Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

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Summary

Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

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Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

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Abstract

Elettroforesi su gel di agarosio è il modo più efficace per separare frammenti di DNA di dimensioni variabili da 100 bp a 25 kb 1. Agarosio è isolato dalle alghe generi Gelidium e Gracilaria, e consiste di agarobiose ripetute (L-galattosio e D-) subunità 2. Durante la gelificazione, polimeri agarosio associano in modo non covalente e formare una rete di fasci cui pori formati determinare proprietà molecolari setacciatura di un gel. L'uso di elettroforesi su gel di agarosio rivoluzionato la separazione del DNA. Prima dell'adozione di gel di agarosio, il DNA è stato principalmente separati impiegando densità centrifugazione gradiente di saccarosio, che ha fornito solo un'approssimazione di dimensioni. Per separare DNA usando elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene caricato in prefabbricati pozzetti nel gel e una corrente applicata. Lo scheletro di fosfato del DNA (e RNA) molecola è caricato negativamente, quindi quando posti in un campo elettrico, frammenti di DNA migrerà al positively carica anodo. Poiché il DNA ha una massa uniforme / carica rapporto, molecole di DNA vengono separati da una dimensione in un gel di agarosio in uno schema tale che la distanza percorsa è inversamente proporzionale al log del suo peso molecolare 3. Il modello importante per il movimento DNA attraverso un gel di agarosio è "polarizzato reptation", per cui il bordo si muove in avanti e tira il resto della molecola lungo 4. La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel è determinata dalla seguente: 1) dimensione della molecola di DNA; 2) concentrazione di agarosio; 3) DNA conformazione 5; 4) tensione applicata, 5) presenza di bromuro di etidio, 6) Tipo di agarosio e 7) tampone di elettroforesi. Dopo la separazione, le molecole di DNA possono essere visualizzati sotto luce UV dopo colorazione con un colorante appropriato. Seguendo questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di:

  1. Comprendere il meccanismo mediante il quale vengono separati frammenti di DNA all'interno di una matrice gel
  2. Capire come conformazione delMolecola di DNA a determinare la sua mobilità attraverso una matrice di gel
  3. Identificare una soluzione di agarosio di concentrazione adeguato alle loro esigenze
  4. Preparare un gel di agarosio per elettroforesi su campioni di DNA
  5. Sistemare il dispositivo di elettroforesi su gel e alimentazione
  6. Selezionare una tensione appropriata per la separazione di frammenti di DNA
  7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale permette di bromuro di etidio per la visualizzazione delle bande di DNA
  8. Determinare le dimensioni dei frammenti di DNA separati

Protocol

1. Preparazione del gel

  1. Pesare la massa appropriato di agarosio in una beuta. Gel di agarosio sono preparati con p / v soluzione di percentuale. La concentrazione di agarosio in un gel dipenderà dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare, con la maggior parte gel comprese tra lo 0,5% -2%. Il volume del buffer non deve essere superiore a 1/3 della capacità del pallone.
  2. Aggiungere tampone di corsa alla agarosio contenente pallone. Mescolare. Il gel più comune buffer di esecuzione sono TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
  3. Sciogliere l'agarosio / buffer miscela. Questo è più comunemente fatto da riscaldamento in un forno a microonde, ma può anche essere eseguita su una fiamma Bunsen. A intervalli di 30 s, togliere i il contenuto della beuta e agitare bene. Ripetere fino l'agarosio si è completamente sciolto.
  4. Aggiungere etidio bromuro (EtBr) ad una concentrazione di 0,5 ug / ml. In alternativa, il gel può anche essere tinta dopo elettrophoresis in esecuzione tampone contenente 0,5 mg / ml EtBr per 15-30 min, seguito da decolorazione in tampone di corsa per la stessa durata di tempo.

Nota: EtBr è un sospetto cancerogeno e devono essere adeguatamente smaltite da regolamento dell'istituzione. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano gel contenenti EtBr. Coloranti alternativi per la colorazione del DNA sono disponibili, ma EtBr rimane il più popolare grazie alla sua sensibilità e il costo.

  1. Lasciare raffreddare agarosio sia sul piano del banco o da incubazione in un bagno di acqua 65 ° C. In caso contrario, sarà deformare la mascherina.
  2. Collocare il vassoio gel nell'apparato casting. In alternativa, si può anche fissare le estremità aperte di un vassoio gel per creare uno stampo. Inserire un pettine appropriato nello stampo gel per creare i pozzi.
  3. Versare l'agarosio fuso nello stampo gel. Lasciare il agarosio per impostare a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e posizionare il gel nella casella gel. In alternativa, la gel può anche essere avvolto nella pellicola e conservati a 4 ° C fino all'uso (Fig. 1).

2. Approntamento delle apparecchiature Gel e separazione di frammenti di DNA

  1. Aggiungere colorante di caricamento dei campioni di DNA da separare (Fig. 2). Gel loading dye è tipicamente effettuata concentrazione 6X (0,25% blu di bromofenolo, cyanol xilene 0,25%, 30% glicerolo). Loading dye aiuta a tenere traccia di quanto il campione di DNA ha viaggiato, e permette anche il campione ad affondare nel gel.
  2. Programma l'alimentazione a tensione desiderata (1-5V/cm tra gli elettrodi).
  3. Aggiungere tampone di corsa sufficiente a coprire la superficie del gel. È importante utilizzare lo stesso buffer esecuzione come quello utilizzato per preparare il gel.
  4. Collegare i cavi della scatola gel alla rete elettrica. Accendere l'alimentazione e verificare che sia casella di gel e l'alimentazione stanno lavorando.
  5. Togliere il coperchio. Lentamentee accuratamente caricare il campione di DNA (s) nel gel (Fig. 3). Un appropriato marcatore di dimensioni DNA dovrebbe sempre essere caricato con campioni sperimentali.
  6. Sostituire il coperchio alla scatola gel. Il catodo (cavi neri) dovrebbe essere più vicino ai pozzi che l'anodo (cavi rossi). Doppio controllare che gli elettrodi sono collegati alle apposite fessure nella sezione di alimentazione.
  7. Accendere l'alimentazione. Eseguire il gel fino a quando il colorante è migrata ad una distanza adeguata.

3. Osservando frammenti di DNA separati

  1. Quando elettroforesi ha completato, spegnere l'alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola gel.
  2. Rimuovere il gel dalla scatola gel. Scolare il tampone in eccesso dalla superficie del gel. Collocare il vassoio gel su carta assorbente per assorbire eventuali buffer di più in esecuzione.
  3. Rimuovere il gel dal vassoio gel e esporre il gel a luce UV. Questo è più comunemente eseguita utilizzando un sistema di documentazione gel (Fig. 4). Bande di DNA dovrebbe mostrarecome arancio bande fluorescenti. Scatta una foto del gel (Fig. 5).
  4. Smaltire il gel e tampone di corsa da regolamento dell'istituzione.

4. Risultati rappresentativi

Figura 5 rappresenta un tipico risultato dopo elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR. Dopo la separazione, i frammenti di DNA risultanti sono visibili come bande chiaramente definiti. Lo standard o DNA ladder devono essere separati in una misura che consente la determinazione utile delle dimensioni delle bande del campione. Nell'esempio illustrato, frammenti di DNA di 765 bp, 880 bp e di 1022 bp sono separati su un gel di agarosio 1,5% con un 2-log scala DNA.

Figura 1.
Figura 1. Un gel solidificato agarosio dopo la rimozione del pettine.

Figura 2.
Figura 2. Uno studente l'aggiunta di colorante carico ai suoi campioni di DNA.

Figura 3.
Figura 3. Uno studente caricamento del campione di DNA in un pozzo nel gel.

Figura 4.
Figura 4. Un esempio di un sistema di documentazione gel.

Figura 5.
Figura 5. L'immagine di un posto elettroforesi su gel. EtBr è stato aggiunto al gel elettroforesi prima ad una concentrazione finale di 0,5 ug / ml, seguito da separazione a 100 V per 1 ora. Il gel è stato esposto a luce UV e la foto con un sistema di documentazione gel.

Discussion

Elettroforesi su gel di agarosio ha dimostrato di essere un modo efficiente ed efficace di separare acidi nucleici. Elevata forza di gel di agarosio permette per la movimentazione di gel basse percentuali per la separazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni. Setacciatura molecolare viene determinata dalla dimensione di pori generati dai fasci di agarosio 7 nella matrice gel. In generale, maggiore è la concentrazione di agarosio, minore è la dimensione dei pori. Tradizionali gel di agarosio sono più efficaci alla separazione dei frammenti di DNA da 100 bp e 25 kb. Per separare frammenti di DNA più grandi di 25 kb, si dovranno usare elettroforesi su gel di impulsi di campo 6, che consiste nell'applicazione di corrente alternata da due diverse direzioni. In questo modo i frammenti più grandi di DNA di dimensioni sono separati dalla velocità con cui si riorientare con i cambiamenti di direzione della corrente. Piccoli frammenti di DNA di 100 bp sono più efficacemente separati usando elettroforesi su gel di poliacrilammide. A differenza digel di agarosio, la matrice di gel di poliacrilammide è formato attraverso una reazione radicali liberi chimica condotta. Questi gel sono più sottili di una maggiore concentrazione, sono gestite in verticale ed avere una migliore risoluzione. Nella moderna sequenziamento del DNA elettroforesi capillare viene utilizzato, quale tubi capillari sono riempiti con una matrice di gel. L'impiego di tubi capillari consente l'applicazione di tensioni elevate, consentendo la separazione di frammenti di DNA (e la determinazione della sequenza di DNA) rapidamente.

Agarose può essere modificato per creare fusione basso agarosio attraverso hydroxyethylation. Agarosio a bassa fusione viene generalmente utilizzata quando l'isolamento di frammenti di DNA separati si desidera. Hydroxyethylation riduce la densità di impaccamento dei fasci di agarosio, riducendo le dimensioni dei pori 8. Ciò significa che un frammento di DNA della stessa dimensione avrà più di muoversi attraverso un gel di agarosio a bassa fusione rispetto a un normale gel di agarosio. Poiché i fasci associarsiattraverso interazioni non covalenti 9, è possibile rifondere un gel di agarosio dopo che è impostato.

EtBr è il reagente più comune utilizzato per colorare DNA in gel di agarosio 10. Se esposto a luce UV, elettroni l'anello aromatico della molecola etidio vengono attivati, che porta alla liberazione di energia (luce) come ritorno elettroni allo stato terra. EtBr funziona intercalando stessa nella molecola di DNA in maniera dipendente dalla concentrazione. Ciò consente una stima della quantità di DNA in una banda di DNA particolare sulla base della sua intensità. A causa della sua carica positiva, l'uso del EtBr riduce il tasso di migrazione DNA del 15%. EtBr è un sospetto mutageno e cancerogeno, quindi si deve fare attenzione quando si maneggiano gel di agarosio che lo contengono. Inoltre, EtBr è considerato un rifiuto pericoloso e deve essere smaltito in modo appropriato. Macchie alternative per DNA in gel di agarosio sono SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet e blu metile. Di questi,Metile blu e Crystal Violet non richiedono l'esposizione del gel di luce UV per la visualizzazione delle bande di DNA, riducendo così la probabilità di mutazione se il recupero del frammento di DNA dal gel è desiderata. Tuttavia, la loro sensibilità è inferiore a quello di EtBr. SYBR oro e SYBR green sono entrambi molto sensibili, coloranti uv dipendenti con minore tossicità rispetto EtBr, ma sono notevolmente più costosi. Inoltre, tutti i coloranti alternativi o non può essere o non funzionano bene quando aggiunto direttamente al gel, il gel pertanto dovrà essere tinto posto dopo elettroforesi. A causa dei costi, facilità d'uso e sensibilità, EtBr rimane ancora la tintura di scelta per molti ricercatori. Tuttavia, in determinate situazioni, come ad esempio quando lo smaltimento dei rifiuti pericolosi è difficile o quando i giovani studenti eseguono un esperimento, un colorante meno tossico può essere preferito.

Caricamento dei coloranti utilizzati in elettroforesi su gel risponde a tre obiettivi principali. In primo luogo si aggiunge la densità al campione, Permettendo così di sprofondare nel gel. In secondo luogo, i coloranti fornire colore e semplificare il processo di caricamento. Infine, i coloranti muovono a velocità standard attraverso il gel, consentendo la stima della distanza che frammenti di DNA sono migrati.

Le dimensioni esatte di frammenti di DNA separati può essere determinata tracciando il logaritmo del peso molecolare per diverse bande di DNA standard contro la distanza percorsa da ciascuna banda. Lo standard DNA contiene una miscela di frammenti di DNA di predeterminate dimensioni che possono essere confrontati con i campioni di DNA sconosciuti. È importante notare che diverse forme di DNA muovono attraverso il gel a velocità diverse. DNA plasmidico superavvolto, a causa della sua conformazione compatta, si muove attraverso il gel più veloce, seguito da un frammento di DNA lineare della stessa dimensione, con la forma circolare aperta viaggiare più lenta.

In conclusione, dopo l'adozione di gel di agarosio in 1970 per la separazione del DNA, hadimostrato di essere una delle tecniche più utili e versatili ricerca scienze biologiche.

Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I Amresco 0710
Boric acid Sigma-Aldrich B7901
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
Glycerol Fisher Scientific G33-1
Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

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References

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  2. Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. 9-22 (1991).
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Comments

5 Comments

  1. Well understood................great explanation

    Reply
    Posted by: Muhammad Rizwan A.
    February 27, 2015 - 4:01 PM
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    March 23, 2015 - 7:49 AM
  3. too good

    Reply
    Posted by: Rosella B.
    April 26, 2015 - 10:12 AM
  4. Thank you!

    Reply
    Posted by: Axel W.
    November 30, 2016 - 1:55 AM
  5. very clear thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2017 - 6:11 AM

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