר כיצד לסרוק שקופיות באמצעות מערכת אוטומטית סריקה Aperio XT (Aperio טכנולוגיות). ב ההגדלה החלבון האנושי אטלס 20x הגדרת עבור רקמות ו 40X עבור התאים משמשים. סריקה אוטומטיות יכול להיתקל בבעיות מיקוד בשל ההטרוגניות של רקמת ומספר רקמות שונות שנכללו TMA.

  1. נקו את השקופית זכוכית דבק לכלוך, לבדוק בועות אוויר בין coverslip והחלק. במקרה של בועות האוויר לעלות שוב את השקופית.
  2. לשים את השקופית במעמד ומקום המעמד סורק דיגיטלי. זמן לסרוק TMA בהגדלה 20x הוא כ 6 דקות. התוכנה מ Aperio משמש כדי לבחור שטח של עניין. נקודת הבחירה המיקוד נעשה באופן אוטומטי בתוך התוכנה. באופן ידני הבחירה של אזור הסריקה ואת נקודות המיקוד הוא גם אפשרי.
  3. אחרי התמונה Hכמו נוצר זה יכול לשמש להערכה ביאור של מכתים IHC. תמונות להישאר כקובץ תוצאה של הניסוי ניתן להפיץ לעמיתים ודיון בנושא שימוש נוסף לפרסום הנתונים. התמונות ניתן לראות תוכנה להורדה חופשית מ Aperio.

7. כיצד לחפש אחר חלבון האהובה עליך אטלס החלבון האנושי

  1. עיון כדי www.proteinatlas.org.
  2. הזן את שם החלבון האהוב עליך, Ensembl תעודת זהות, מספר UniProt ההצטרפות או למשל HGNC אינסולין שם.
  3. הזן את דף סיכום לגלול למטה כדי הרקמות וסיכום איברים. סקירה כללית מראה ביטוי חלבונים בלבלב.
  4. לחץ על "נתונים רקמות יותר". אתה מזין את הרקמות הנורמליות להציג בו ניתן לראות את כל הרקמות כללו מיון לפי איברים.
  5. לחץ על הלבלב כדי לראות את התוצאות IHC 3 נוגדנים המכוונים אותו חלבון. כדי להציג הייGH-רזולוציית תמונה של הלבלב לחץ על התמונה.
  6. מידע נוסף על ביטוי החלבון ברקמת סרטן, תאים אימות נתונים נוספים בתוך אטלס החלבון האנושי ניתן למצוא באמצעות כניסה לאתר החלבון האנושי אטלס.

8. נציג תוצאות

אנימציה 1. איך להכין רקמות לייצור microarray רקמות. לחץ כאן כדי להציג אנימציה 1 .

אנימציה 2. כיצד TMAs סעיף. לחץ כאן כדי להציג אנימציה 2 .

3 אנימציה. טכניקה אימונוהיסטוכימיה מתואר. לחץ כאן כדי להציג אנימציה 3 .

איור 1
באיור 1. תוכנית כוללת של התהליך בתוך החלבון האנושי אטלס אופסלה.

איור 2
2. איור תורמים stylet מסומן לאורך אחיד של ליבות רקמות כגון 4.5 מ"מ.

איור 3
איור 3. Microarrayer רקמות ידני.

איור 4
איור 4. דוגמאות של איכות שונה של TMAs המיוצרים. (א) ישר מיושר כראוי TMA עם מספיק מקום בין שורות ועמודות, כמו גם על שפת פרפין. (ב) TMA עם כמה ליבות של קרוב מדי לקצה וכתוצאה מכך קשיים סביר כאשר חתך. (ג) TMA כי כבר אפוי עבור Too זמן וכתוצאה מכך TMA שהתמוטט ללא תבנית נכונה.

איור 5
איור 5. Hematoxylin ו TMAs eosin מוכתמים. (א) בסעיף לחתוך כראוי עם עמודות ושורות ישרות מיושר. באמצעות סכין רע או מלוכלך יכול לגרום פיצול (ב) או קטעים דחוסים (ג).

איור 6
איור 6. טיטרציה של נוגדנים. () תגובת התאים מרכז ב הלימפה מראה נוגדנים טיטרציה בצורה אופטימלית וכתוצאה מכך מכתים cytoplasmic ספציפי (מוצג חום) ללא רקע. (ב) בסעיף רקמת מראה צביעה חלשה. מכתים שלילי או חלש נמצא כאשר ריכוז הנוגדן העיקרי נמוכה מדי או אם חלבון המטרה אינו נוכח ברקמות immunostained. (ג) סעיף רקמות overstained כתוצאה משימוש ריכוז גבוה מדי של הנוגדן הראשוני. דהארון תוצאות צבע קשיים שקובע את המיקום subcellular בשל לגלוש, לחצות ריאקטיביות חיוביות שגויות.

Discussion

אימונוהיסטוכימיה הוא ללא ספק היישום הנפוץ ביותר עבור TMAs. שילוב של IHC ו TMAs ניתן להשתמש במסגרות שונות, כגון סינון תפוקה גבוהה של ביטוי דפוסי חלבון ברקמות 7 8 תאים 9 10 מחקרים, גילוי סמן ביולוגי המבוסס על דגימות רקמה של קבוצות חולים גדולות 11 12 ויותר ביולוגיה הגידול הבסיסי מחקרים, כולל פנוטיפים / גנוטיפים שונים, שלבי התמיינות, התקדמות גרורות 13. אחד היתרונות של שימוש TMAs הוא חומר קבוצות גדולות ניתן לנתח בו זמנית, בשני הניסויים לשחזור יותר חיסכון חומר ביולוגי בעל ערך והבטחת. יתר על כן, השימוש TMA הטכנולוגיה חוסכת בעלויות מגיב ועיבוד הזמן במעבדה. כמו TMA מכיל רק כמות מוגבלת של רקמות, רקמות ההטרוגניות היא הבעיה. בהתאם לסוג של רקמות שאלות כדי לקבל מענה, מספר דוגמאות עשוי להיות נחוץ מן specime אותהn. עבור רקמות סרטן, שימוש של שניים עד ארבעה ליבות כל אחד מן הדגימה מומלץ כפי שהוא הוכח לגרום ברמה גבוהה של דיוק בייצוג של סעיפים רקמות שלמות 13 14. תלוי בהרכב רקמות בקוטר של אגרופים (החל מ 0.6 מ"מ 2) יכול להיות מותאם. רקמות מורכבים מורכב משני סוגי תאים שונים, מבנים שונים מחוץ הסלולר מטריקס. ההרכב של כל סוג רקמה שונה המכיל כמות משתנה של שומן, כלי דם, רקמת חיבור, סחוס וכו ', ישפיע על הלחץ הדרוש אגרופים איסוף ליבות נפרדות. לכן חשוב לתרגל את כל השלבים בהליך על חומר שאינו בעל ערך כלשהו, ​​לפני הפקת TMA עם רקמות שהוגדרו עבור הניסויים המיועדים.

כאשר חתך מגוון של רקמות שונות בתוך בלוק TMA 1 את הרכב הבלוק יכול להשפיע על היכולת לרכוש חלקים באיכות גבוהה. Certain רקמות, כגון עור, מוח עצם, מוח שומן, חזה, לדקלם חתך של גוש TMA קשה בשל השפעת הבדלי מרקם מקרין כמה סעיפים להושיט באמבט מים עד כמה קשיות שונה נחתך על ידי הלהב וכו ' לכן מומלץ לרקמות הקבוצה עם תכונות דומות כגון רקמת השומן עשירה לאחת TMA, כאשר ישים. רוב רקמות סרטן הן במובן זה הומוגנית, המאפשרת חתך של TMAs סרטן. שיטת חתך חלופה לייצוב ליבות microarray יכול להיות מועסק בעת טיפול TMA עם סוגי הטרוגניות של רקמות. השימוש סרט דבק יכול להיות מועיל, כדי למנוע את אובדן ליבות הנשורת ב TMA מחולק. שימוש בסרט הדבקה צריך להיות מועסק בזהירות, שכן הסרט יכול להשפיע על עובי של ליבות מחולקות למדורים ולאחר מכן גם את התוצאה של הכתמה IHC 15. ב חלבון אטלס האדם הגדרת תבנית TMA של 9x8 (לא כולל סמנים) ליבות arדואר בשימוש. יש חשיבות לקבל מספר מקסימלי של חלקים ולשמור את כל הרקמות המיוצגים לאורך הרחוב. כדי לשמור ריאגנטים וזמן הסריקה, סעיפים 2 ממוקמים בשקופית 1 כוס המאפשר תבנית המרבי של 9x8.

מאגר מרכזי עבור מידע חלבון, 16 Universal Resource חלבון כולל כ 20.300 ערכים הנסקרת חלבון אדם, מתוכם רק כ 66% יש ראיות ברמת החלבון. גם ברוב של גנים אשר יש עדויות לקיום ברמת החלבון, יש נדירים, אם בכלל, מידע על תפקוד החלבון והפצה של הביטוי. אתגר חשוב לעתיד היא לנתח את דפוס חלוקת והשפע היחסי של החלבונים האלה מוכרים סוגים שונים של רקמה אנושית. מידע ממסדי נתונים כגון Uniprot, ENSEMBL, הנתונים שפורסמו מתוך PubMed יכול לשמש כמדריך לקבוע אם דפוסי צביעה immunohistochemical באמצעות נוגדניםבמחלקות חלבונים לא ידועים מייצגים פרופילים חלבון בפועל של חלבון המטרה המיועד. בנוסף, מספר אסטרטגיות אימות אחרים נדרשים כדי להבטיח פונקציונליות נוגדנים, עבור פונקציונליות למשל נוגדנים במערכים חלבון, למחוק המערבי, immunofluorescence, חיסוני המשקעים הנפתח ניסויים. אולי הכלי החשוב ביותר עבור אימות של פונקציונליות נוגדנים היא להשתמש נוגדנים לזווג, כלומר שני נוגדנים שונים כנגד העלה נפרדות, שאינן חופפות אפיטופים על חלבון המטרה זהה, להשוות assay ספציפי התוצאה 17.

בהתבסס על מידע מלוקט, נוגדנים נבדקים טיטרציה על פי סטנדרטים IHC ואת החוויה של הבדיקה והאימות של מעל 35.000 נוגדנים הפרויקט האנושי חלבון אטלס. 20% על כל הגנים עם פרופילי חלבון, נתוני נוגדנים לזווג (2 או יותר נוגדנים כלפי שאינן חופפות אפיטופים על אותו חלבון) שימש כדי לקבוע אסתי הטובה ביותרבן הזוג של דפוס חלבון המתאים הביטוי. נוגדנים מותאמים מספקים האסטרטגיה האולטימטיבי עבור אימות אימונוהיסטוכימיה ספציפיות המבוססות על דפוסי ביטוי חלבונים. אסטרטגיה זו חשובה, כי מספר רב של רקמות שונות שנכללו ההקרנה הבסיסית מגביר את הסיכון תגובתיות צולבת. ראוי גם לציין כי רקמות מסוימות באופן כללי נוטים יותר להראות את הרקע מכתים מקרופאגים למשל, שריר חלק, מבנים צינוריים בכליות ו hepatocytes בכבד. נושאים נוספים שיש לקחת בחשבון כוללים וריאציות טכניקות עיבוד רקמות לאורך זמן על הרקמות שנלקחו חומר ארכיוני, אשר עלולה לגרום שווא דפוסים חיוביים שליליים או לא מתאים IHC צביעה. תופעה זו נתקלה גם בניתוח בחלק גדול. בקרות שליליות וחיוביות חיוניים ויש להשתמש בהם בכל הזדמנות אפשרית. עבור מחקרים עמוקים יותר כולל ניתוח פונקציונלי, שורות תאים עם ביטוי מסוים נאלץ ו לדפוק למטה של ​​TR המתאימיםanscripts (טכנולוגיה siRNA) ניתן להשתמש כדי ליצור פקדים. לקבלת תוצאות אופטימליות ב IHC, חשוב לבדוק ולהשתמש אחזור מערכות אנטיגן, שכן קיבוע בפורמלין גורם שינויים כימיים שונים כגון cross-linking, הידרוליזה של בסיסים שיף מסתירה את האנטיגן 18.

לסיכום, נוגדן מבוססי proteomics המעסיקים TMA טכנולוגיה IHC היא אסטרטגיה רב עוצמה ליצירת ביטוי חלבון נתונים בקנה מידה גדול. הפרויקט החלבון האנושי אטלס הוקם כדי ליצור מפה של ביטוי החלבון האנושי ברקמות אדם נורמליים וסרטן. מטרת הפרויקט היא להציג את הטיוטה הראשונה של אטלס חלבון מקיפה האדם בשנת 2015. בנוסף לאספקת פרופילים חלבון איברים ורקמות רגילים, המאמץ הזה גם מספק נקודת המוצא של מחקרים ביו, כולל המאמצים לגילוי סמן ביולוגי קליניים. המטרה הסופית היא להוסיף שכבת המידע הבא על גבי רצף הגנום האנושי Wiתהיה קריטית להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה שבבסיס מחלות מדינות שונות, ולספק בסיס לפיתוח כלי אבחון טיפולית חדשנית.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קנוט אליס ולנברג קרן. צוותי כולו של המרכזים החלבון האנושי אטלס ב אופסלה, שטוקהולם והודו הודה על מאמציהם ליצור אטלס החלבון האנושי. המחברים מבקשים להודות במיוחד פרנק Hammar ואת סופי גוסטפסון לעזרה עם תמונות Elené Karlberg על הסיוע בהפקת TMA כאשר מצלמים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
  2. Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
  3. Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
  4. Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
  5. Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
  6. Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
  7. Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
  8. Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas - a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
  9. Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
  10. Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
  11. Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
  12. Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
  13. Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
  14. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
  15. Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. (2010).
  16. UniProt. Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
  17. Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
  18. Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics