小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用:膀胱Chemosensationの研究

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Summary

膀胱内圧測定では、小動物の膀胱機能を測定するための効率的な手法である

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Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., et al. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

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Abstract

Protocol

1。実験動物

  1. 動物(マウス、ラット)が12時間明暗サイクルと水と標準食物ペレットへの不断のアクセス権を持つ専門の動物施設に収容されています。動物の年齢や性別はどちらもニーズに応じて標準化されるべき重要なパラメータである。 12週齢の雌の動物5,6 -我々は、典型的には10で膀胱内圧測定を行います。
  2. 全ての動物実験は、欧州連合コミュニティ協議会のガイドラインに従って実施され、地域の倫理委員会によって承認されています。

2。麻酔

  1. それはその短い半減期のために投与量に容易であるのでイソフルレン麻酔は、小さな外科的処置を行うために使用されます。イソフルランを使用するときに適切な清掃、廃ガスが必要です。
    1. 動物は純粋な酸素でイソフルラン5%(1リットル/分)でガス、密閉ボックス内に配置されます。
    2. 適切なlの誘導後、麻酔1と1リットル/分の酸素 - - イソフルランの1.5%を0.8 evelによって小さなマスク(カット10mlシリンジ)によって維持されています。
  2. マウスの場合、ウレタン麻酔は機能録音(cfr.赤外線)中に使用されます。ほとんどの他の麻酔薬とは対照的に、排尿反射がこの麻酔剤4によって抑制されていない、ので、ウレタン麻酔は、機能録音時に使用されます。ウレタン1.2グラム/ kg体重は60分の録音が開始される前に皮下(sc)投与される。必要に応じて、適切な麻酔を得るために必要なウレタンの用量を皮下に追加投与(0.1 g / kg)を投与することにより、滴定することができる。それは注意すべきである、しかし、その追加の麻酔は排尿効率ひいては排尿頻度7,8を変更することあります。したがって、cystometric録音が密接に監視および制御動作からの有意な偏差が観察されたときに破棄されるべきである。麻酔薬は、試験中に投与してはならない化合物は、データの誤解釈を避けるために適用されます。

3。外科手術 - 膀胱カテーテル注入

  1. 外科用器具は、使用前にオートクレーブで滅菌されています。 、動物の腹部を剃る70%エタノールで消毒し、膀胱を露出させるために低正中開腹を行う。
  2. 手術用顕微鏡下では、非吸収性モノフィラメント縫合糸(サイズ6-0)を使用して膀胱に巾着縫合を置きます。
  3. 巾着の中に小さな膀胱を(我々が優先的に18Gの針を使用)を実行し、この貫通孔の端の小さなカフ(慎重にチューブを加熱することによって得られる)と、PE 50ポリエチレンカテーテルを挿入します。我々の手で、より薄いチューブ(PE 10)は、より高く、より可変抵抗を持っています。チューブはエタノール70%溶液に入れ、オートクレーブで滅菌することによって消毒することができます。注入前に、チューブを生理食塩水でフラッシュする必要があります。
  4. 財布strを確保外科医の結び目で管の周囲ING。釣鐘型の先端が右縫合下に配置されるまでゆっくりと外側にカテーテルを引き抜きます。漏れを防ぐために、縫合糸に向かって18Gのカテーテルの部分を押し込みます。
  5. 漏れがないか確認するために静かに - 生理食塩水を少量(200μlの100)を吹き込む。漏れがある場合は、追加の縫合糸は、配置する必要があります。
  6. 切開の上部にカテーテルの通路を残して、モノフィラメント縫合糸を用いて腹部の筋肉を閉じます。
  7. トンネル中空の金属棒を使って肩甲間部​​にチューブが、それによって実験中にチューブを噛まないように動物を防ぐ。
  8. 皮膚は非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して閉じられます。移植されたカテーテルは、その透過性を確認するために、生理食塩水でフラッシュされます。
  9. 動物が目覚める前に、鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.05 mg / kg)を皮下投与されています。

4。セットアップと膀胱内圧測定

  1. 実験クエスティに応じて(そして、種が使用される)に膀胱内圧測定は、目を覚まして(拘束またはunrestraint)またはウレタン麻酔動物で行われます。膀胱内圧測定が拘束環境で冷静さを保つ傾向にある意識下ラットにおいて、完全に可能であるのに対し、マウス3,5,6,9を使用しているとき、我々は通常、ウレタン麻酔(1.2 mg / kgの皮下)の下で膀胱内圧測定を行います。
  2. 麻酔したマウスでは、体温を常に監視し、36.5に保たれている℃±0.2℃の温度プローブと加熱ランプを用いた。
  3. セットアップは、製造元の指示に従って、すべての実験の前に校正されています。
  4. 移植されたカテーテルは、一方の側の圧力変換器(エドワーズライフサイエンス)およびその他(ハーバード装置)上の輸液ポンプに接続されている3ウェイタップにルアースタブによって接続されています。圧力トランスデューサは、データ収集システム(DI-730-USB Dataq楽器)と共同にアンプ(78534cモニター、ヒューレットパッカード)を介して接続されているmputer。 Windaq / Liteソフトウェアは、記録のために使用することができます。
  5. 輸液ポンプは、例えば、生理食塩水またはPBSの注入を可能にし、開始され、100μl/分(ラット)または20μl/分(マウス)。膀胱内圧が記録されている間などの膀胱は、一定の割合で満たされるでしょう。
  6. 図5は、標準的な圧力のトレースを表しています特定のボリューム/圧力に到達するまで、輸液中、遅い圧力上昇は、排尿閾値は、膀胱内にあります。このしきい値に達すると、膀胱が収縮し、その後尿道括約筋は尿道を通って尿の通過を可能にする、オープンします。このように、膀胱が空になると、収縮が停止し、圧力が "基礎"レベルに再び低下します。
  7. ラットを代謝ケージ内とデジタルのバランスの上に置かれたように、排尿量は排尿量についての情報を与え、同時に測定することができます。マイルの小さなボイドボリュームに起因するceが、それは、このシステムを使用して非常に困難な場合があります。したがって、排尿量は排尿の前後に計量し、小さなろ紙を用いて決定される。
  8. 通常、我々は、システムが30分間の記録期間が続く30分間平衡化しましょう​​。その後、薬は全身的または膀胱内投与することができ、さらに30分が記録されている。
  9. 記録されたデータは、定量分析に特化したソフトウェアにインポートすることができます。csvファイルとしてエクスポートすることができます。我々は一般的に(OriginLabのコーポレーション、米国マサチューセッツ州)原点を使用しています。
  10. 実験の後、動物を頸椎脱臼(マウス)またはCO 2中毒(ラット)で屠殺する。

5。代表的な結果

図1
図1:開腹概要。 A)は仰臥位でラットを置きます。 B)を剃ると殺菌して手術部位を準備します。皮膚のC)を切開。 D)を切開OF腹筋、膀胱暴露。

図2
図2:巾着縫合。

図3
(3)カテーテル注入

図4
図4カテーテルのトンネリング。

覚醒ラット及び麻酔マウスに生理食塩水の膀胱内灌流の間に得 ​​られた圧力測定の例を図5に示す。複数のパラメータが圧力信号(intercontractile間隔、基準圧力と閾値圧力など )から抽出することができます。これらのパラメータの包括的な説明については、。Anderssonらを参照してください(参考文献4)と吉山 ( REF 10)。

我々は最近、マスタードオイル(MO)で、長い間、膀胱11,12などの内臓器官の炎症や痛覚過敏の実験モデルで使用されてきた非常に反応性の高い化合物の分子標的を同定するために膀胱内圧測定を使用している。 10mMのMOの膀胱内注入は、野生型マウスにおける排尿頻度の大幅な上昇(intercontractile間隔の減少)( 図6A、B)及び排尿量6の減少を誘発した。興味深いことに、MOはMOのTRPA1受容体の欠損マウスでも同様の変更を誘導した。これとは対照的に、MOはWTマウスに比べてTRPV1 KOマウスにおいてcystometricパラメータのはるかに弱い変化を誘導し、Trpa1/Trpv1 KOマウスで任意の効果がなかった。一緒にペプチド(CGRP)6カルシトニン遺伝子関連のリリースの測定値と、これらのデータは、TRPV1は、MOにより誘発される内臓炎症に重要な役割を果たしている可能性があることを示していることを示します。

ve_content "> 図5
図5に配慮した雌ラット()で、麻酔雌マウス(B)に記録された膀胱内圧の代表痕跡。最低圧力は "ベースライン圧力"(赤矢印)として定義されています。充填段階の終わりでの圧力は青い矢印でマークされています。ベースラインの圧力) "intercontractile間隔"(ICI)の間の時間です - 圧力差で割ったもの、これらの点の間に注入された流体の体積は、膀胱壁のコンプライアンスの計算(コンプライアンス=注入量/が(閾値圧力を可能2排尿収縮。

図6
図6野生型における膀胱内圧測定パターンとTRPA1、TRPV1Trpa1/Trpv1ノックアウトマウスにマスタードオイルの膀胱内のアプリケーションの影響。(A)は、生理食塩水および10mM MOの注入に応答して、WT、KO TRPA1、TRPV1 KOおよびTrpa1/Trpv1 KOマウスに記録されている膀胱内圧の変化の代表的な例。前とMOの膀胱内注入時の平均排尿瞬時周波数の(B)の時間経過。すべてのマウスでは、データは生理食塩水注入の間に得られた平均周波数に正規化された。これらのデータは、エルゼビアの許可を得て、Everaerts (文献6)から適合させられます。

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Discussion

ここに提示され膀胱内圧測定技術は、動物モデルにおける膀胱機能 in vivo測定行うことができます。ラットは、おそらく最もよく使われる動物モデルである。マウスのほうが扱いは難しいですが、遺伝子操作された動物を使用することの利点を提供します。なぜなら埋め込まれたカテーテルと膀胱内圧に影響を与える可能性が腹腔内圧力の変化の緩み、その結果非常に活発になる傾向が意識のあるマウスを使用しての技術的な難しさのため、我々は完全な膀胱内圧測定中にウレタンと彼らは麻酔を維持するように助言するプロトコル。もちろん、鎮静マウスを持つことの利点は、麻酔薬の効果に​​比較考量されるべきです。このように、ウレタンは排尿後残尿量7,8に重大な影響を持つことができます。私達が私達のレコーディングや介入を開始する前に、我々は、麻酔の安定度が得られるまで、我々は待つ。

研究者は、tを考慮する必要があります雄と雌のげっ歯類の排尿13の間、彼は違いがあります。また、動物の年齢は非常に重要である。 12週齢 - 私たちは、10アール動物で膀胱内圧測定を実行します。全ての実験は、意識のある動物を使用する場合は特に、落ち着いた環境で行われるべきである。注入速度の数は、我々の動物モデルについて記載されている。当社は、通常のマウスについて20μl/分およびラットに100μl/分の注入速度を使用します。

前述したように、人間とげっ歯類では排尿は大きく異なります。ヒトでは、生理的条件下で膀胱収縮は、主にアセチルコリン4によって媒介されるのに対し、例えば、ATPは、マウスおよびラットにおける排尿筋収縮に大きく貢献しています。しかし、可能性は遺伝子改変動物の臨床状況と使用している一般的に法外なアール侵襲的な測定を行うために、膀胱の病態生理の現行の境界を探索できるようにdの薬理学。この点で、重要な進歩が最近ムスカリン14、プロスタグランジン15とアドレナリン受容体16、神経ペプチド17は、Ca 2 +活性化K +チャネル18およびTRPチャネル3,5,6の役割を解明することで得られた。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgements

この作品は、ベルギー連邦政府(IUAP P6/28)、研究財団·フランダース(FWO)(G.0565.07とG.0686.09)、アステラス欧州財団賞2009とKU Leuvenの研究評議会からの補助金によって支えられて(GOA 2009/07、EF/95/010とPFV/10/006)。 PUと我々は、研究財団フランダース(FWO)のポスドクです。 MBは、マリー·キュリー·フェローでもある。 DDR FWOの基本的な臨床の仲間。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

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References

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