Framställning av myeloida Derived suppressorceller (MDSC) från naiva och pankreatisk tumör-bärande möss med användning av flödescytometri och automatiserat Magnetisk cellsortering (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta är en snabb och omfattande metod för immunofenotypning Myeloida Härledda suppressorceller (MDSC) och berikande Gr-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC är en heterogen population av omogna makrofager, dendritiska celler och granulocyter som ackumuleras i lymfoida organ i patologiska tillstånd innefattande parasitisk infektion, inflammation, traumatisk stress, transplantat-mot-värd-sjukdom, diabetes och cancer 1-7. Hos möss MDSC uttrycker Mac-1 (CD11b) och Gr-1 (Ly6G och Ly6C) ytantigener 7. Det är viktigt att notera att MDSC väl studerats i olika tumörbärande värdar där de ökade betydligt och undertrycka anti-tumör-immunsvar jämfört med naiva motsvarigheter 7-10. Beroende på det patologiska tillståndet, det finns olika subpopulationer av MDSC med olika mekanismer och mål av förtryck 11,12. Därför effektiva metoder för att isolera livskraftiga MDSC populationer är viktiga att belysa deras olika molekylära mekanismer av förtryck in vitro och in vivo.

Nyligen Ghansah grupp har rapporterat utbyggnaden av MDSC i en murin pankreascancer modell. Vår tumörbärande MDSC visar en förlust av homeostas och ökad suppressiv funktion jämfört med naiva MDSC 13. MDSC procenttal är signifikant mindre i lymfoida fack naiva vs tumörbärande möss. Detta är en viktig förbehållet, som ofta hindrar exakt jämförande analyser av dessa MDSC. Därför berikande Gr-1 + leukocyter från naiva möss före fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) förbättrar renheten, livsduglighet och signifikant minskar sortera tid. Det är dock anrikning av Gr-1 + leukocyter från tumörbärande möss frivillig eftersom dessa finns i överflöd för snabba FACS sortering. Därför i detta protokoll, beskriver vi en mycket effektiv metod för att immunofenotypning MDSC och berikande Gr-1 + leukocyter från mjälten hos naiva möss för sortering MDSC i tid. Immunkompetenta C57BL / 6 möss inokuleras med murin Panc02 ceLLS subkutant medan naiva mössen får 1XPBS. Cirka 30 dagar efter inokulering, mjälte skördas och förädlas till encelliga suspensioner med en cell dissociation sil. Splenocyter därefter röda blodkroppar (RBC) lyserades och en alikvot av dessa leukocyter färgas med användning av fluorokromkonjugerade antikroppar mot Mac-1 och Gr-1 till immunofenotyp MDSC procenttal med hjälp av flödescytometri. I ett parallellt experiment, är hela leukocyter från naiva möss färgades med fluorescerande-konjugerade Gr-1-antikroppar, inkuberades med PE-mikropärlorna och positivt selekteras med användning av en automatiserad Magnetisk cellsortering (autoMACS) Pro Separator. Därefter är en alikvot av GR-1 ^-leukocyter färgades med Mac-1 antikroppar för att identifiera den ökade MDSC procenttal med hjälp av flödescytometri. Nu, dessa GR1 + anrikade leukocyter är redo för FACS-sortering av MDSC som skall användas i jämförande analyser (naiva vs tumörbärande) i in vivo och in vitro

Protocol

Före start, framställa följande lösningar:

3% Färgning av medier (SM):

-3% Fetalt bovint serum (FBS) i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% albumin från bovint serum (BSA) i 1XPBS

1. Skörd Mjältar från möss

  1. Subkutant injicera 6-8 vecka gamla C57BL / 6 möss (Harlan) med 1,5 x 10 5 murina Panc02 celler suspenderades i 100 pl 1 x PBS (tumörbärande; TB). Kontrollmöss (naiva) få 100 pl 1XPBS.
  2. Cirka 4 veckor efter injektion, euthanize möss genom kvävning med koldioxid.
  3. Harvest mjälte från möss med trubbig dissektion med pincett och sax väg sedan med hjälp av en balans. Ställe mjältar i separata, märkt 50 ml koniska rör innehållande 1 x PBS.

2. Generera en enstaka cell Suspension av leukocyter från Mjältar

Alla procedurer bör utföras i en steril miljö under en biologisk säkerhet Hood och celler och antikroppar som hålls på is.

  1. Montera celldissociation silen genom att sätta in mesh in i öppningen på koppen mot botten. Sedan in låsringen i det gängade området med slitsade sidan och använda ringen för att dra åt låsringen, vilket håller skärmen på plats. Placera den sammansatta silen i en petriskål innehållande 10 ml 1 x PBS.
  2. Pool mjältar och användning glas mortelstöt för att mala mjälten mot mesh för celldissociation såll och in i en petriskål. Upprepa detta för varje behandlingsgrupp för möss.
  3. Filtret cellsuspension i en 50 ml koniskt rör med användning av en 70 ^ m sil cell och en 5 ml serologisk pipett. Centrifugera vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min.
  4. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml 1 x RBC-lys-buffert per mjälte. Pipettera upp och ner kraftigt. Inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter. Stoppa reaktionen genom tillsats av 20 ml 1 x PBS. Pipettera upp och ner kraftigt. Centrifugera vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min.
  5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 20 ml steril 1 x PBS. Pipettera upp och ner kraftigt.
  6. Räkna celler med användning av Trypan blå och en hemacytometer och återsuspendera i önskad koncentration i 3% SM så att 50 pl är lika med 5x10 5-1x10 ^ 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml).

3. Cellytan Färgning / immunfenotypning av MDSC med hjälp av flödescytometri

  1. Märk brunnarna i en 96-brunnars V-bottenplatta för styrning och experimentprover och enstaka fläckar för kompensation kontroller (ingen fläck, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC och DAPI).
  2. Tillsätt 5x10 5-1x10 ^ celler 6 motsvarar 50 | il / brunn av splenocyter till sina respektive brunnar i 96-brunnars V-bottnad platta. Centrifugeraplatta vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min.
  3. Förbereda "Master Mix" (MM) i mus BD Fc-block (råtta anti-mus CD16/32 monoklonal antikropp) utspäddes i 3% SM, i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på is. Som en startpunkt, använd 1 pg Fc Block i 3% SM för en slutlig volym av 50 | il per brunn.
  4. Försiktigt bort supernatanten från varje brunn i 96-brunnars V-bottnad platta genom att snabbt vända plattan över och tillbaka över en avfallsbehållare eller diskhon utan avbrott i de cellpelletar.
  5. Vortex, kortfattat centrifugera Fc Block MM under 5 sekunder och tillsätt 50 | il till alla pellets i 96-brunnars V-bottnad platta. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned och lämna prov i sina brunnar. Inkubera plattan under 15 minuter i mörker på is. Centrifugera plattan vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min.
  6. Förbereda "Master Mix" (MM) av fluorokromkonjugerade antikroppar utspädda i 3% SM i en 1,5 ml mikrocentrifugrör på is, medan prover inkubera med Fc-block. Antikroppar bör titrerasatt bestämma optimala utspädningar för färgning förfaranden. Som en startpunkt, kombinera en 1:25 utspädning av Mac-1-FITC och 1:20 utspädning av Gr-1-APC i 3% SM för en slutlig volym av 50 pl per provbrunn.
  7. Försiktigt bort supernatanten från varje brunn i 96-brunnars V-botten, såsom beskrivits tidigare.
  8. Vortex, kort centrifugera MM av fluorescerande-konjugerade färgning antikroppar i 5 sekunder och tillsätt 50 il till kontroll och experimentella pellets. Blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned. För enkel-fläcken kompensationer, tillsätt en 1:25 utspädning av Mac-1-FITC, 1:20 utspädning av Gr-1-APC och 75 ng / ml DAPI, i 3% SM för en slutlig volym av 50 pl per brunn till sina respektive brunnar. Tillsätt 50 pl 3% SM i ofärgade bra (någon fläck). Blanda väl och inkubera celler i 96-brunnars V-bottnad platta under 30 min i mörker på is.
  9. Label FACS-rör (5 ml, 12 mm x 75 mm polystyren med rund botten rör) för att motsvara varje brunn i 96-brunnars V-bottnad platta. Tillsätt 200 ul 3% SM till varandra FACSröret.
  10. Centrifugera plattan vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min och avlägsna supernatanterna. Tvätta pelletar genom tillsats av 100 | il 3% SM till varje pellet, och blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ner. Centrifugera plattan vid 12.000 varv per minut (250-300 x g) under 5 min. Upprepa tvättningen en gång.
  11. Försiktigt bort supernatanten från varje brunn i 96-brunnars V-botten, såsom beskrivits tidigare. Återsuspendera varje pellet i 100 | il 3% SM och blanda väl.
  12. Överför 100 | il återsuspenderades pelleten från varje brunn i 96-brunnars V-bottnad platta med deras respektive märkta FACS-rör.
  13. Före Flödescytometrianalys, tillsätt 75 ng / ml DAPI för att styra och det experimentella provet och DAPI enda fläck ersättning kontroll.
  14. Utför flödescytometrisk datainsamling i MDSC procentsatser. Utför ersättningen med den negativa (ingen färg kontroll) och de enskilda positiva kontrollerna. Upprätta ett punktdiagram som visar den främre (FSC) kontra sidospridning (SSC) i log-skala, så att leukocytpopulationer frånintresse kan identifieras. Dra en stor port på alla leukocyter, med undantag av skräp och klumpar med lägst framåt-och sidospridning. Från denna förälder porten, skapa en ny punktdiagram som visar SSC kontra DAPI och grind på DAPI-(levande) celler. Välj detta nyligen gated befolkningen och skapa ett punktdiagram som visar Mac-1 jämfört med Gr-1 och gate på dubbla positiva (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Magnetisk Anrikning av GR-1 + leukocyter

  1. Alikvot 1x10 ^ 7 kvarvarande ofärgade leukocyter till lämpligt märkta FACS-rör och centrifugera vid 12000 rpm (250-300 x g) under 5 min.
  2. Framställ MM av Gr-1-PE-antikropp i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. För upp till 10 7-celler, använda en 1:10 utspädning av Gr-1-PE-antikropp i 50 pl MB, per prov. För större cellantal, skala upp volymer i enlighet med detta. Kortfattat centrifugera under 5 sekunder, lägga till leukocyter i FACS-rör och inkuberas under 15 min vid 4 ° C i mörker. Tillsätt 2 ml MB till FACS-rör och centrifugera vid 12000 rpm (250-300 x g) under 5 min och häll bort supematant.
  3. Framställ MM av anti-PE-Mikrokorn i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. För upp till 10 7 celler använder en 1:4 utspädning av anti-PE Mikropärlor i 200 ul MB per prov. För större cellantal, skala upp volymer i enlighet med detta. Kortfattat centrifugera under 5 sekunder, lägga till leukocyter i FACS-rör och inkuberas under 15 min vid 4 ° C i mörker.
  4. Tillsätt 2 ml MB till FACS-rör och centrifugera vid 12000 rpm (250-300 x g) under 5 min och häll bort supematant. Återsuspendera pellet i 3 ml av SB. Filtrera genom ett 70 ^ m sil in i en ny märkt, 50 ml koniskt rör.
  5. Förbered och Prime Auto MACS Pro Separator. Refill alla flaskor med lämpliga lösningar och tomma avfallet flaska, om det behövs. Slå instrumentet och granska status för vätskebehållare och kolumn (er) efter initiering. Alla symboler bör vara grön. På menyn, välj "Separation" från den övremenyraden följt av "Wash nu" från den nedre menyraden. Välj "Skölj" från pop-up alternativ följt av "Run" för att starta priming processen. När priming processen är avslutad, kommer instrumentet visar då att det är "Ready for Separation" under menyn Status.
  6. Välja lämplig kyld provrörsställ för rör storlekar och plats 50 ml koniskt rör med magnetiskt märkta celler i rad A, 50 ml koniskt rör om icke fraktionsuppsamling i rad B och 15 ml koniska rör för en positiv fraktionsuppsamling i rad C.
  7. Välj "POSSEL_S" program cellseparation för positiv selektion av märkta målceller i känsliga läge från prover. Magnetiskt märkta målceller kvarhålles på kolonnen automater; omärkta celler ut i den negativa fraktionen uppsamlingsröret i rad B. På automatiserad tillbakadragning av magneten, kommer de märkta målceller frigöras i den positiva uppsamlingsröret i rad C i röret rack.

+ Berikade leukocyter

  1. Omräkning Gr-1 + och Gr-1 - fraktioner med användning av trypan-blått och en hemacytometer. Återsuspendera celler vid önskad koncentration i 3% färgning mediet så att 50 pl är lika med 5x10 5-1x10 ^ 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml) och överför 50 | il till motsvarande märkta FACS-rör.
  2. Framställa en MM av Mac-1 enbart, vid en 1:25 utspädning i 3% SM för en slutlig volym av 50 pl per prov. Färga celler och bereda enda fläck kompensationer för GR-PE, Mac-1 FITC och DAPI för flödescytometrianalys. Tillsätt 200 pl 3% SM och DAPI viabilitetsfärgämnet såsom tidigare beskrivits.
  3. Utför flödescytometrisk datainsamling för att bestämma Gr-1 + och Gr-1 - procentsatser och även jämföra MDSC procent före och efter autoMACS anrikning.

6. Representativa resultat

Här visar vi r epresentative resultat autoMACS anrikning av Gr-1 + leukocyter från poolade, naiva mjälte för efterföljande FACS sortering av MDSC (Figur 1). 1x10 ^ 6 naiva leukocyter färgades med Mac-1-FITC och Gr-1-APC-antikroppar för att identifiera MDSC procenttal med hjälp av en BD LSRII instrumentet, innan autoMACS sortering. 1x10 '7 naiva leukocyter färgades sedan med anti-Gr-1-PE-antikroppar och PE-mikropärlor för anrikning av Gr-1 + leukocyter med användning av en autoMACS Pro Separator. Post-autoMACS anrikning, Gr-1 procenttal i Gr-1 + och Gr-1 - uppsamlade fraktionerna utvärderades med användning av flödescytometri. 1x10 ^ 6 Gr-1 ^-leukocyter avlägsnades och färgades med Mac-1-FITC-antikropp för att analysera och jämföra MDSC procenttal av anrikad, poolade leukocyter naiva till icke-anrikade, poolades tumörbärande leukocyter genom flödescytometri.

fig1.jpg "/>
Figur 1. AutoMACS anrikning av Naiva Gr-1 + leukocyter för MDSC FACS-sortering. Mjältar skördades från pankreatiska tumörbärande och naiva möss och bearbetas till en-cellsuspensioner. Flödescytometrianalys av naiva leukocyter yta färgas med Mac-1 och GR-1 fluorescerande-konjugerade antikroppar, innan autoMACS anrikning (A). Flödescytometrianalys av Gr-1 + (B) och Gr-1 - (C) fraktioner efter autoMACS anrikning av Gr-1 +-celler från naiva poolade leuckocytes färgade med Gr-1-PE-antikroppar och anti-PE-mikropärlor. Flödescytometrianalys av MDSC och Gr-1 + procenttal efter autoMACS anrikning av Gr-1 +-celler från poolade leukocyter naiva (D) jämfört med icke-anrikade poolade leukocyter från tumörbärande möss (e) (naiva möss, n = 5 ; tumörbärande möss, n = 3). MDSC och Gr-1 procentsatser är grindas i representativa kontur tomter och histogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta är en detaljerad metod för att behandla och immunophentyping MDSC populationer som kan tillämpas för olika lymfoida vävnader från olika djurmodeller. I synnerhet kan autoMACS anrikning användas för isolering av olika leukocytpopulationer inklusive Gr-1 utarmning av splenocyter 4, rening av myeloida underuppsättningar av splenocyter och lymfkörtlar 5, isolering av benmärg neutrofiler 14 och rening av CD8 + T-celler från mjälte och lymfkörtlar 15. Oberoende av cellpopulationen av intresse, genererar en-cellsuspensioner av leukocyter från de önskade lymfvävnader som krävs för optimal ytfärgning, flödescytometrianalys, autoMACS anrikning och FACS-sortering. I detta protokoll använde vi mekanisk dissociation att skapa en enda cellsuspension av leukocyter. Men med hjälp enzymnedbrytning såsom kollagenas D är också ett lämpligt alternativ till detta protokoll för att ökautbytet av leukocyter från mjältar eller andra lymfoida organ 5.

Flödescytometri är en viktig teknik för immunfenotypning leukocyter. Därför krävs lämplig förberedelse för flödescytometri och berikande också användningen av lämpliga buffertar för cellsuspensionen och utspädning av antikroppsreagens. Många protokoll växlar mellan FBS och BSA för att förbereda färgning media och MACS buffert. Dessa reagens är också kommersiellt tillgängliga från företag såsom eBioscience, BD Pharmingen och Miltenyi Biotec. Såsom förklaras med Miltenyi Biotec och eBioscience, både BSA och FBS förhindra icke-specifik bindning när färgning leukocyter med fluorokromkonjugerade antikroppar. Ännu viktigare är att låga procentsatser av dessa djur serumproteiner bibehålla livsdugligheten och förhindra klumpning av leukocyter 16. Men från vår erfarenhet, fungerar BSA bättre för optimal färgning och bättre upplösning för autoMACS anrikning än FBS och rekommenDED i den beskrivna protokollet.

I detta protokoll, som kännetecknas vi mus MDSC med CD11b-FITC och Gr-1-APC fluorescerande-konjugerade antikroppar och flödescytometri. Det är absolut nödvändigt att titrera dessa antikroppar före användning för att minska högt färgning bakgrundsfluorescens att förhindra icke-optimala resultat. Dessutom, när man väljer antikroppar för flerfärgad flödescytometrianalys, är möjligt spektral överlappning av fluorokromerna också en annan viktig faktor som bör beaktas 17,18. Därför kontrollerar ersättning i form av enstaka färg fläckar för varje fluorochome-konjugerad antikropp av intresse eller ersättning pärlor, kan korrigera för emissioner av spektral överlappning 18. Ett annat viktigt övervägande för exakta resultat flödescytometriska är användningen av viabilitet färgämnen. Döda celler kan icke-specifikt binder till antikroppar, vilket skapar falska positiva resultat 19. I detta protokoll använder vi nukleinsyran fläcken, DAPI en lönsamhet färgämne för attutesluta döda celler från våra analyser som bäst kompletterar den panel av fluorokromkonjugerade antikroppar som används med minimal spektral överlappning. Emellertid kan andra viabilitet färgämnen såsom 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) och propidiumjodid (PI) att användas med de beskrivna färgningsmetoder beroende på panel av antikroppar som används. För närvarande finns det också ett antal fixeras döda celler fläckar som finns som gör att färgade celler som skall fastställas och permeabiliseras utan att förlora förmågan att diskriminera lönsamheten (Invitrogen). Totalt sett andra färgningstekniker är också viktiga för korrekt flödescytometrianalys. Till exempel, i detta protokoll, tillåter användningen av 96-brunnars V-bottnade plattor för små, koncentrerade volymer av celler och reagens som skall användas för analys av MDSC och leukocyt procenttal med hjälp av flödescytometri. Användningen av Master Mix (MM) tillvägagångssätt är också en betydande teknik för lika immunofluorescens märkning av leukocyter i små volymer med antingen 96-brunns V-botten PLates eller FACS rör. Dessa tekniker minskar risken för korskontaminering av prov, bibehålla sterila antikroppar och minska mängden av reagens som används och antikroppar.

Den autoMACS Pro Separator möjliggör effektiv och automatiserad isolering av cellpopulationer från flera prover, i alla arter. I detta protokoll är indirekt magnetiska märkning av leukocyter med Gr-1-PE-antikroppar och magnetiska PE mikrokulor används för autoMACS anrikning av Gr-1 + leukocyter. Detta förfarande kan modifieras för autoMACS separation med användning av Mikrokorn till andra fluorokromkonjugerade, biotinylerade och icke-konjugerad primära antikroppar för anrikning av olika cellpopulationer 20. Men i detta förfarande, rekommenderar vi att du använder PE-konjugerade antikroppar och anti-PE-mikrokulor i motsats till FITC till exempel, som PE-molekylen sägs ha flera bindningsställen, vilket resulterar i starkare och bättre magnetiska märkning (Miltenyi Biotec ). En annan possible ändringar till detta protokoll är användningen av direkt magnetisk märkning eftersom det finns en mängd olika Mac-datorer Mikropärlor för isolering av humana, mus och leukocyter råtta (Miltenyi Biotec). Tillåter dock indirekt magnetiska märkningen med hjälp av en fluorokromkonjugerade primär antikropp för flödescytometri utvärdering av anrikade eller utarmade leukocyt fraktioner utan behov av ytterligare färgning. Det finns också en mängd olika MACS Separatorer tillgängliga men autoMACS Pro Separator System är fördelaktigt eftersom det möjliggör snabb, automatiserad sortering av upp till sex prover för skonsam urval av mycket livskraftiga leukocyter, i jämförelse med manuella MACS separatorer. Men manuella MACS Separatorer är lämpliga alternativ till autoMACS Pro Separator, om tillgängligt. För att ytterligare berika naiva Gr-1 + leukocyter, en risk för modifiering till detta protokoll skulle vara att köra om positivt uppsamlade fraktionen med en ny autoMACS kolumn på autoMACS Pro Separator. Anrikningav Gr-1 + tumör-bärande leukocyter med hjälp av autoMACS Pro Separator rekommenderas inte i detta protokoll eftersom detta resulterar i betydande minskning av återvinning av GR-1 fraktioner eftersom dessa celler tenderar att fastna kolumnerna under anrikning i jämförelse med naiva leukocyter . Därför rekommenderar detta protokoll starkt samla tumör-bärande leukocyter för efterföljande FACS sortering av viabla MDSC.

Pre-berikad, slogs samman naiva leukocyter och slås samman tumör-bärande leukocyter kan användas för framtida tillämpningar såsom låg hastighet FACS sortering för isolering av MDSC populationer. Detta protokoll är speciellt utformad för att kringgå tråkiga och snabb FACS sortering av MDSC från naiva möss, vilket beror på att betydligt lägre procent av MDSC. AutoMACS anrikning av Gr-1 + leukocyter från naiva möss tillåter sedan för snabba, bekväm och effektiv FACS-sortering av livsdugliga och funktionella MDSC för deras användning i in vivo-ochförsök in vitro. Direkt sortering av obetydliga uttryck cellpopulationer som naiv MDSC är en mycket ineffektiv process med långa sortera tider, höga kostnader och minskad cell-återhämtning och livskraft. Beredning och autoMACS anrikning av Gr-1 + leukocyter från naiva möss tar cirka 45 minuter och ökar MDSC procentsatser är högre än 4-faldig (Figur 1). Denna anrikning minskar tiden för FACS-sortering från ca 12 timmar för icke-anrikade leukocyter till ca 20-30 minuter för isolering av minst 1x10 6 livskraftiga, anrikad MDSC från sammanslagna naiva leukocyter. Emellertid FACS-sortering av livsdugliga MDSC från icke-anrikade poolade leukocyter från tumörbärande möss kommer att kräva mindre tid på grund av en ökad förekomst av MDSC procenttal som svar på tumörbelastning. Det är viktigt att notera att sorterade MDSC och andra leukocyter sedan kan användas i båda funktionella analyser, såsom blandade leukocytreaktioner (MLR) in vivo adoptiv transfer experiment 21 samt i icke-funktionella analyser, inklusive QRT-PCR 22, Western Blot 23 och Cytospin / analyser mikroskopi 14. Sammantaget kan detta protokoll ändras för immunfenotypning och berikande av immunsuppressiva och andra leukocyter från lymfoida vävnader eller perifert blod från möss, råttor och människor som kan användas i en mängd in vivo och in vitro-analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi erkänner USF Flow Facility Cytometry Core. Vi vill tacka Dr Denise Cooper för att dela resurser. Vi vill också tacka Maya Cohen, Laura Pendleton och Diana Latour för deras hjälp med att upprätta och inspelningen av denna video. NN med stöd av NSF FG-LSAMP Bridge till doktorsexamen Fellowship HRD # 0.929.435. Detta arbete har finansierats av American Cancer Society institutionell forskning Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center tilldelas TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics