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जीन द्वारा विकास माउस भीतरी कान पर स्थानांतरण

Neuroscience

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Summary

माउस भीतरी कान एक placode - व्युत्पन्न संवेदी अंग है जिसका विकास कार्यक्रम हमल के दौरान सविस्तार है. हम एक परिभाषित

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Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Ventral Laparotomy

  1. चतनाशून्य करना सोडियम pentobarbital संवेदनाहारी समाधान (7.5 ग्राम शरीर के वजन के प्रति μL) की intraperitoneal इंजेक्शन के द्वारा, एक बांध जिसका भ्रूण को भ्रूण 11.5 दिन (दिन एक योनि प्लग का पता चला है पर दोपहर भ्रूण विकास के 0.5 दिन है E11.5) में हैं. संवेदनाहारी समाधान कार्य, पूर्ण इथेनॉल 100 μL, 65 मिलीग्राम / एमएल जलीय मैग्नीशियम सल्फेट (गर्भाशय स्वर modulates) के 320 μL, 50 मिलीग्राम / एमएल pentobarbital सोडियम समाधान के 180 μL और propylene glycol की 400 μL (वाहन साथ मिश्रणीय के जलीय और जैविक ) घटकों.
  2. हानिकारक उत्तेजनाओं के परीक्षण द्वारा आयोजित संज्ञाहरण की पूर्णता का आकलन: पंजा निचोड़, पूंछ चुटकी, पलक और गाल और vibrissae स्पर्श करने के लिए प्रतिक्रिया. Corneas के लिए बाँझ नेत्र मरहम लागू होते हैं.
  3. दाढ़ी suprapubic क्षेत्र से कैंची के साथ रिब पिंजरे और एक ठीक ब्लेड (Oster ब्लेड 40) पेट फर. 70% इथेनॉल के साथ पेट, 10% povidone आयोडीन Betadine () के, एक कीटाणुरहित करनाएन डी 70% इथेनॉल क्रमिक रूप से,. जगह पेट साइड नीचे एक बाँझ कपड़ा पर माउस और फिर एक हीटिंग पैड या 2-5 मिनट के लिए गर्म प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) पर सेट है.
  4. गेंद इत्तला दे दी कैंची के साथ उदर midline में पेट की त्वचा को काटकर अलग कर देना. 10-14 मिमी के लिए चीरा बढ़ाएँ. Linea अल्बा, एक avascular, सफेद पेट की दीवार के उदर midline के साथ संयोजी ऊतक बैंड को पहचानें. Linea अल्बा काटकर अलग कर देना है साथ गेंद कैंची इत्तला दे दी और चीरा 10-14 मिमी विस्तार. तुरंत prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) lactated घंटी समाधान के साथ पेट की सिंचाई.
  5. आरोपण साइटों पर अत्यधिक दबाव लागू करने बिना अंगूठी संदंश के साथ गर्भाशय के दो सींग बाह्यरूप प्रदान करना. Prewarmed, lactated घंटी समाधान के साथ externalized गर्भाशय सींग सींचना.

2. Transuterine Microinjection

  1. 12-16 μ: एक मोटी दीवारों, निम्नलिखित विशेषताओं के साथ borosilicate ग्लास केशिका microinjection विंदुक बनानामीटर बाहरी व्यास और एक 20 डिग्री के उठाव. , दबाव = 200; वेग = 46; = 0 खींच समय = 100) = रैंप परीक्षण प्लस 3 इकाइयों गर्मी: Sutter पी 97 छोटे से बॉक्स रेशा के साथ विंदुक डांड़ी पर, निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करें. इस Sutter beveler BV-10 के साथ, बड़े व्यास pipettes के लिए 104C (सोना) अपघर्षक डिस्क का उपयोग करें. Resuspend 3-4 / कैल्शियम मुक्त फॉस्फेट में μg μL प्लाज्मिड अभिव्यक्ति खारा बफर (7.2-7.4 पीएच). केंद्रित डीएनए भंवर, क्रिस्टलीय तेजी से हरे रंग धीरे 30 सेकंड के लिए, जोड़ें और 10 सेकंड के लिए 10,000 जी पर स्पिन. empirically का तेजी से हरे रंग नेत्रहीन इंजेक्शन की प्रभावकारिता को ट्रैक करने के लिए आवश्यक न्यूनतम राशि निर्धारित की जाती है. डीएनए / तेजी से हरी समाधान के साथ beveled विंदुक backfill. दबाव सुई लगानेवाला (> 99% स्रोत गैस के रूप में शुद्ध नाइट्रोजन का उपयोग Picospritzer) विंदुक धारक लोड microinjection विंदुक कनेक्ट.
  2. कम तीव्रता, हलोजन प्रकाश अपने आरोपण साइट के भीतर भ्रूण कल्पना के साथ गर्भाशय Transilluminate. BEA के पहचानेंting दिल, मस्तिष्क vesicles, अंग कलियों, नवजात 4 hindbrain की वें निलय, और आंख. गर्भाशय prewarmed साथ हर 2 मिनट, घंटी जलयोजन बनाए रखने के समाधान lactated सींचना. भ्रूण को नई दिशा और संरचनात्मक स्थलों की पहचान से ऊपर उल्लेख किया गर्भाशय पर सौम्य दबाव लागू करें.
  3. ओरिएंट करने के लिए प्राथमिक सिर नस पूर्वकाल और कूल्हों शाखाओं जिसका पार्श्व mesenchymal क्षेत्र में जो otocyst रहता पहचान भ्रूण. उचित otocyst गर्भाशय की transillumination द्वारा नहीं देखा जा सकता है. otocyst प्राथमिक सिर नस है, जो नस का मुख्य ट्रंक के साथ, एक अमेरिकी फुटबॉल के मैदान पर या बबूल के गोलपोस्ट के आकार के रूप में की पूर्वकाल और कूल्हों शाखाओं के बीच रास्ते के मध्य में स्थित है. otocyst बबूल के बीच रास्ते के मध्य में है.
  4. प्रकल्पित स्थान otocyst के साथ लाइन में एक प्रक्षेपवक्र में गर्भाशय के माध्यम से इंजेक्शन विंदुक डालें. Microinjector uter के माध्यम से गुजर जाने के बाद एक बार नब्जहमें दरियाफ्त डाई और विंदुक टिप की अनुमानित स्थान कल्पना करने के लिए. अग्रिम सुक्ष्ममापी नियंत्रण के तहत विंदुक और फिर नब्ज को गहराई का आकलन. आगे पार्श्व सिर mesenchyme और नाड़ी में पिपेट बार बार अग्रिम. सफल otocyst लक्ष्यीकरण अन्त: कर्णोदकीय पीछे की ओर वाहिनी और बरोठा की एक प्रकार की सीप खोल आकार का पतला आकार में प्रकट होगा. गर्भाशय पर दबाव रिलीज करने के लिए, भ्रूण / गर्भाशय से एक प्रस्ताव में पिपेट, हटाने और तुरंत prewarmed साथ गर्भाशय की सिंचाई, घंटी समाधान lactated.

3. Vivo electroporation में

  1. Lactated घंटी समाधान के साथ गर्भाशय सींचना. हौसले से लागू lactated है घंटी समाधान विद्युत चप्पू - शैली इलेक्ट्रोड जोड़े को गर्भाशय के लिए आवश्यक है. Lactated घंटी के साथ इलेक्ट्रोड के टंगस्टन सतहों गीला. इलेक्ट्रोड के पथ में इंजेक्शन otocyst केंद्र. धीरे electroporation देहात के साथ गर्भाशय सेकddles. कैथोड में गर्भाशय से इंजेक्शन otocyst और anode के आसन्न uninjected otocyst करने के लिए गर्भाशय की दीवार के साथ संपर्क में है पार्श्व दीवार के साथ संपर्क में है. पैर पेडल electroporator पर स्विच के साथ एक वर्ग तरंग पल्स ट्रेन ट्रिगर. Electroporation मापदंडों हैं: 5, नाड़ी प्रति 43 वोल्ट और एक 950 मिसे interpulse है देरी पर 50 मिसे दालों. गर्भाशय तुरंत सिंचाई के बाद पल्स ट्रेन को जन्म दिया है. रिकार्ड 60-100 mAmps कान का उपकला progenitors transfect करने के लिए पर्याप्त मौजूदा: ऊतक के लिए दिया है. इंजेक्षन और 4-6, बांध प्रति E11.5 भ्रूण electroporate.
  2. उन भ्रूण के 4 वें निलय जिसका भीतरी कान हैं में एक दूसरे, जलीय फ्लोरोसेंट dextran (एलेक्सा 488 Fluor है प्लाज्मिड अभिव्यक्ति एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एलेक्स Fluor 594 एन्कोड अगर प्लाज्मिड अभिव्यक्ति एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन encodes) की स्वतंत्र transuterine microinjection प्रदर्शन करना सही इंजेक्शन और नाड़ी प्रति कम से कम 60 वर्तमान की mAmps डे थाelectroporation दौरान जोशीला. फ्लोरोसेंट dextran hindbrain में जन्म के समय detectable और होगा पिल्ले जिसका भीतरी कान embryogenesis दौरान छेड़छाड़ (3.5 देखें) का चयन सक्षम.
  3. Lactated घंटी के साथ गर्भाशय सींग सींचना. उदर गुहा में गर्भाशय सींग Reinsert. गर्भाशय गुहा prewarmed, lactated घंटी समाधान के 2-4 एमएल के साथ फ्लश और अतिप्रवाह बाहर बाँझ कपड़ा पर चीरा साइट के निकास के लिए अनुमति देते हैं. सूखी, बाँझ सामग्री के साथ draping बदलें. सिवनी सुई गैर काटने और एक 6-0 resorbable सीवन के साथ पेट की दीवार. हम एक चल रहे सिलाई पसंद करते हैं, हर दूसरे सिलाई दोनों पेट की दीवार और त्वचा के लिए, ताला लगा है.
  4. सूखी बांधों फर और चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा Meloxicam के रूप में एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ प्रशासन. Prewarmed वसूली पिंजरे में एक बाँझ कपड़ा बांध लौटें. मॉनिटर और बांधों respirations, चीरा साइट ज़ाहिरता, खूनी निर्वहन के लिए और योनि रिकॉर्ड. खून बह रहा आर ए हैकर रहे हैं लेकिन वर्तमान और बेरोकटोक अगर बांध euthanize, जबकि वह अभी भी संज्ञाहरण के तहत है. समय नोट वह चेतना और प्रयास करने के लिए ambulate आएगा. माउस कॉलोनी बांध लौटें जब वह खाने और पीने के लक्षण दिखाता है और घोंसला निर्माण शुरू कर दिया. आमतौर पर, यह 12 घंटे के भीतर होता है.
  5. जन्म के समय (0 दिन प्रसव के बाद), फ्लैश कूड़े में प्रत्येक पिल्ला फ्लोरोसेंट एक stereofluorescence विदारक माइक्रोस्कोप एक GFP या टेक्सास रेड फिल्टर के साथ में का उपयोग कर dextran का पता लगाने के hindbrain क्षेत्र के रूप में उपयुक्त सेट. स्तनपान कराने वाली केवल उन बांध पिल्ले कि hindbrain लेबलिंग प्रदर्शित करने के लिए लौटें.

4. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
आकृति 1. Electroporation की मध्यस्थता जीन के विकास कोक्लीअ के लिए स्थानांतरण E11.5 otocyst. एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एन्कोडिंग बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था (नाड़ी टीआरएमापदंडों में: पांच, 50 मिसे / नाड़ी और 950 मिसे interpulse है देरी) में 43 वाल्ट दालों. एक) प्रसव के बाद छह दिन (P6) पिल्ला, जिसका otocyst किया गया था इंजेक्शन और electroporated है E11.5 आधार से कोक्लीअ के बीच बारी के माध्यम से EGFP अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से एक प्रतिनिधि भीतरी कान. कोक्लीअ की पार्श्व दीवार के बीच बारी और सुप्रीम केवल से हटा दिया गया था. E11.5 progenitors कि सुप्रीम को जन्म दे नहीं में ट्रांसफ़ेक्ट गया. बी) पूरे के कोक्लीअ का Immunostaining माउंट () एक बाल सेल मार्कर के साथ, मायोसिन (Myo7a) 7a, इंगित करता है कि EGFP अभिव्यक्ति Corti के अंग के प्रक्षेपवक्र प्रकार है और निहायत बाल सेल असर संवेदी उपकला स्थानीय. सी) E18.5 भ्रूण otocyst जिसका इंजेक्शन और E11.5 पर electroporated से एक प्रतिनिधि भीतरी कान. लेजर confocal प्रक्षेपण Myo7a सकारात्मक संवेदी बालों की कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति को दर्शाता है. Corti की E18.5 अंग EGFP expressio का संकेत से डी) लेजर कर्णावत संवेदी उपकला की confocal प्रक्षेपणn आंतरिक बालों की कोशिकाओं में (आईएचसी), बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC), भीतर हाथ - पाँव की अँगुलियों की बारिक हड्डी संबंधी कोशिकाओं (आईपीसी), स्तंभ कोशिकाओं (पीसी), और Deiters की कोशिकाओं (डीसी). (बी) में पैमाने पर पट्टी (ए) के लिए लागू होता है.

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Discussion

जीन के विकास माउस भीतरी कान करने के लिए हस्तांतरण है: माउस भीतरी कान 12,13 विकास postimplantation के पहले सप्ताह के दौरान कान का placode से विकसित. भ्रूण 9.5 दिन (E9.5) के द्वारा है, placode invaginated है और एक तरल पदार्थ से भरे दो otocyst बुलाया पुटिका में morphed है. पुटिका में कान का व्यापारियों परिपक्व भीतरी कान के भीतर संवेदी और nonsensory कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में न्यूरॉन्स कि vestibular और श्रवण संवेदी epithelia में यंत्रवत् संवेदनशील बालों की कोशिकाओं के अंदर आना को जन्म दे. देर से भ्रूण चरणों के द्वारा जटिल है, भीतरी कान की झिल्लीदार भूलभुलैया की आकारिकी 3 आयामी 3,12 स्थापित है. लाभ और हानि के समारोह प्रयोगात्मक तौर तरीकों आमतौर पर माउस transgenesis द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं सेल भाग्य विनिर्देश और पैटर्न के गठन के रूप में विकास की प्रक्रिया की आनुवंशिक विनियमन में जानकारी पाने के लिए. विकासशील माउस भीतरी कान की गतिशील आनुवंशिक हेरफेर मेंutero लिए माउस transgenesis एक मानार्थ दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है कि माउस प्रयोगात्मक भ्रूणविज्ञान 6,11 के साथ जीन स्थानांतरण तकनीक जोड़े.

वायरस और electroporation की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण तकनीक के विकास भीतरी कान 6,11,14,15 में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए विकसित किया गया है. एडिनो से जुड़े वायरल vectors (AAV) कान का progenitors कि संवेदी और nonsensory सेल प्रकार को जन्म दे और माउस बाल 16 कोशिकाओं में कैल्शियम पर निर्भर exocytosis के आणविक आधार पूछताछ इस्तेमाल किया गया है संक्रमित. AAV वैक्टर उच्च titers है कि अंदरूनी कान में व्यापक अभिव्यक्ति सक्षम करने और विभिन्न वायरल सीरमप्रकारों अद्वितीय tropism है कि अंतर सेलुलर अभिव्यक्ति के लिए फायदेमंद हो सकता है प्रदर्शित. नुकसान एक निश्चित भराई क्षमता है कि जीन कि misexpressed किया जा सकता है और virological विशेषज्ञता बनाने के लिए, शुद्ध, और वायरस titer के लिए आवश्यकता के आकार की सीमा में शामिल हैं. Electroporation की मध्यस्थता जीन transfer 6 vivo में संवेदी बाल सेल भाग्य निर्दिष्ट में एक बुनियादी हेलिक्स पाश - हेलिक्स प्रतिलेखन कारक की भूमिका का मूल्यांकन किया गया है. अभिव्यक्ति प्लास्मिड गेटवे subcloning प्रौद्योगिकी के लिए अनुकूलित अद्वितीय प्रमोटरों एक जीन के ब्याज और एक IRES 17 अनुक्रम से एक मार्कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग साथ वैक्टर तेजी से और कुशल निर्माण की अनुमति है. ब्याज की जीन electroporation और अभिव्यक्ति के 24 घंटे के भीतर प्रसव के बाद का इस्तेमाल प्रवर्तक पर निर्भर करता है भीतरी कान में कान व्यापारियों में व्यक्त किया जा सकता है बच सकते हैं. प्लाज्मिड निर्माण, शोधन, एकाग्रता, और quantitation केवल मानक आणविक जैविक कौशल की आवश्यकता होती है. नुकसान में शामिल है ~ 8kb ऊपर प्लास्मिड का आकार बढ़ता है और भ्रूण मारक की एक उच्च दर सबसे वायरल vectors की तुलना के रूप में vivo अभिकर्मक दक्षता में कमी हुई. दोनों electroporation और वायरस की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण तकनीक माउस प्रयोगात्मक embryological तकनीक के स्वामित्व की आवश्यकताniques: अस्तित्व सर्जरी, भ्रूण के utero हेरफेर, और transuterine microinjection में. इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए डिजिटल वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक महत्वपूर्ण methodological कदम के प्रदर्शन के बाद के मुद्दे के समाधान है.

वीडियो पर methodological नोट्स: हम जानबूझकर बाँझ क्षेत्र के साथ चीरा साइट कपड़ा नहीं चुना जबकि फिल्माने ताकि दर्शक बांध, यानी, सिर (जानबूझकर अधिकांश में धुंधला के सकल शरीर रचना के संबंध में उदर midline की स्थिति देख सकता है फ्रेम लेकिन पहचानने योग्य), अंगों, और पूंछ. चीरा साइट draping प्रभावी ढंग से इस दृश्य को ब्लॉक कर देता है और उदर laparotomy और एक इंजेक्शन अनुक्रम के दौरान स्थानिक प्रासंगिक शारीरिक संबंधों की सराहना करने के प्रयासों को उलझाना कर सकते हैं. हालांकि, हम बांध का पेट इतना है कि एक बाँझ क्षेत्र पर externalized गर्भाशय सींग बाकी draping शल्य अपूतिता बनाए रखने के लिए सलाह देते हैं. इसके अलावा, हम जान - बूझकर राक्षसों के लिए प्रयास नहीं कियापेट की दीवार और त्वचा में शल्य चीरों के suturing trate क्योंकि इन तरीकों एक पशुचिकित्सा या योग्य शल्य चिकित्सा तकनीशियन के विशेषज्ञ मार्गदर्शन के द्वारा सीखा जाना चाहिए. डा. मार्सेल पेर्रेट जेंटिल (सैन एंटोनियो में टेक्सास विश्वविद्यालय), मैं इस विषय के एक उत्कृष्ट चर्चा, सचित्र प्रतिनिधित्व के साथ पूरा प्रस्तुत करता है, अपनी थिसिस में, "पशु चिकित्सा suturing के सिद्धांतों" 18

प्रक्रियात्मक सिफारिशों जीन हस्तांतरण विकासशील माउस भीतरी कान तकनीकी चुनौती दे रहा है. सर्वोत्तम प्रथाओं की एक श्रृंखला है कि परिवर्तनशीलता का एक पर्याप्त राशि को खत्म करने और सफल परिणाम सुनिश्चित कर रहे हैं. हम नीचे विशिष्ट सिफारिशें करने के लिए इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सीखने की सुविधा.

पशु चिकित्सा स्टाफ से परामर्श करने के लिए माउस अस्तित्व सर्जरी जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल विकसित: स्तनधारी अस्तित्व सर्जरी के लिए जानवरों की देखभाल के प्रोटोकॉल के लिए उत्पादन की मांग की है के बाद सेसंज्ञाहरण, पीड़ानाश,, और perioperative की देखभाल और परिभाषित किया जाना चाहिए और समन्वय किया. जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल सहित विकास, भाषा है कि एक आवेदक के प्रोटोकॉल की कोर फार्म का हो सकता है, की एक विस्तृत चर्चा पूरक जानकारी ("देखने के रूप में प्रदान की जाती है पशु की देखभाल प्रोटोकॉल विकास "). इसके अलावा, अपने घर संस्थानों पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और पशु चिकित्सा स्टाफ निस्संदेह एक उपयुक्त प्रोटोकॉल के निर्माण पर अनुरोध पर अतिरिक्त मार्गदर्शन प्रदान करेगा.

Utero जीन स्थानांतरण में के लिए एक समर्पित माउस अस्तित्व शल्य चिकित्सा क्षेत्र की स्थापना: ventral laparotomy एक बड़ी सर्जरी के रूप में वर्गीकृत है क्योंकि यह एक शरीर गुहा समझौता है. हाल IACUCs एक बाँझ, प्रमुख माउस अस्तित्व सर्जरी के लिए श्रेणी के 100 पर्यावरण की आवश्यकता नहीं होगी. बल्कि, एक समर्पित क्षेत्र है कि समुचित प्रकाश व्यवस्था, venti शामिलआबादी, पूरक, हीटिंग, और कठिन के गैर झरझरा, disinfectable है सतहों की संभावना की आवश्यकता होगी. हम एक क्षैतिज लामिना का प्रवाह हुड कि संक्रमण से माउस की सुरक्षा करता है, शारीरिक तनाव कम कर देता है में हमारे अस्तित्व सर्जरी आचरण, और इस तरह सुविधाओं के पश्चात की वसूली के लिए पसंद करते हैं. बेंच शीर्ष कटआउट के साथ recessed और बिजली के आउटलेट, विस्तारित शक्ति जीन स्थानांतरण उपकरणों के लिए विद्युत circuitry, हम कस्टम संशोधनों की एक श्रृंखला एक दोलन - अवमन्दित, क्षैतिज लामिना का प्रवाह (Envirco वामो 630) हुड कि दिशात्मक, कम वाट क्षमता हलोजन ट्रैक प्रकाश शामिल करने के लिए परिभाषित किया है गर्भनाल पारित होने के लिए. इन संशोधनों की एक विस्तृत योजनाबद्ध पूरक जानकारी ("देखने के रूप में प्रदान की जाती है utero जीन स्थानांतरण लैिमनार फ्लो हूड "). आपके IACUC से परामर्श के रूप में आप अपने जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक उपयुक्त स्थान है कि विशेष रूप से माउस सु के लिए समर्पित है परिभाषितसर्जरी rvival.

सोडियम pentobarbital संज्ञाहरण के प्रशासन से पहले निकटतम 0.1 ग्राम का बांध वजन: pentobarbital सोडियम एक प्रभावी चतनाशून्य करनेवाली औषधि है और काम कर समय की 105 मिनट कम से कम प्रदान करते हैं जब dosing अनुसूची की सिफारिश का पालन किया जाता है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि मिश्रण की खुराक की गणना करने के लिए इंजेक्षन करने से पहले प्रत्येक बांध के लिए एक सही शरीर के वजन का निर्धारण करते हैं. बांध शरीर के वजन का अनुमान है. एलर्जी सिरिंज ट्रे और Becton Dikison से सुई सिरिंज का उपयोग करें: मानव त्वचा के अंदर उठाव गर्भवती चूहों में atraumatic intraperitoneal इंजेक्शन के लिए आदर्श है. इसके अलावा, इस सिरिंज एक बहुत ही कम मृत अंतरिक्ष की मात्रा है और चतनाशून्य करनेवाली औषधि संस्करणों आमतौर पर बांधों, जिसका भ्रूण E11.5 या E12.5 पर हैं के लिए आवश्यक की श्रेणी के लिए calibrated है.

रोगनिरोधी पीड़ाशून्यता तैनात भ्रूण अस्तित्व का समर्थन: सीवन लाइन पर एक सामयिक चतनाशून्य करनेवाली औषधि जैसे, व्यवस्थापकBupivicaine, और Meloxicam के रूप में एक प्रणालीगत गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा, पूर्व वसूली पिंजरे में बांध रखने इतना है कि दर्दनाशक दवाओं समय से बोर्ड पर कर रहे हैं, बांध संज्ञाहरण से ठीक है. बांध में परेशानी को कम करने और एक स्वस्थ गर्भावस्था के पश्चात की वसूली के रखरखाव की सुविधा.

बेवल microinjection pipettes और कसकर बाहरी व्यास विवश: भ्रूण मारक का सबसे आम कारण ऊतक और / या खराब निर्माण microinjection pipettes से संवहनी नुकसान है. E11.5 माउस otocyst के में transuterine microinjection पुराने भ्रूण में बड़ा अंगों (यानी, vesicles के मस्तिष्क, आंख, अंग, आदि) में इंजेक्शन से विभिन्न बाधाओं किया जाता है. Unbeveled, खराब beveled है, या अनुपयुक्त बड़े बाहरी व्यास pipettes वाहिकाओं में गर्भाशय, आंत की जर्दी थैली वाहिका संरचना, और / या E11.5 में भ्रूण है, जो भ्रूण अस्तित्व में कमी से खून बह रहा है कारण होगा. यह संभव हैछोटे व्यास के टिकाऊ pipettes है कि एक उचित उठाव ले हाथ तोड़, लेकिन यह इतना नियमित करने के लिए मुश्किल है. E11.5 माउस भ्रूण,, जिसका छोटे otocyst के लक्ष्य है माफ होगा. पी पी 1000 97-Sutter उपकरण से पिपेट 2011 विंदुक डिजाइन और निर्माण 19 पर एक पूर्ण बहस के लिए रसोई की किताब से परामर्श करें. इस काम में इस्तेमाल किया pipettes के लिए पैरामीटर ऊपर नोट कर रहे हैं और उनके निर्माण पूरी तरह से 11 पहले से चर्चा किया गया है. Sutter उपकरण beveler BV-10 के लिए मालिक के मैनुअल में प्रक्रियात्मक नोट्स भी एक उत्कृष्ट संसाधन हैं.

क्यों transuterine microinjection के द्वारा otocyst mistargeting होता समझो वीडियो E11.5 और otocyst E12.5 के में transuterine microinjection के लिए आदर्श परिणाम प्रस्तुत करता है. Otocyst Mistargeting आम तौर पर भी अल्पज्ञता इंजेक्शन, बहुत गहरा है, से या अपर्याप्त गढ़े pipettes से परिणाम है. चित्रा 2 में इन शर्तों को दर्शाता है. पैनलएक E12.5 otocyst में सफल तेजी से हरी समाधान के transuterine microinjection के बाद transillumination द्वारा imaged भ्रूण के बाईं ओर के एक पार्श्व दृश्य दिखाता है. (एचबी) hindbrain पच्चर के आकार का एक पायदान otocyst के लिए पृष्ठीय के रूप में प्रकट होता है. नेत्र (ई) के साथ इसकी परिधि और बाएँ forelimb प्रमुख है वर्णक के एक वलय है. प्राथमिक सिर शिरा (PHV) के मुख्य ट्रंक otocyst के बस के नीचे है. otocyst तेजी से हरे रंग जो काला प्रकट होता है के साथ भर जाता है: पृष्ठीय, अन्त: कर्णोदकीय वाहिनी (ईडी) और otocyst (OC) के बरोठा रीति से किया जा सकता है. E11.5 12.5 otocyst की सफल लक्ष्यीकरण हमेशा एक स्पष्ट रूप से प्रत्यक्ष अन्त: कर्णोदकीय वाहिनी और बरोठा पेश करेंगे. पैनल सफेद के इंजेक्शन otocyst की महत्वपूर्ण समीक्षा की सुविधा लेबलिंग के बिना एक के रूप में एक ही छवि को दर्शाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Transuterine microinjec के द्वारा otocyst mistargeting के लिए एक सचित्र गाइडtion के सभी पैनल midbrain और अग्रमस्तिष्क बाईं पैनल एच, जो क्षेत्र hindbrain - मध्यमस्तिष्क की एक पृष्ठीय दृश्य है सिवाय एक E12.5 भ्रूण के बाईं पार्श्व दृश्य, दिखाओ. प्रत्येक पंक्ति में पैनलों एक ही भ्रूण की छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. Otocyst mistargeting के कारणों की एक विस्तृत विवरण के लिए चर्चा देखें. लघुरूप: ई, बाईं आंख, एड, अन्त: कर्णोदकीय वाहिनी, fg, तेज हरे, एचबी, hindbrain, पौंड, अंग कली, oc, otocyst, ओ.टी., कान का क्षेत्र, पी, पिपेट, PHV, प्राथमिक सिर नस, पीटी, पिपेट टिप.

सतही इंजेक्शन mistargeting का एक आम कारण है. पैनलों E12.5 conceptus में एक सतही इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाएगा. hindbrain (एचबी) पायदान और कान का क्षेत्र (ओ.टी., चक्र) इस बाएं पार्श्व दृश्य में स्पष्ट कर रहे हैं. microinjection विंदुक (पी) अग्रभूमि में है. फास्ट हरे (FG) विंदुक टिप (बी) से बेदखल करने के लिए शुरू होता है, और दबाव सुई लगानेवाला (सीडी), डाई diffuses से बाद में दालों के साथ एक अंडाकार आकार में. वें का वितरणई डाई पता चलता है कि यह गर्भाशय की दीवार और आंत की जर्दी थैली, कि exocoelomic गुहा envelops एक extraembryonic झिल्ली के बीच पेश किया गया था. experimenter के इस भ्रूण में otocyst फिर से लक्षित करने का प्रयास नहीं है, लेकिन अगले भ्रूण पर कदम चाहिए. एकाधिक इंजेक्शन की कमी हुई भ्रूण अस्तित्व, एक प्रभाव है कि अधिक E12.5 से E11.5 पर तीव्र है के साथ सहसंबंधी.

दीप इंजेक्शन mistargeting की एक और अधिक आम कारण है. पैनलों एफएच एक इंजेक्शन प्रक्षेपवक्र कि hindbrain में कान का क्षेत्र के माध्यम से गुजरता है प्रदर्शित करता है. प्राथमिक सिर नस (PHV), बाईं आंख (ई), और विंदुक (पी) एक E12.5 भ्रूण के इस पार्श्व दृश्य में स्पष्ट कर रहे हैं. तेज हरे (FG) की प्रारंभिक इंजेक्शन के प्राथमिक सिर नस / कान क्षेत्र के लिए सम्मान के साथ पीछे की ओर विस्थापित है. बाद में दालों के साथ, पच्चर के आकार का hindbrain (एचबी) तेजी से हरे रंग (पैनल जी) के साथ पूरी तरह भरा हुआ था. एक इंजेक्शन भ्रूण के 90 डिग्री रोटेशन hindbra भीतर तेजी से हरे रंग का पता लगाने की अनुमति देता हैपृष्ठीय दृश्य (पैनल एच) से गुहा में. दोनों सतही और गहरी microinjection पिपेट की गहराई अनुभव के बाद यह गर्भाशय साथ संपर्क बनाता अक्षमता से इंजेक्शन परिणाम. एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है कि अच्छी तरह से काम करता है गर्भाशय के माध्यम से विंदुक अग्रिम और फिर तुरंत एक बार नाड़ी तेजी से हरे रंग की एक कश के लिए देखने के लिए है: कश के स्थान विंदुक टिप की अनुमानित स्थिति को इंगित करता है. इस सीमा खोजने नाड़ी पर आधारित गहराई को समायोजित करें.

अधूरेपन से गढ़े pipettes mistargeting का सबसे आम कारण हैं हैं. इंजेक्शन पैनलों में दिखाया प्रयास इंद्रकुमार एक विंदुक टिप है कि मैन्युअल रूप से टूट गया था लेकिन नहीं beveled के साथ आयोजित किया गया. E12.5 भ्रूण के पार्श्व दृश्य (एचबी) hindbrain के बाईं आंख (ई), और microinjection विंदुक (पी) से पता चलता है. ध्यान दें कि विंदुक टिप (पीटी) तेजी से झुका है और गर्भाशय घुसना करने में विफल रहा है (मैं पैनल). अतिरिक्त बल के आवेदन विंदुक (पैनल जम्मू, तीर) की नोक कैंची, रंज छोड़नेette टिप गर्भाशय में एम्बेडेड है. तेज हरे (FG) की एक छोटी राशि खंडित विंदुक से अलग हो गया था और गर्भाशय की सतह देखा है. एम्बेडेड विंदुक टिप (पैनल कश्मीर) ठीक है, बाँझ संदंश के साथ हटा दिया जाना चाहिए और sharps अपशिष्ट के रूप में खारिज. यदि विंदुक टिप या नहीं स्थित सफलतापूर्वक हटा सकते हैं, संज्ञाहरण के तहत बांध euthanize.

दस्तावेज़ माउस अस्तित्व सर्जरी डाटा शीट पर प्रक्रियात्मक टिप्पणियों: इन विधियों को सीखने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व के लिए टिप्पणियों दस्तावेज़ और उन टिप्पणियों के आधार पर समायोजन करना है. एक माउस अस्तित्व सर्जरी डाटा शीट उत्पादन और ध्यान दें, ऑपरेटिव, preoperative और पश्चात की जानकारी. Preoperative डेटा बांध वजन, संवेदनाहारी दिया की खुराक, प्लाज्मिड इंजेक्शन, आदि ऑपरेटिव डेटा भ्रूण इंजेक्शन शामिल है (यानी, R2 सही गर्भाशय सींग में अंडाशय से दूसरा भ्रूण है), इंजेक्शन की गुणवत्ता में (यानी, कोई अन्त: कर्णोदकीय शामिल वाहिनी का पता चला, 4 में डाई माउस सर्जरी जीवन रक्षा शीट डाटा "). गुणवत्ता नोट उत्पादक methodological शोधन है कि सफल परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे बनाने के लिए आधार के रूप में.

पल्स प्रति वितरित अभिकर्मक दक्षता अनुकूलन करने के लिए वर्तमान का उपयोग करें: वर्ग तरंग पल्स ट्रेन 5 के होते हैं, 43volt, एक 950msec अंतर के साथ 50msec दालोंपल्स देरी. 5mm प्लैटिनम, चप्पू शैली इलेक्ट्रोड सुनिश्चित करना है कि पूरे कान का क्षेत्र बिजली के क्षेत्र के भीतर निहित है. इसी तरह अभिकर्मक क्षमता के 3mm paddles के साथ प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि वे और अधिक करने के लिए सही स्थिति के लिए मुश्किल हैं. नाड़ी प्रतिमान वर्तमान मूल्यांकन अंतिम नाड़ी के दौरान भ्रूण को हस्तांतरित कर अनुकूलित किया गया था, voltages के माध्यम से व्यापक और अभिकर्मक दक्षता का आकलन करने से नहीं. तर्क यह है कि नाड़ी प्रति वितरित वर्तमान निरंतर वोल्टेज में गर्भाशय और प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के बीच बिजली के युग्मन की प्रत्यक्षता के आधार पर भिन्न होता है. यह मानते हुए कि गर्भाशय हौसले lactated है घंटी समाधान के साथ तुरंत पहले paddles और प्रभारी वाहक अधिक में मौजूद है रखने के लिए सिंचित है, मुख्य चर "युग्मन" paddles के साथ गर्भाशय लागू करने के लिए दबाव की राशि है. मौजूदा दिया और छिटपुट अभिकर्मक के <सबसे अच्छा 60mAmps में 43volts परिणाम पर कोमल दबाव. 43v पर मध्यम दबाव60 100mAmps में OLTs परिणाम दिया है और सबसे कुशल अभिकर्मक. 43volts परिणाम पर भारी दबाव में 100mAmps दिया और लगातार बदल दिल की दर के साथ संबद्ध है और भ्रूण मारक में वृद्धि हुई है. अत्यधिक दबाव आंत की जर्दी थैली (एक "पॉप" paddles के माध्यम से महसूस किया जा सकता है) ruptures और भ्रूण मारक का कारण बनता है. यह संभावना है कि चर लागू दबाव इलेक्ट्रोड जो दिया वर्तमान को प्रभावित करता है के बीच प्रतिबाधा बदल. पल्स आवृत्ति 1Hz (प्रति सेकंड 50 एक मिसे नाड़ी) की कम से कम करने के लिए भ्रूण के हृदय चक्र है, जो भ्रूण अस्तित्व के लिए सहसंबंधी करने के लिए सकारात्मक है के लिए विघटनकारी के रूप में परिभाषित किया गया था. हम निष्कर्ष है कि vivo electroporation प्रतिमान में एक कुशल स्थापित करने में निगरानी सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर वर्तमान नाड़ी प्रति दिया है. किसी भी नाड़ी प्रतिमान के संशोधन वर्तमान नाड़ी प्रति वितरित की सावधान निगरानी शामिल होना चाहिए.

वें सीखने के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण अपनानेई तकनीक: मॉड्यूल 1: गर्भाशय बाह्यीभवन साथ एक नकली सर्जरी अभ्यास, लेकिन इंजेक्षन electroporate या नहीं. बांधों उदर laparotomy बहुत अच्छी तरह सहन और postsurgical सर्जिकल तकनीक से संबंधित जटिलताओं अनुभव कभी नहीं करना चाहिए. माउस उत्तरजीविता कौशल शल्य बेशक घर संस्था में निवास कर रहे हैं इतना पर्याप्त प्रशिक्षण का पीछा. आगे बढ़ने से पहले शल्य चिकित्सा कौशल की महारत हासिल है. मॉड्यूल 2: संज्ञाहरण के तहत बांध euthanize, इंजेक्शन भ्रूण को अलग, और otocyst इंजेक्शन की गुणवत्ता का मूल्यांकन: अभ्यास अस्तित्व सर्जरी को पूरा करने की उम्मीद के बिना एक संवेदनाहृत बांध पर otocyst के में transuterine microinjection. 3 मॉड्यूल: लक्ष्य तेजी से हरे रंग के साथ 2 अलग भ्रूण में केवल 2 otocysts के electroporate नहीं है, सर्जरी को पूरा करने के लिए, और बहाव भ्रूण अस्तित्व मान्य. 4 मॉड्यूल: लक्ष्य डीएनए / तेजी से हरी समाधान, electroporate, बहाव भ्रूण अस्तित्व मान्य है, और पता लगाने अभिकर्मक कोशिश के साथ ही 2 भ्रूणficiency. 5 मॉड्यूल: लक्ष्य डीएनए / तेजी से हरी समाधान के साथ ही 2 भ्रूण, electroporate, 4 वें चालाकी भ्रूण लेबल निलय में एलेक्सा Fluor इंजेक्षन, P0 पर लेबल भ्रूण का चयन करें, और पता लगाने अभिकर्मक दक्षता.

प्रक्रियात्मक सीखने की अवस्था: माउस अस्तित्व सर्जरी तकनीक की महारत एक घर संस्था के पशु चिकित्सा और शल्य चिकित्सा कर्मचारियों से उचित मार्गदर्शन के साथ, काफी तेजी है और केवल 3-5 - बांधों के लायक विशेषज्ञता हासिल करने के लिए नौसिखिया के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है चाहिए. Microinjection transuterine और vivo electroporation में उपयोगी ट्रांसफ़ेक्ट भीतरी कान उत्पन्न 10-50 प्रयास के बांधों मूल्य की आवश्यकता होती है, गर्भावस्था प्रति 6 व्यावहारिक भ्रूण और मॉड्यूलर दृष्टिकोण का पालन कर रहे हैं संभालने है. उन छात्रों को, जो कि ठीक मोटर कौशल की आवश्यकता होती है गतिविधियों का आनंद लें (यानी, एक संगीत वाद्य खेलने, सिलाई, मॉडल बनाने, या प्रतिस्पर्धी एथलेटिक्स) यद्यपि की तुलना में कम प्रशिक्षण अवधिसे है कि नहीं. इन तरीकों के सफल महारत के लिए महत्वपूर्ण संबद्ध विस्तार (यानी, microinjection विंदुक निर्माण, नाड़ी शरीर रचना विज्ञान, स्पष्ट ध्यान दें ले) और एक हद तक शांत आचरण धर्मभीरु ध्यान कर रहे हैं.

वर्कफ़्लो: एक बार जब विशेषज्ञता प्राप्त है, एक इंजेक्शन और electroporating के बांध प्रति 4-6 भ्रूण की आशा कर सकते हैं, 3-5 भ्रूण बच जाएगा, उपयोगी है और 2-4 भ्रूण विश्लेषण के लिए आंतरिक कान ट्रांसफ़ेक्ट. जन्म के समय से छंटाई के लिए hindbrain एलेक्सा Fluor लेबलिंग लेबल भ्रूण तकनीक प्रत्येक electroporated भ्रूण में अतिरिक्त hindbrain के इंजेक्शन की आवश्यकता है, लेकिन यह अच्छी तरह से सहन किया है और प्रक्रियात्मक दक्षता पर प्रतिकूल प्रभावित नहीं है. इस प्रकार, vivo electroporation में से उपयोगी ट्रांसफ़ेक्ट भीतरी कान की वसूली दर समयुग्मजी एक heterogygous प्रजनन प्रतिमान से उत्परिवर्ती चूहों की वसूली की दर से कृपापूर्वक तुलना. अनुभव के साथ, प्रति दिन 2-3 बांधों experimenter के प्रति एक उचित काम हैप्रवाह: सर्जरी के लिए बांध प्रति 1.5 बजे और पोस्ट ऑपरेटिव निगरानी के लिए 1.5-2 घंटे के एक कुल.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Sterilizing Case Roboz Surgical Instruments Co. RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12
Needle driver Fine Science Tools 12502-12
Allergy Syringe Tray BD Biosciences 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter Internationl Inc. 2B2323
Fast green Sigma-Aldrich F7258
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Micr–lectrode Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International, Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International, Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin Corporation 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056
Horizontal laminar flow clean bench Envirco Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers www.ssponline.com

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References

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