CYP2D6 Animal Model: Hvordan å indusere autoimmun hepatitt i Mus

Medicine
 

Summary

Infeksjon av mus med en Adenovirus uttrykker humane autoantigen cytokrom P450 2D6 (hCYP2D6) anerkjent av sera av pasienter som lider av type 2 autoimmun hepatitt resultater i en vedvarende form for autoimmun-mediert leversykdom preget av omfattende hepatitt, fibrose og generering av en CYP2D6 -spesifikk immunrespons.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hintermann, E., Ehser, J., Christen, U. The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3644, doi:10.3791/3644 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Autoimmun hepatitt er en sjelden, men livstruende autoimmun sykdom i leveren av ukjent etiologi 1,2. I de siste mange forsøk har blitt gjort for å generere en dyremodell som reflekterer egenskapene til menneskelig sykdom 3-5. Men i ulike modeller induksjon av sykdommen var ganske komplisert og ofte hepatitt var bare forbigående 3-5. Derfor har vi utviklet en grei mus modell som bruker de store menneskelige autoantigen i type 2 autoimmun hepatitt (AIH-2), nemlig hCYP2D6, som en utløser seks. Type 1 lever-nyre mikrosomale antistoffer (lkm-1) antistoffer som anerkjenner hCYP2D6 er kjennemerket for AIH-2 7,8. Levering av hCYP2D6 inn hvete FVB eller C57BL / 6 mus var av en Adenovirus konstruksjon (Ad-2D6) som sikrer en direkte levering av den utløsende antigen til leveren. Dermed genererer den påfølgende lokal betennelse en fruktbar felt 9 for den videre utviklingen av autoimmunitet. A combination av intravenøs og intraperitoneal injeksjon av Ad-2D6 er den mest effektive veien til indusere en langvarig autoimmun skade på leveren (§ 1). Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan autoimmun leversykdom er indusert i CYP2D6-modellen og hvordan de ulike aspekter av leverskader kan vurderes. Først er serumnivået av markører som indikerer hepatocytter ødeleggelse, slik som leveraminotransferaser, samt titer av hCYP2D6 antistoffer bestemmes ved prøvetaking blod retroorbitaly (§ 2). Deretter får hCYP2D6-spesifikke T-celle respons karakterisert ved å samle lymfocytter fra milten og leveren. For å få rene lever lymfocytter, er leveren perfused av PBS via portvenen (§ 3), fordøyd i kollagen og renset over en Percoll gradient (§ 4). Hyppigheten av hCYP2D6-spesifikke T celler blir analysert ved stimulering med hCYP2D6 peptider og identifisering av IFNγ-produserende celler med flowcytometri (§ 5). Tredje,cellulær infiltrasjon og fibrose bestemmes ved immunhistokjemi av lever seksjoner (§ 6). En slik analyse diett må være gjennomført på flere ganger etter oppstart av sykdommen for å bevise at kronisk art av modellen. Størrelsen på immunresponsen preget av hyppigheten og aktiviteten hCYP2D6-spesifikke T og / eller B celler og graden av leverskade og fibrose må vurderes for en senere evaluering av mulige behandlinger for å forebygge, forsinke eller oppheve den autodestructive Prosessen i leveren.

Protocol

1. Intravenøs injeksjon av Ad-2D6 inn oftalmologiske sinus

  1. Under sterile forhold, fortynne Ad-2D6 virus stamoppløsning til en konsentrasjon på 5 x 10 9 PFU / ml i RPMI og holde Ad-2D6 virus løsning på is. Injeksjon av to doser med 5 x 10 8 PFU (intravenøs og intraperitoneal) har vist seg å resultere i den mest pålitelige resultatet av autoimmun hepatitt hos mus av FVB belastning.
  2. Anesthetize mus med 4% isofluran i en anestesi kammer. Knip den bakbenet å sørge for at dyret er bedøvet.
  3. Hold musen ved nakken og stramme løs hud i hodet med tommelen og langfingeren. Som dette, stikker øyet litt av trekkraft til huden ved siden av øyet.
  4. Plasser nålen vertikalt i mediale canthus (kryss av øyelokk nærmest dyrets nese) og langsomt injisere 100 mL Ad-2D6 virus løsning. Det er viktig å ikke bruke for mye press, for åunngå skade av fartøyene og luftrør.
  5. Sakte trekke nålen for å unngå søl og lukke øyelokkene.
  6. Injeksjon fungert bra dersom viruset løsningen ikke lekker ut gjennom nesen og øyet glir tilbake til sin opprinnelige posisjon.
  7. Umiddelbart etter intravenøs injeksjon, utføre en standard intraperitoneal injeksjon av andre 100 mL av Ad-2D6 virus løsning.

Alternativt kan intravenøs injeksjon utføres via halen blodåre. Imidlertid er injeksjon via oftalmisk sinus mye enklere å utføre og minimerer tapet av virus løsning. Det er vist at disse to teknikkene kan brukes om hverandre og at begge rutene er like effektive 10.

Infiserte mus overvåkes for uønskede effekter og åpenbare tegn på lidelse og smerte, for eksempel tap av matlyst, vekttap, tap av mobilitet, unnlatelse av å stelle, grov pels, som løftetutseende, samt slikking, biting, kloring, eller riste et bestemt område (dvs. injeksjonsstedet). Selv om musene viser en massiv skade på leveren i CYP2D6-modellen, musene virker frisk og viser ingen tegn til lidelse, smerte eller stress. Likevel er indikatorer på alvorlig leversvikt, som for eksempel serum transaminaser fastsettes på en regelmessig basis eller er en del av de utførte eksperimentene. Serum ALAT på> 1000 U / l bør kun vises som en direkte følge av virusinfeksjon, men ikke kronisk. Hvis serum ALAT er kronisk over 1000 U / l (alvorlighetsgrad grense) musene blir ofret.

2. Mus blødning i øyet

  1. Anesthetize mus med 4% isofluran i en anestesi kammer. Knip den bakbenet å sørge for at dyret er bedøvet.
  2. Hold musen ved nakken og stramme løs hud i hodet med tommelen og langfingeren. Som dette, stikker øyet litt avtrekkraften til huden ved siden av øyet.
  3. Plasser tuppen av kapillarrør i nedre eller indre øyekrok og forsiktig, men bestemt skled langs øyeeplet til oftalmisk venøse sinus. Den venøse kapillærer sprekke og den resulterende blødning fyller orbital hulrom.
  4. Litt trekke kapillærrøret å frigjøre spissen slik at akkumulert blodet suges inn i røret.
  5. Når nok blod samles inn, er røret trekkes tilbake og øyelokkene stengt. Blødning stopper ved uttak av røret, og reetablering av normal okulær press på venøse komplekset.
  6. Blod i kapillærrøret overføres til en Microtainer rør og ruges i 30 min på isen.
  7. Den Microtainer røret sentrifugeres ved 7500 xg i 2 min ved 4 ° C.
  8. Supernatanten tilsvarer serum som overføres til en frisk rør og lagres ved -80 ° C.
  9. Serum kan brukes til å bestemme antistoff titer av ELISA. Indicatorer på leverskade som serumnivået av de leverenzymer alaninaminotransferase (ALAT / GPT) og aspartat aminotransferase (ASAT / GOT) kan vurderes ved hjelp av de etter strimlene fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) og en Reflotron Plus analysator ( Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).

Alternativt kan blodprøvetaking gjøres via halen vene eller via overfladiske temporale venen 11.

3. Mus lever perfusjon

Merknad: Dette trinnet er viktig å unngå en forurensning av isolerte lever lymfocytter ved blodlymfocytter

  1. Avlive musen ved dødelige doser av CO 2 etterfulgt av cervical forvridning.
  2. Monter dyret liggende på ryggen på Styrofoam bord. Bruk 23 g nåler til pin ekstremiteter.
  3. Fukte og desinfiser mus med 70% EtOH
  4. Om 1 cm unna bakbena, gjør et snitt gjennomhuden og muskelen laget. Skjær på begge sider av dyret som arbeider opp mot mellomgulvet.
  5. Når membranen er nådd huden kan vippes bakover.
  6. Skjær membranen bort fra de river deretter klippe vena cava.
  7. Flytt magen og tarmene ut til siden, utsette portvenen.
  8. I portvenen innsatsen en 27 G nål koblet til en 5 ml sprøyte fylt med kald PBS. La PBS sakte vaske blodet ut av leveren.
  9. Dissekere leveren ved å ta tak på membran og kutte mellomgulvet vekk fra kroppen.
  10. Overfør leveren til en petriskål og fjerne mellomgulvet, galleblæren og alle andre vev fortsatt er koblet til leveren
  11. Overfør leveren til 10 ml PBS i en 50 ml tube på is eller bygge i oktober sammensatte.

4. Isolering av leveren lymfocytter

  1. Forbered følgende stamløsninger:
    • Collagenase IV lager (100 mg / ml) in PBS. (Lag små alikvoter og oppbevares ved -20 ° C).
    • DNase lager (25 mg / ml) i PBS. (Lag små alikvoter og oppbevares ved -20 ° C).
    • Collagenase buffer: PBS som inneholder 0,2 mg / ml collagenase IV, 0,02 mg / ml DNase og 5% FCS, for en lever, blande 9,5 ml iskald PBS, 20 mL collagenase IV (100 mg / ml lager), 8 mL DNase ( 25 mg / ml lager), og 500 mL Varmeinaktivert FCS.
    • 35% Percoll; mix 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS lager; 305 ml PBS.
    • RPMI komplett = RPMI inneholder 10% varme-inaktiverte FCS, 100 μ / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml streptomycin, 2 mm L-glutamin.
  2. Overfør perfused leveren (se punkt 3) til 10 ml av frisk PBS i en petriskål på is og skåret i små biter med saks.
  3. Overfør til en 70 mikrometer celle sil og klem lever junks gjennom med et glass stampe eller en stampe fra en 2 ml sprøyte. Nøye tilsett 10 ml kald collagenase buffer ogtrykk gjennom sil. Samle fjæring og filter gjennom sil to ganger mer.
  4. Overføring suspensjon til frisk 50 ml tube på is. Behandle neste leveren.
  5. Inkuber lever cellesuspensjonen ved 37 ° C i 60 min, bland forsiktig hvert 15 min.
  6. Sentrifuger ved 30 xg for 3 min ved 4 ° C.
  7. Overfør supernatanten til et friskt tube, og etterlater 5 mm væske over pellet
  8. Sentrifuger ved 650 xg i 10 min ved 4 ° C.
  9. Kast supernatant, etterlot 3 mm ovenfor pellet
  10. Resuspender pellet i 20 ml Percoll buffer
  11. Sentrifuger ved 600 xg i 20 min ved 4 ° C.
  12. Kast supernatanten og resuspender pellet ved å slå røret.
  13. Vask pellet 1 x med PBS.
  14. Vask pellet 1 x med RPMI komplett
  15. Resuspender pellet i 3 ml RPMI fullføre og telle celler i en 1:10 fortynning.
  16. Resuspender celler på ~ 10 7 celler / ml i RPMI fylle ut og overføre rør til is.
  17. 5. Intracellulær cytokin farging (ICC)

    5.1 Stimulering:

    1. Forbered lever lymfocytter ved ~ 10 7 celler / ml i RPMI komplett som beskrevet. Plate 100 mL (10 6 celler) / brønn i et flatt 96-brønn plate som ikke er vev-kultur behandlet.
    2. Legg 50μl RPMI fullføre inneholder 2μg/ml Brefeldin A og deretter legge 50μl RPMI komplett inneholder 2 mg / ml stimulere CYP2D6 peptid (dvs de immunodominant CD4 epitop CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 eller immunodominant CD8 epitop CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Bland ved pipettering.
    3. Inkuber i 5 timer ved 37 ° C (optimal stimulering tid, men over natten inkubasjon fungerer også).

    5.2. Farging:

    1. Forbered følgende stamløsninger:
      • FACS buffer: PBS som inneholder 1% kalvefoster serum (FCS).
      • Fiksering / Permeabilization buffer: FACS buffer som inneholder 0,1% saponin og 4% paraformaldehyde
      • FACS / saponin vaskebuffer: FACS buffer som inneholder 0,1% saponin
      • FACS / PFA buffer: FACS buffer som inneholder 1% paraformaldehyde (PFA)
    2. Overfør cellene inn i V-bunn microtiter plate (96-brønn) og spinne på 460 xg i 3 min ved 4 ° C. Kast medium og virvle plate
    3. Tilsett 150 mL FACS buffer og sentrifuger ved 460 xg i 3 min ved 4 ° C. Kast medium og virvle plate. Gjenta vaske trinn.
    4. Block overflaten FCR om nødvendig (ved bruk av sekundære antistoffer) med en mikrogram / ml αCD16/32 cocktail (FCR blokk) i FACS buffer for 15 min ved 4 ° C og vask 2 x med 150 mL farging buffer (460 xg i 2 min på 4 ° C).
    5. Flekk for overflate molekyler: dvs. Anti-CD8a-FITC MAB 10 mikrogram / ml i 50 mL FACS buffer i 30 min ved 4 ° C i mørket.
    6. Tilsett 100 mL FACSbuffer og spinn ved 460 xg i 3 min ved 4 ° C.
    7. Vask cellene 2 x med 150 mL FACS buffer (460 xg, 3 min, 4 ° C). Vortex plate.
    8. Fiks / permeabilize celler med 100 mL fiksering / permeabilization buffer for 10 min ved RT.
    9. Snurr på 460 xg for 7 min ved 4 ° C. Merk at det er viktig å utvide sentrifugering tid til 7 min, fordi fiksering / permeabilzation skritt endrer den generelle tettheten av cellene. Vortex plate.
    10. Vask 2 x med 150 mL FACS / saponin vaskebuffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plate.
    11. Flekk for intracellulære molekyler: dvs. Anti-IFNγ-PE MAB 10 mikrogram / ml i 50 mL FACS / saponin vaskebuffer i 30 min ved 4 ° C.
    12. Tilsett 100 mL FACS / saponin vaskebuffer og sentrifuger ved 460 xg for 7 min ved 4 ° C.
    13. Vask cellene 2 x med 150 mL FACS / saponin vaskebuffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plate.
    14. Vask celler 1 x med FACS buffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plate. Resuspender celler i 200 mL FACS / PFA buffer, overføring til rør, og oppbevar ved 4 ° C i mørke før oppkjøpet av data ved flowcytometri. Vi bruker vanligvis en FACSCanto II eller en FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland).

    6. Immunhistokjemi

    6.1. H & E farging for vurdering av generell lever patologi:

    1. Innhøstingen leveren, senkes i Tissue-Tek oktober i en disponibel basen mugg og rask frostvæske på tørris.
    2. Skjær 7 mikrometer levervev seksjoner ved hjelp av en Leica cryostat innstilt på -17 ° C og montere vevsdelene på Superfrost Plus objektglass. Store lysbilder ved -20 ° C til videre bruk.
    3. Fiks cryosections i pre-avkjølte EtOH for 15 minutter ved -20 ° C. La tørke i 10 min.
    4. Vask 2 x i destillert vann i 2 min ved romtemperatur (følgende trinn, 6.1.5 - 6.1.13, utføres ved romtemperatur).
    5. Flekk i Meyers Hematoxylin løsning for8 min.
    6. Vask i varmt (30 ° C) vann fra springen i 10 min. Skift vannet flere ganger.
    7. Skyll i destillert vann.
    8. Skyll i 95% EtOH for 20 sek.
    9. Counterstain i eosin G / Y løsning for 40 sek.
    10. Dehydrere 2 x i 95% EtOH for 5 min per inkubering.
    11. Dehydrere 2 x i 100% EtOH for 5 min per inkubering.
    12. Fjern i xylen 2 x 5 min per clearing.
    13. Monter i Roti-Histokitt.

    6.2. Immunhistokjemi for kollagen I deponering:

    1. Innhøstingen leveren, fordype seg i Tissue-Tek oktober i en disponibel basen mugg og rask frostvæske på tørris.
    2. Skjær 7 mikrometer levervev seksjoner ved hjelp av en Leica cryostat innstilt på -17 ° C og montere vevsdelene på Superfrost Plus objektglass. Store lysbilder ved -20 ° C til videre bruk.
    3. Fastsette cryosections i kaldt EtOH for 15 minutter ved -20 ° C. La tørke i 10 min.
    4. Vask 2 x i PBS for 2 min ved romtemperatur.
    5. <li> Inkuber i PBS som inneholder 0,3% H 2 O 2 og 0,1% Na-azide i 10 min ved romtemperatur.
    6. Vask 2 x i PBS for 2 min ved romtemperatur.
    7. Blokker med en avidin-biotin blokkere kit henhold til produsentens retningslinjer.
    8. Blokker med 10% FCS i PBS (FCS / PBS) i 30 min ved romtemperatur.
    9. Den primære antistoffet er en kanin anti-mus kollagen jeg antistoff som er fortynnet 1:200 i 10% FCS / PBS. Inkuber seksjoner med primær antistoff i 2 timer ved romtemperatur.
    10. Vask seksjoner 3 x i PBS for 4 minutter ved romtemperatur.
    11. Fortynn biotinylated anti-kanin antistoff til 1:500 og inkuber med seksjonene for 1,5 time i romtemperatur.
    12. Vask seksjoner 3 x i PBS for 4 minutter ved romtemperatur.
    13. Color reaksjon oppnås ved sekvensiell inkubasjon med avidin-peroksidase konjugat og diaminobenzidine-hydrogen peroxide i henhold til produsentens retningslinjer.
    14. Counterstain i Meyers Hanmatoxylin løsning for 5 min, vaske 2 x i PBS for 2 min ved romtemperatur og montere i Aquatex.

    7. Representative Resultater

    Infeksjon av mus med Ad-2D6 indusert to distinkte stadier av leverskader. I de første dagene etter smitte, fører virusinfeksjon i leveren en akutt økning av serum aminotransferase nivåer, en indikator på hepatocytter død 6. Denne første, akutte fasen oppstår uavhengig av uttrykk for hCYP2D6 og kan også observeres etter infeksjon med en tom kontroll virus (Ad-Control) eller et virus som uttrykker grønn fluorescens protein (Ad-GFP). I motsetning er det andre stadiet autoimmune-mediert og avhengig uttrykk for den utløsende molekylet hCYP2D6. Denne autoimmune stadiet inntreffer innen 2-4 uker etter smitte og vedvarer i flere måneder 6.

    Figur 1

    <p class = "jove_content"> Figur 1. CYP2D6-modellen. Hvete FVB eller C57BL / 6 mus injisert med to doser av Ad-2D6 (intravenøs og intraperitonealt). I en tid av interesse leveren og serum samles og vurderes for leverskader og dannelse av hCYP2D6-spesifikke antistoffer og T-celler.

    Følgende funksjoner er karakteristisk for den vedvarende autoimmun hepatitt utvikler etter Ad-2D6-infeksjon av hvete FVB eller C57BL / 6 mus i CYP2D6-modellen: For det første viser leveren en abnormt forandret morfologi. Spesielt er leveren lobes smeltet, hyperplasic knuter vises spredt over hele leveren og en massiv capsular fibrose er synlig (figur 2).

    Figur 2

    Figur 2. Liver morfologi. Typisk Ad-2D6-indusert leverskade som oppdaget i uke 4 post-infeksjon. Merk at enkelte lever lobes blandes (pilspisser). Hyperplasic knuter vises spredt over hele leveren (piler). Infeksjon med en kontroll adenovirus ikke uttrykke hCYP2D6 har ingen effekt på leveren morfologi.

    Second, omfattende og vedvarende cellulære infiltrasjoner vises i peri-portal og parenkymceller regioner av leveren hos Ad-2D6-infiserte, men ikke Ad-Control-infiserte mus (figur 3A). Fibrose utvikler hovedsakelig subkapsulær regionen med noen kollagen bunter stikker inn i parenchyma (figur 3B).

    Figur 3


    Figur 3. Liver histologi A:. H & E farging av levervev delen av FVB mus infisert med enten Ad-kontroll eller Ad-2D6 ved uke 4 post-infeksjon. Merk at betydelige infiltrasjoner av mononukleære celler er bare til stede i Ad-2D6 infiserte mus (enkle pilene). Triple piler indikerer større mobilnettet infiltrasjoner i leveren parenchyma brokobling mellom naboland portal traktater. B: Immunhistokjemisk representasjon av leverfibrose ved uke 4 etter infeksjon med Ad-2D6 eller Ad-kontroll. De lever seksjoner har blitt farget for kollagen hjelp av en anti-kollagen jeg antistoff. Merk flere lag med kollagen disposisjon under leveren kapsel (trippel piler) med noen bunter stikker inn i parenchyma (single piler) og tilstedeværelsen av store klynger av infiltrere celler (pilspisser). To representative lever seksjoner vises for hver tilstand. Størrelse barer: 100μm.

    Et tredje trekk er den generasjonen av høye titer av anti-CYP2D6 antistoffer, som har en lignende epitop spesifisitet til menneskelige lkm-1 antistoffer 6,13. Sist, hCYP2D6-spesifikke CD4 og CD8 T-celler er generert som hovedsakelig hjem til leveren. Slike hCYP2D6-spesifikke T-celler kan påvises ved stimulering med immunodomiNant hCYP2D6 peptider og påfølgende måling av IFNγ uttrykk ved en intracellulær cytokin farging (ICC) (figur 4). hCYP2D6-spesifikke CD8 T-celler dreper Ad-2D6-infiserte målceller in vivo 12.

    Figur 4

    Figur 4. hCYP2D6-spesifikke T celler. flowcytometrisk analyse av hCYP2D6-spesifikke T-celler. Liver-lymfocytter har vært isolert i uke 4 etter Ad-2D6-infeksjon og ble stimulert med enten immunodominant CD4 eller CD8 hCYP2D6 epitop natten. Generering av IFNγ ble oppdaget av intracellulær cytokin farging og analysert ved flowcytometri bruke en FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Andelen hCYP2D6-spesifikke CD4 og CD8 celler er indisert.

Discussion

I tidligere studier, ble eksperimentelt hepatitt ofte rapportert å være bare forbigående og mange aktuelle modeller for autoimmun leversykdom bero på en ganske kompleks sykdom induksjon protokoller (for vurderinger se 3,5). For eksempel flere modeller bruker transgene mus som uttrykker bestemte geografiske antigener og adoptively overført mål antigen-spesifikke, for det meste TCR-transgene, T celler 14,15. Ofte en ekstra infeksjon med livertropic virus, bakterier eller parasitter er nødvendig for å indusere sykdom 16-18. Alternativt er DNA-vaksinering med plasmider som koder for målet antigener, herunder CYP2D6 19, brukes til å indusere hepatitt. Men en ekstra vaksinering med plasmider som koder for pro-inflammatoriske cytokiner, som IL-12, kreves 20. Dessverre, med noen få unntak 15,20 hepatitt er bare forbigående.

CYP2D6-modellen 6,21 bruker en grei metode to indusere autoimmun hepatitt ved å infisere mus med en Adenovirus uttrykker hCYP2D6, den store autoantigen i AIH-2 7,8. Levering av CYP2D6 ved en adenovirus konstruksjon garanterer både en direkte målretting av leveren samt en lokal betennelse som fremmer nedbrytningen av toleranse. Det er viktig å merke seg at både virus titer samt tilførselsvei er avgjørende for denne modellen. På den ene siden, er Ad-2D6 en replikering mangelfull virus, og dermed en tilstrekkelig høy titer av virus er nødvendig for å generere en kritisk mengde antigen i leveren. På den annen side kan en for høy titer resultere i en fatal akutt leversvikt. I tillegg har det blitt vist tidligere at smitte av mus med høye titer av adenovirus fører til en funksjonell utmattelse av immunrespons 22. I vår modell har vi brukt en kombinasjon av intravenøs og intraperitoneal smitte for å oppnå både kroniske cellulær infiltrasjon, samt utvensive fibrose. Vi har observert at intravenøs infeksjon alene fortsatt forårsaker massive mobilnettet infiltrasjon, men ingen fibrose av subkapsulær regionen, noe som indikerer at peritoneal betennelse på grunn av intraperitoneal injeksjon kan være involvert i den kontinuerlige subkapsulær akkumulering av kollagen (Hintermann & Christen, manuskript under utarbeidelse). Det er imidlertid viktig å merke seg at den observerte leverfibrose er antigen-spesifikk, siden vi ikke påvise aktivering av hepatiske stellate celler og kollagen deponering etter smitte med like virus-titer av Ad-GFP eller Ad-Control 23.

CYP2D6-modellen gjenspeiler mange aspekter ved menneskelig AIH 1,2, som kronisk hepatitt karakteriseres av vedvarende cellulære infiltrasjon og leverfibrose 6. I tillegg indikerer tilstedeværelse av høy-titer anti-CYP2D6 antistoffer med lignende epitop spesifisitet og spredning 13 til lkm-1 antistoffer funnet i AIH-2 pasienter presans for en felles kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 er den viktigste antigenet i AIH-2, men det blir ikke gjenkjent av pasienter diagnostisert med hyppigere type 1 AIH. I tillegg har pasienter som lider av andre leversykdommer med autoimmun etiologi, slik som primær biliær cirrhose (PBC) eller primær skleroserende kolangitt (PSC), genererer typiske autoantistoffer med spesifisitet til distinkte lever autoantigens og deres lever viser ulike patologiske funksjoner sentreringskontrollene på små (PBC ) eller store (PSC) gallegangene. Likevel tilbyr CYP2D6 modellene muligheten til å analysere immunopathogenic mekanismene som er involvert i kronisk nedsatt inflammatoriske prosesser som oppstår i løpet av autoimmune leversykdommer, for å identifisere viktige aktører som driver autoimmun ødeleggelse av hepatocytter og å vurdere mulige terapeutiske intervensjoner for å kurere sykdommen.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av Goethe Universitetssykehuset Frankfurt og et tilskudd på den tyske Research Foundation til UC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G needle BD Biosciences 300800
27½G needle VWR international 612-0151
30½ G needle BD Biosciences 304000
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) Roche Group 10 745 138 202
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) Roche Group 10 745 120 202
Anaesthesia Unit Univentor 400 AgnTho’s
Base molds, disposable 37x24x10 mm VWR international 720-0208
Cell strainer 70mm VWR international 734-0003
Cryostat Leica Microsystems CM1850 UV
Heparinized capillary tubes Fisher Scientific 3123987
Microscope slides Superfrost Plus Menzel-Glaser J1800AMNZ
Microtainer SST tubes BD Biosciences 365951
Microtiter plates, V-bottom VWR international 391-1924
Reflotron Plus Roche Group Determiniation of serum AST / ALT
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, Chemicon International AB765P
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories VC-BA-1000-MC15
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody SouthernBiotech 1550-02
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody BD Biosciences 554412
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) BD Biosciences 553141
Aquatex VWR international 1.08562.0050
Avidin/Biotin Blocking kit Vector Laboratories VC-SP-2001-KI01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B6542
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138-100MG
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine Vector Laboratories VC-SK-4100-KI01
DNase Sigma-Aldrich DN-25
Elite ABC Reagent Vector Laboratories VC-PK-7100-L050
Eosin G/Y solution Carl Roth Gmbh X883.1
Fetal calf serum (FCS) Biochrom AG S 0115
Isofluran Forene B506
Meyer’s Hematoxylin solution AppliChem A4840,1000
OCT Compound Sakura Finetek 4583
PBS-buffered formaldehyde 10% Carl Roth Gmbh A146.3
Percoll Amersham 17-0891-01
Roti-Histokit Carl Roth Gmbh 6638.1
RPMI Invitrogen 61870
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
  2. Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
  3. Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
  4. Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
  5. Czaja, A. J. Animal models of autoimmune hepatitis. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).
  6. Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
  7. Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
  8. Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
  9. von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
  10. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).
  11. Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
  12. Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. Forthcoming (2011).
  13. Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. Forthcoming (2011).
  14. Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
  15. Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
  16. Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
  17. Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
  18. Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
  19. Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
  20. Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
  21. Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
  22. Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
  23. Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics