Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Bioengineering
 

Summary

Isotachophorèse (PTI) est une séparation solide électrocinétique et de la technique de préconcentration avec des applications allant de la détection de la toxine à la préparation des échantillons. Nous passons en revue les principes physiques de l'ITP et la méthodologie de l'application de cette technique à deux exemples d'applications spécifiques: la séparation et la détection de petites molécules et de purification des acides nucléiques à partir de lysat de culture cellulaire.

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Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

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Abstract

Techniques électrocinétiques sont un aliment de base des applications à micro-en raison de leur capacité unique d'effectuer une variété de processus fluidiques et électrophorétique dans des systèmes simples et compacts sans pièces mobiles. Isotachophorèse (PTI) est une technique simple et très robuste qui peut atteindre électrocinétique de séparation 1,2 million de fois préconcentration et efficace et d'extraction basée sur la mobilité ionique. 3 Par exemple, nous avons démontré l'application du PTI à la séparation et la détection sensible de non marqué molécules ioniques (par exemple les toxines, de l'ADN, d'ARNr, miRNA) avec peu ou pas de préparation de l'échantillon 4-8 et à l'extraction et la purification des acides nucléiques à partir des matrices complexes, y compris la culture cellulaire, de l'urine et le sang. 9-12

PTI réalise focalisation et de séparation utilisant un champ électrique appliqué et deux tampons de canal dans un système fluidique. Pour les analytes anioniques, le premier électrolyte (LE) tampon est choisi sette que ses anions ont une plus grande mobilité électrophorétique effective que les anions de l'électrolyte de fuite (TE) du tampon (mobilité efficace décrit la vitesse de dérive observable d'un ion et prend en compte l'état d'ionisation de l'ion, tel que décrit en détail par Persat et al . 13). Après l'établissement d'une interface entre les électrodes en tungstène et LE, un champ électrique est appliqué de telle sorte que les ions LE s'éloigner de la région occupée par des ions TE. Ions de l'échantillon de la race la mobilité efficace intermédiaire avant d'ions TE, mais ne peut pas dépasser ions LE, et aussi ils se concentrent à l'interface LE-TE (ci-après dénommé l '«interface ITP"). En outre, le TE et les zones de formulaire de la conductivité LE respectivement basse et haute, qui établissent un gradient de champ raide électrique à l'interface ITP. Ce gradient de champ des pré-espèces des échantillons car ils se concentrent. Le bon choix des résultats TE et LE dans la focalisation et la purification des espèces cibles à partir d'autres non-ciblées espèces et, finalement, la séparation uneségrégation des espèces d-échantillon.

Nous revoyons ici le PTI physique principes qui sous-tend et de discuter de deux modes de fonctionnement: standard "de pointe" et "plateau" modes. En mode de pointe, relativement diluée ions de l'échantillon se concentrer ensemble au sein de chevauchement des pics étroits à l'interface ITP. En mode plateau, ions de l'échantillon plus abondantes atteindre une concentration en régime permanent et séparer en adjacentes plateau-comme zones ordonnées par leur mobilité efficace. Modes de pointe et le plateau se posent sur les mêmes sous-jacents de physique, mais représentent des régimes distincts différenciés par la concentration de l'analyte initiale et / ou la quantité de temps alloué pour l'accumulation de l'échantillon.

Nous avons d'abord décrire en détail une expérience en mode modèle de pointe et alors démontrer un essai en mode de pointe pour l'extraction des acides nucléiques à partir de E. la culture de cellules Escherichia. Nous concluons en présentant une analyse en mode plateau, où nous utilisons un non-focalisation traceur (NFT) espèces de visualiser la séparation et parformer quantification d'acides aminés.

Protocol

1. Physique de l'ITP

ITP forme une frontière nette entre les ions en mouvement de comme la charge. La technique peut être réalisée avec des échantillons anioniques ou cationiques, mais nous adaptons cette introduction à ITP anionique et notez les mêmes principes s'appliquent à ITP cationique. Nous choisissons LE tampons et TE tels que les ions ont une plus grande ampleur LE mobilité effective électrophorétique. Le efficace mobilité électrophorétique, μ = U / E, est la constante de proportionnalité entre champ électrique appliqué, E, et la vitesse de dérive d'ions, U. 13 On établit une interface entre la diffuse LE et TE et appliquer un champ électrique dirigé du haut- LE conductivité zone à la zone à faible conductivité TE. Le système établit rapidement un fort gradient de champ électrique à l'interface ITP, en raison du profil de conductivité non uniforme. Comme par son nom (du grec, "isos" signifie "égal", "Takhôs» signifie «vitesse»), TE et LE ions se déplacent à la même chose, avez uniformelocity, à la suite du champ électrique non uniforme et la conservation du courant (c'est le soi-disant "PTI", voir figure 1).

L'interface ITP est auto-affûtage: LE ions qui diffusent dans l'expérience TE zone un flux forte rétablir et revenir à la zone d'attaque (et vice-versa pour les ions TE dans la zone LE). Focaliser les ions d'échantillon à cette interface si leur mobilité effective dans la zone TE est plus grande que celles des co-TE ions, et si leur mobilité effective dans la zone LE est inférieure à celle des LE co-ions (voir figure 1). L'auto-affûtage et en se concentrant propriétés de l'ITP de contribuer à la robustesse de cette technique et de faire ITP relativement insensible aux perturbations de l'interface (par exemple due à la pression axée sur le débit ou des changements dans la géométrie, tels que les contractions, les expansions et les virages).

En pic de mode ITP (voir figure 2a et Vidéos 1-2), les concentrations d'ions d'échantillon sonten tout temps nettement inférieur à celui LE et TE concentrations d'ions et donc de contribuer de façon négligeable à la conductivité locale. La distribution d'ions de l'échantillon est déterminée par l'interface auto-affûtage entre les zones voisines (ici TE et LE) et la valeur de la mobilité effective de l'échantillon par rapport à ces zones. 14 ions de l'échantillon multiples mise au point dans la même région d'interface selon PTI étroite largement chevauchement des pics. Les largeurs d'interface et de crête, ainsi que le facteur de préconcentration associé, en sens inverse de l'échelle du courant appliqué (voir expériences de la figure 2b). 14

Pour suffisamment fortes concentrations de l'échantillon initial et le temps d'accumulation suffisante, ions de l'échantillon atteint une valeur seuil de concentration. Pour entièrement ionisés espèces, cette valeur est déterminée par la fonction de régulation Kohlrausch (KRF) 15. Pour les électrolytes faibles, elle est déterminée par les fonctions Alberty et Jovin. 16,17 En plateaumode, comme le montre la figure 3 et de la vidéo 3, ions de l'échantillon séparer et purifier dans des zones de concentration localement uniforme et constante dans un ordre déterminé par leur mobilité efficace. Ions très diluées peut se concentrent encore en pointe entre les zones du plateau. Dans le PTI, ions de l'échantillon peut être introduit dans une injection finie entre la TE et LE (voir Figure 3) ou alternativement mélangés avec le TE et / ou LE (voir Figure 2). On se réfère à mélanger dans la zone TE «semi-infinie» d'injection, qui peut être utilisé pour accumuler des ions d'analyte en continu. D'accumulation d'échantillons en continu augmente la sensibilité à la fois de pointe et des tests en mode plateau. Cependant, les injections finis sont plus fréquents en mode plateau. C'est probablement parce que de fortes concentrations d'analytes initiales dans les régions semi-infinie d'injection peut sensiblement augmenter la conductivité TE et des taux plus faibles de focalisation. En outre, la purification complète n'est pas possible dans une semi-infinie d'injection (car il remains une concentration finie dans TE).

2. Dispositif de nettoyage et de préparation

Pour les essais présentés dans ce protocole que nous utilisons isotrope humide gravé (section transversale sensiblement en forme de D) les éclats de verre microfluidiques avec un design cross-canal (voir figure 1). Le nettoyage qui suit et le protocole de préparation est optimisé pour les canaux de silice fondue et de borosilicate, mais peut également être utilisé avec de verre / PDMS puces. Effectuez cette procédure de nettoyage avant les expériences afin d'assurer l'écoulement à fonctionner répétabilité et de l'application réussie de revêtements dynamiques nécessaires pour supprimer le flux électroosmotique (EOF). L'omission de ce protocole peut entraîner une forte dispersion de l'interface ITP 14.

  1. Pour décontaminer le canal, remplissez le Nord, Est, Sud et réservoirs avec 10-20 ul d'eau de Javel à 10% et appliquer le vide au niveau du réservoir de l'Ouest pendant 2 min. Si vous utilisez une norme Caliper puce cadet, le vide peut être effectivement appliquée par simple attaching de l'extrémité large d'un pL 200 (non filtré) pointe de pipette dans le réservoir à puce et reliant la ligne de vide à un tube 2 mm de diamètre intérieur.
  2. Videz les réservoirs et rincer le canal (comme dans l'étape 1) avec 1 M d'hydroxyde de sodium pendant 2 min. Cette décape délicatement les parois du canal, ce qui donne une surface propre borosilicate pour aider à établir les propriétés de surface uniformes.
  3. Vider les réservoirs et propre avec de l'eau désionisée (DI), puis rincer le canal avec LE pour ~ 2 min. Pendant cette période de propriétés de surface et des revêtements dynamiques s'équilibrer l'intérieur du canal.

3. Fluorophore en se concentrant pic de mode PTI

  1. Préparer une ml LE constitué de 100 mM de HCl, 200 mM de Tris, et 1% de PVP.
  2. Préparer 1 ml TE composé de 100 mM d'HEPES et 200 mM tris. Mélanger 90 ul de TE avec 10 pi de 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488).
  3. Après rinçage avec LE tel que décrit dans la partie 2, videz le réservoir et nettoyez-Ouest à quelques reprises avec DI ouder à diluer toute LE restant dans le réservoir. Remplissez ce réservoir avec 20 ul de TE contenant AF488.
  4. Placez l'électrode positive dans le réservoir-Orient et le sol (négatif) d'électrode dans le réservoir de l'Ouest et appliquer 2 mA (courant constant). Le pic de l'échantillon va migrer à une vitesse constante à partir du réservoir de l'Ouest à l'Est du réservoir (voir figure 1) et la tension entre ces réservoirs augmentera à mesure que la conductivité inférieure TE remplit le canal.

4. Extraction et de purification d'acides nucléiques à partir de culture E. coli

La capacité à se concentrer sélectivement les espèces ioniques permet ITP une technique idéale pour la préparation des échantillons biologiques. On purifier des acides nucléiques à partir de lysat cellulaire non traité par la sélection d'un anion de fuite avec une amplitude de mobilité efficace inférieure à la cible d'acide nucléique mais supérieure à inhibiteurs de PCR co-ionique (par exemple détergents anioniques, les protéines, et les solvants organiques, même s'ils sont présents dans salutla concentration de GH). Cationique inhibiteurs de PCR (p.ex. métaux alcalins et des protéines cationiques et des détergents) migrer dans le sens inverse et sont donc également à la traîne. ITP extrait et concentre des acides nucléiques cibles à partir du réservoir de l'échantillon, tout en laissant plus lents PCR inhibiteurs espèces derrière (voir Figure 4).

  1. Obtenir un échantillon de la culture ou E. des cellules de E. à une densité supérieure à 10 8 CFU / ml.
  2. Transférer 1 ml de culture de cellules dans un tube de microcentrifugeuse Safe-Lock et le culot par centrifugation à 4000g pendant 6 min.
  3. Re-suspendre le culot dans 80 ul d'eau sans RNase et ajouter 10 ul de agent de lyse constitué de 10 tricine, 10 mM de bis-tris, 2 mM d'EDTA, 0,1% de Triton-X, et 5 mg / ml de lysozyme. Mélanger doucement et incuber pendant 5 minutes. à température ambiante (protocole de lyse adapté de Bercovici et al. 11).
  4. Ajouter 10 uL d'hydroxyde de sodium 1 M pour élever le pH lysat à ~ 12,5. Doucement actionner la pipette de haut en bas jusqu'à ce quela solution devient limpide, au cours de laquelle le point de lyse est complète.
  5. Moissonneuse 10 pl de lysat avec 90 pL à 50 tricine mM et 100 mM bis-tris. Cette solution peut maintenant être utilisé en tant que TE.
  6. Préparer 1 mL de LE composé de 500 mM bis-tris, 250 mM HCl, 1% de PVP, et 1X SYBR Green II. Remplir la puce microfluidique avec LE tel que décrit dans la partie 3.
  7. Afin d'extraire l'acide nucléique purifié pour hors-puce d'analyse à la suite ITP, remplacez le contenu du réservoir-Orient avec une PCR LE-compatible contenant 50 mM Bis-Tris, 25 mM HCl, et 0,1% de PVP. Appliquer 1000 V entre l'Est et l'Ouest puits pour commencer l'expérience. Le courant entre ces réservoirs va diminuer.
  8. A la fin de l'expérience de l'échantillon élue dans le réservoir LE. Parallèlement à cette élution, le temps en fonction du courant pour ce système atteint généralement une valeur plateau (car la résistance est désormais dominé par des ions TE uniformément réparties dans le canal). Mélanger délicatement le réservoircontenu par pipetage répété et extraire un volume de 5 ul pour l'analyse par RT-PCR quantitative.

5. Séparation des acides aminés avec cationique mode de plateau ITP et non se concentrer traceur (NFT) pour la visualisation

ITP peut être utilisée pour séparer et de se concentrer petits ions en plateaux attenante et détectable entre la TE et LE. Cela permet la détection et l'identification basée sur les propriétés physico-chimiques, telles que la conductivité locale, absorbance UV, détection de la température, ou d'un indice de réfraction. Ici montrer une non-focalisation traceur (NFT) où un dosage fluorescente, co-ionique espèces est ajouté à la LE. Cette espèce fluorescente ne se concentre pas, mais sa concentration s'adapte à un champ électrique local et permet ainsi la visualisation des zones de plateau purifiés (voir Figure 5).

  1. Préparer une ml LE constitué de 100 mM d'éthanolamine, 200 tricine mM, et 1% de PVP, et 100 pM du rhodamine 6G fluorophore cationique.
  2. <li> Préparer 1 ml TE constitué de 20 mM de tris, 40 mM de tricine. Préparer l'échantillon en mélangeant 90 pl de TE avec 10 pL chacun l'arginine 50 mM et 50 mM de lysine.
  3. Déposer 20 ul LE dans l'Ouest et du Nord réservoirs et des échantillons dans le réservoir-Orient. Appliquez le vide au réservoir du Sud pendant 1 min.
  4. Rincer le Moyen-bien avec DI et le remplacer par TE (TE sans échantillon).
  5. Appliquer 500 V entre l'Orient et l'Occident réservoirs.

6. Les résultats représentatifs

Nous montrons isotachopherograms d'expériences de pointe dans le mode Figure 2b et expériences d'extraction des acides nucléiques dans la figure 4. Dans les expériences de mode de pointe avec un rapporteur fluorescent (par exemple AF488, SYBR Green II), l'intensité globale de fluorescence peuvent être intégrés et comparés à une courbe d'étalonnage pour obtenir des informations quantitatives de concentration 12. En outre, dans les expériences d'extraction des acides nucléiques, l'échantillon est autorisé à éluer en til LE réservoir et extrait avec une pipette pour l'analyse par RT-PCR quantitative. 10,12 Nous montrons isotachopherograms mode plateau pour la séparation d'acides aminés dans la Figure 5. L'intensité de fluorescence (par rapport à LE TE ou zone d'intensité) peut être utilisé pour la zone d'identification, tandis que la largeur des zones de permettre la quantification.

Figure 1.
Figure 1. Isotachophorèse (PTI) est une technique électrocinétique utilisés dans des applications microfluidiques pour la détection sensible et la séparation des ions. ITP propose de séparation, mise au point sélective, et les capacités de préconcentration. En outre, il est extrêmement robuste et insensible aux perturbations physiques en raison de sa nature auto-affûtage. Focaliser de manière sélective des ions d'échantillon entre un électrolyte d'attaque (LE) et arrière (TE) et les déplacements par l'intermédiaire du micro-canal à une vitesse constante déterminée par la vitesse des ions de premier plan dans la zone LE. Ions de l'échantillonconcentrer si leur mobilité électrophorétique effective est encadrée par la mobilité effective des ions LE et TE. Le schéma représente une expérience ITP modèle où l'échantillon se concentre en permanence entre la LE et zones TE.

Figure 2.
Figure 2. Diluer l'échantillon des ions accent en mode "pic" ITP. a) Deux distincte diluée (c échantillon << c LE) mettent l'accent espèces en régime de pointe à l'interface formée entre la LE et zones TE. Exclusivement le LE et TE déterminer le champ électrique, comme des espèces de l'échantillon ne contribuent pas sensiblement à courant. Ions de l'échantillon sont mélangés avec TE (en une injection semi-infini) et de se concentrer ensemble dans un pic d'environ gaussien à l'interface ITP. Mise au point critère (montré que les inégalités) s'applique à des espèces fortement ionisés. b) des expériences montrant Alexa Fluor 488 (AF488) a porté en pointe pour une gamme de courants appliqués (voir aussi Video 1). La largeur de crête de l'échantillon est inversement proportionnel au courant (pour la dispersion d'advection négligeable due à l'écoulement électro-osmotique). 14 L'interface auto-affûtage est résistant à la dispersion due à la pression-débit entraînée (voir vidéo 2).

Figure 3.
Figure 3 ions exemples. À un foyer de concentration suffisamment élevée en mode "plateau" et gouverner conductivité locale. En général, nous introduire des ions d'échantillon dans une injection finie entre la TE et LE. Dans cette modalité, ions de l'échantillon distinct de l'ordre en fonction de leur mobilité électrophorétique effective (voir vidéo 3). Pour les espèces fortement ionisés, TE et du plateau de zone sont les concentrations déterminées par la fonction de régulation de Kohlrausch (KRF, un ensemble invariable initialement par la zone LE). Diluer ions continuer à se concentrer en mode crête entre le plateau de zones de bracketing de leur mobilité effective. Mise au point cRITÈRE (montré que les inégalités) s'applique à des espèces fortement ionisés.

Figure 4.
Figure 4. Lysat préparation et d'extraction d'acide nucléique avec ITP mode crête. L'acide nucléique est extrait de E. coli en utilisant la culture cellulaire lysozyme assistée par lyse alcaline et purifié par électrophorèse focalisation sélective par l'intermédiaire d'ITP. TE mélangé avec lysat (brun) contient de l'acide nucléique cible (verte), les protéines, et d'éventuels inhibiteurs de PCR chimies. Une sélection appropriée des arrière et avant ions permet focalisation sélective de l'acide nucléique cible, tout en laissant derrière inhibiteurs de PCR. Totale d'acide nucléique de pointe ITP prend souvent une forme non-idéale, comme le montre ici, à l'image en médaillon. Comme une démonstration de ce test, nous avons extrait total de l'acide nucléique à partir bactéries gram-négatives, Escherichia coli (lysées avec une solution d'hydroxyde de sodium seul), purifié à partir du lysat NA en utilisant ITP, recueilliesl'. extrait le matériel génétique, et de réaliser des analyses QRT-PCR afin de vérifier la purification réussie de l'ARNr 16S (rouge) et l'ADNr 16S (vert) à partir de culture bactérienne Négatifs des cycles seuils de contrôle pour l'ARNr 16S (bleu) et l'ADNr 16S (jaune) ont chacun 30 ci-dessus cycles. Nous avons effectué qRT-PCR en utilisant Puissance SYBR Green ARN-to-C T 1-Step Kit d'Applied Biosystems avec 150 nM à terme (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) et inverse (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) amorces, dans les conditions recommandées de cyclage thermique.

Figure 5.
Figure 5. Non-focalisation traceur (NFT) de dosage pour la séparation et la détection des acides aminés non étiquetés. a) Schéma de l'essai NFT. Une injection fini de ions de l'échantillon est introduit dans le canal de Est. Nous mélangeons la LE avec un traceur fluorophore cationique avec une mobilité effective plus faible que les ions TE (traceur μ μ <TE). Le fluorophoreOn dit d'agir comme un «traceur underspeeding". Comme le fluorophore electromigrates de la LE en zones actuellement occupées par des plateaux de l'échantillon et TE, il éprouve un champ électrique supérieur et donc sa concentration augmente. Ce changement dans la concentration crée pas dans la isotachopherogram. b) Séparation des deux acides aminés, de l'arginine et la lysine, de l'aide du test avec NFT rhodamine 6G que le traceur underspeeding fluorescente. Le léger pic entre TE et l'arginine est commun dans le PTI, n'est pas bien comprise, et ne pas interférer avec ici détection ou de quantification sur les plateaux.

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Discussion

Les méthodes présentées ici ITP permettre la détection rapide, sensible et robuste et la manipulation des molécules ioniques. Le principal défi dans l'utilisation de PTI est un choix approprié de tampons LE et TE. Dans le PTI anionique, nous choisissons généralement que l'anion chlorure de premier plan, car il est un acide fort avec une mobilité absolue très élevée et donc a des propriétés très prévisibles. Par conséquent, le choix de mémoire tampon dans anionique ITP est généralement réduit à choisir un bon TE et contre-ion. Pour sélectifs des expériences axées, le choix TE est essentiel à l'exclusion de contamination des ions. Dans les applications où les contaminants ne sont pas présents, inférieure TE mobilité efficace accélère le taux de mise au point. Nous vous recommandons d'utiliser ce qui suit, relativement bien comportés-anioniques ions TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Choix de contre-ion affecte à la fois le pH du système et TE de mobilité efficace. Contre-courants sont tris (pKa 8,1) et de bis-tris (pKa 6,4). Pour les essais nécessitant un pH inférieur ou supérieur, nous vous recommandons la pyridine (pKa 5,25) etéthanolamine (pKa 9,5), respectivement. Dans les tableaux 1 et 2, pour le PTI anioniques et cationiques, respectivement, nous résumons plusieurs exemples de tampons utiles. Nous prenons HCl comme l'ion anionique LE et de sodium comme ions cationique LE, et nous n'assumons 100 mm Résistance ionique du tampon LE.

Le lecteur notera que la force ionique du tampon dans nos protocoles (et dans les tableaux 1-2) est toujours supérieure ou égale à 10 mM. Si, en théorie de la physique des ITP s'applique à une force ionique inférieure à 10 mM, contaminants naturels (par exemple l'acide carbonique provenant de la réaction entre l'eau et du dioxyde de carbone atmosphérique) près du niveau 1 mM limitent souvent l'utilisation pratique de faibles tampons de force ionique.

Nous notons que le mécanisme de transduction du signal ne se limite pas aux essais présentés dans ce protocole. Comme nous l'avons brièvement dans la partie 5, en mode plateau purifié zones peuvent être détectées par les changements de conductivité locale, ABSORPTION UVBance, la température, ou d'un indice de réfraction. Dans notre propre groupe, nous avons développé une méthode qui utilise des ampholytes porteurs fluorescents pour la détection sensible et l'identification des analytes inconnus. 5 Dans des expériences de mode de pointe, des sondes spécifiques peuvent être utilisés pour étiqueter les analytes ciblés. Dans un exemple, nous utilisons des balises moléculaires - des sondes oligonucléotidiques qui sont fluorescents lors de l'hybridation à leur séquence cible - pour détecter l'ADN cible ou des molécules d'ARN avec une grande spécificité 11,18.

Bien que le PTI est relativement robuste à la dispersion causée par la pression axée débit et EOF, EOF excessive peut conduire à la stagnation de l'interface ITP, où la vitesse moyenne EOF devient égale à la vitesse ITP 14. EOF Cette forte se produit surtout dans des conditions de pH élevé et la force ionique faible. Pour cette raison, nous recommandons l'utilisation de tampons avec un pH de 8 ou moins, et avec la force ionique de l'ordre de 100 mm si commode. Dans notre expérience, PVP est leplus de revêtement efficace pour la suppression EOF en jetons de borosilicate. Toutefois, en raison de ses propriétés de tamisage, le PVP peut ne pas être approprié pour certaines applications, telles que se concentrer l'ADN génomique. Dans les expériences, nous observons que l'ajout de PVP peut réduire considérablement la mobilité ADN génomique absolue (au point où il ne se concentre pas). Dans ces cas, un revêtement silanol tels que Sigmacote en conjonction avec un agent tensio-actif (par exemple Triton X-100) peut également être efficace dans la réduction de EOF 10.

Anion TE (pKa -1)
Contre-ion tampon (pKa +1) MES (6,10) MOPS (7,20) HEPES (7,50) tricine (8.15)
éthanolamine (9.50) 21,41 20,40 17,38 22,85
tris (8,08) 21,00 19,23 </ Td> 15,84 17,56
bis-tris (6,40) 18,22 10,41 7,30 5,23
pyridine (5.18) 1,01 3,72 2,42 1,48

Tableau 1. L'ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP anionique où la LE est de 100 mm et 200 contre-HCl tampon mM.

Cation TE (pKa +1)
Contre-ion tampon (pKa -1) éthanolamine (9.50) tris (8,08) bis-tris (6,40) pyridine (5.18)
MES (6,10) 35,57 21,96 16,39 10,45
MOPS (7.20) 35,47 20,92 9,76 3,93
HEPES (7,50) 35,35 19,97 7,77 2,88
Tricine (8.15) 34,77 16,72 4,50 1,44

Tableau 2. L'ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP cationique où le LE est de 100 mM de sodium et 200 mM tampon contre-ion.

Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le financement de la DARPA parrainé Micro Focus / Nano Fluidics Fundamentals (MF3) Centre sous le numéro N66001-10-1-4003, et de la DARPA subvention N660001-09-C-2082.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78, (7), 2319-2319 (2006).
  2. Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79, (1), 345-345 (2007).
  3. Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. (1976).
  4. Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80, (1), 279-279 (2008).
  5. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82, (5), 1858-1858 (2010).
  6. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82, (5), 2134-2134 (2010).
  7. Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10, (17), 2242-2242 (2010).
  8. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, (8), 3022-3022 (2009).
  9. Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9, (15), 2145-2145 (2009).
  10. Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81, (22), 9507-9507 (2009).
  11. Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83, (11), 4110-4110 (2011).
  12. Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83, (24), 9715-9715 (2011).
  13. Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9, (17), 2437-2437 (2009).
  14. Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1, (1), 1-1 (2011).
  15. Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298, (10), 209-209 (1897).
  16. Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72, (6), 2361-2361 (1950).
  17. Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12, (5), 871-871 (1973).
  18. Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. (2011).

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