Non-invasiv bildediagnostikk av utbredt candidiasis i sebrafisk Larver

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den raske utviklingen, liten størrelse og gjennomsiktighet sebrafisk er enorme fordeler for studiet av medfødte immunsystemet kontroll av infeksjon

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spres candidiasis forårsaket av patogenet Candida albicans er en klinisk viktig problem i sykehus individer og er forbundet med en 30 til 40% skyldes dødelighet 6. Systemisk candidiasis er normalt kontrolleres av medfødt immunitet, og personer med genetiske defekter i medfødte immunceller komponenter som phagocyte NADPH oksidase er mer utsatt for candidemia 7-9. Svært lite er kjent om dynamikken i C. albicans samspill med medfødte immunceller in vivo. Omfattende in vitro studier har fastslått at utenfor verten C. albicans spirer innsiden av makrofager, og er raskt ødelagt av nøytrofile 10-14. In vitro-studier, men nyttig, ikke kan rekapitulere komplekse in vivo miljø, som inkluderer tidsavhengige dynamikken i cytokin nivåer, ekstracellulære matrix vedlegg og intercellulær kontakter 10, 15-18

Sebrafisk larve tilbyr en unik og allsidig virveldyr vert for studiet av infeksjon. For de første 30 dagene av utvikling sebrafisk larver har bare medfødte immunforsvar 2, 19-21, forenkle studiet av sykdommer som spres candidiasis som er sterkt avhengig av medfødt immunitet. Den lille størrelsen og gjennomsiktigheten sebrafisk larver gjør avbildning av infeksjon dynamikk på cellenivå for både vert og patogen. Transgene larver med fluoriserende medfødte immunceller kan brukes til å identifisere spesifikke celler typer involvert i infeksjon 22-24. Modifiserte anti-sense oligonukleotider (Morpholinos) kan brukes til å slå ned ulike immunologiske komponenter som phagocyte NADPH oksidase og studere endringer i respons til fungal infeksjon fem. I tillegg til de etiske og praktiske fordelene ved å bruke en liten lavere virveldyr, tilbyr sebrafisk larvene en unik mulighet til å avbilde pitched kampen mellom patogen og vert både intravitally og i farger.

Sebrafisk har blitt brukt til å modellere infeksjon for en rekke humanpatogene bakterier, og har vært medvirkende i store fremskritt i vår forståelse av mykobakterielle infeksjon 3, 25. Men bare nylig har mye større patogener som sopp blitt brukt til å infisere larve 5, 23, 26, og hittil har det ikke vært en detaljert visuell beskrivelse av infeksjonen metodikk. Her presenterer vi våre teknikker for hindbrain ventrikkel mikroinjeksjon av prim 25 sebrafisk, inkludert våre modifikasjoner til tidligere protokoller. Våre funn ved hjelp av larvenes sebrafisk-modellen for soppinfeksjon avvike fra in vitro studier og forsterke behovet for å undersøke host-patogen interaction i det komplekse miljøet verten snarere enn forenklet system petriskål 5.

Protocol

Alle sebrafisk omsorg protokoller og eksperimenter ble utført under Institusjonell Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoll A2009-11-01.

1. Morpholino og larve Injection Retter

Eksperimentell varighet: * (10-15 minutter)

Vanskelighetsgrad: *

  1. For egg injeksjoner, forberede en 2% agarose løsning i sterilt vann og mikrobølgeovn. Når løsningen er avkjølt hell litt av den i en ekstra dyp petriskål (Fisher Scientific) til den er halvfull. Avkjøl på is og sørg for at platen er nivået.
  2. Når fatet er avkjølt, helles en 15 mL øverste laget av 2% agarose. Spray et egg injeksjon riflet plast mold (Adaptive Science Tools) med sterilt vann fra en sprayflaske. Plasser mold notsiden ned i den varme agarose. Når agarose er avkjølt, kan du bruke et metall flat spatel (VWR Scientific) å dissosiere formen fra AGAsteg. Sakte fjerne rutenettet fra agarose. Wrap embryo injeksjon retter i Parafilm (VWR Scientific) og lagre invertert ved 4 ° C.
  3. For fisk larver injeksjoner, forberede en 2% agarose løsning som beskrevet. Hell blandingen i en standard størrelse petriskål (VWR Scientific) og sette av til det stivner. Wrap larver injeksjon retter i Parafilm og butikk invertert ved 4 ° C.

2. Soppkultur Forberedelse

Eksperimentell varighet: ** (30 minutter)

Vanskelighetsgrad: **

  1. Forbered gjærekstrakt-pepton-dekstrose (YPD) agar plater: 10 g / liter gjærekstrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / liter dekstrose, og 20 g / liter agar inn og autoklav. For YPD flytende forberede 10 g / liter gjærekstrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / liter druesukker og autoclave 20-30 minutter ved 121 ° C.
  2. To dager før fisk infeksjoner forberede en stripe plate fra frossenbestander av Candida albicans kulturer inn på YPD agar å skaffe enkeltrom kolonier.
  3. Inkuber ved 37 ° C over natten.
  4. Sett 5 ml YPD buljong i 16 x 150 mm kultur rør (VWR Scientific).
  5. Dagen før fisken infeksjoner plukke en liten koloni på YPD agar med en tre plugg (VWR Scientific). Sett pinnen i kulturen røret og virvle rundt å re-suspendere koloni i YPD væske.
  6. Vokse over natten ved 37 ° C på en TC-7 Tissue Culture Roller Drum utstyrt med en 14-tommers test tube hjul (New Brunswick Scientific).
  7. Den neste dagen, spinner ned 1 mL kultur ved 14000x g for 1 minutt i en 1,7 mL tube (Axygen). Fjern supernatanten og resuspender pelleten i gjenværende væske ved virvling (VWR Scientific).
  8. Tilsett 1 mL 1x Fosfatbufret saltvann (VWR Scientific) og spinner som tidligere beskrevet.
  9. Gjenta PBS vask 3 ganger.
  10. Fortynn 1:100 fortynning i 1x PBS (10 mL av vasket C. albicans i 990 mL 1x PBS).
  11. Stol på en hemocytometer (VWR Scientific).
  12. Fortynn 10 7 celler / ml.

3. Sebrafisk Infeksjoner

Eksperimentell varighet: **** (1-3 timer)

Vanskelighetsgrad: ****

  1. Samle embryo i henhold til § 5 og butikk i egg-vann, 60 mg / L instant hav salter (Fisher Scientific) i sterilt avionisert vann.
  2. Ved hjelp av en dissekere mikroskop som Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate embryo på infeksjon dag. Bruk Dumont Dumoxel pinsett (VWR Scientific) til å trekke chorion 27 stykker som å åpne en pose chips, eller forsiktig stikker pinsetten i lukket posisjon i chorion og deretter sakte åpne dem. Fisken skal sprette rett ut av chorion.
  3. Swirl den ekstra dype petriskål med lokket på å flytte fisk i midten av fatet. Overfør fisken til lokket av fatet. Fjern egg-vann ogerstatte med friske media. Legg fisk til media.
  4. Varme larver injeksjon retter i en inkubator ved 28 ° C. Forbered Tricaine metan sulfonat (Western Chemical Inc.) utvanning på 200 mikrogram / ml for bedøvelse fisk.
  5. Tell ut ønsket antall larver for infeksjon (20-50 fisk). Sett fisken i Tricaine metan sulfonate løsning og vent 1-2 minutter til de slutter å bevege seg.
  6. Slå på MPPI-3 injeksjon enhet (Applied Scientific Instruments). Kontroller at trykkbryteren er på "puls" og "pulsvarighet" er satt til 9 med 3 PSI for backpressure enheten. Åpne ventilen til nitrogen tank inntil trykket på injeksjon enheten leser 30 PSI.
  7. Legg en trakk mikropipette 28 med 5 mL av vortexed Candida albicans i en konsentrasjon på 1x10 7 celler / ml. Plasser mikropipette i mikropipette holderen (Applied Scientific Instruments). Fyll en tom ekstra dyp petriskål med vann. Flytt mikropipette til spissen is innen synsvidde bare berøre overflaten av vannet via dissekere mikroskop og bruk Dumont Dumoxel pinsett (VWR Scientific) å klippe nålen om 3 mm fra spissen av trukket pipetten.
  8. Trykk fotbryteren (Applied Scientific Instruments) for å verifisere at nålen er avkuttet. Du bør se væsken spre hvis du var vellykket. Diameteren på den flytende bolus skal ikke være større enn diameteren på pupillen av prim 25 sebrafisk larve (0,21 mm, som gir en sfære av 4,9 nL i volum). Juster trykket tilsvarende dersom væsken bolus er for stor eller for liten.
  9. Anesthetize fisken i Tricaine metan sulfonat (200 mikrogram / ml). Når fisken har sluttet å bevege seg, virvel fatet med lokk på til fisken er i sentrum. Samle 50 fisker med en overføringspipetten (Fisher Scientific). Trykk på siden av pipetten for å gjøre opp fisken mot tips. Forsiktig Pipetter fisk på larvestadiet agarose rett med så lite væske som mulig.
  10. Linje fisken opp med en glatt glass stang (pass på å ikke knuse dem!). Sug så mye væske som mulig ut av fatet. Bruk en KimWipe å veken vekk eventuell fuktighet.
  11. Plasser larvenes agarose parabolen med fisk under mikroskop til du får et godt inntrykk av fisken og nålen på samme tid. Flytt glasset nålen mot fisken. Zoom inn på både fisken og nål som du plasserer nålen mot fisken. Flytt forsiktig glasset nål inn i otic vesicle 27, 29 (øre) av den første fisken. Du vet når du har flyttet nålen inn fisken fordi når du skyver fotbryteren (Applied Scientific Instruments), vil hindbrain ventrikkelen løfte litt opp.
  12. Trykk fotbryteren (Applied Scientific Instruments) og se væsken sprer inne i fiskens hindbrain ventrikkel 27. Trekk nålen fra fisk og flytte til neste fisk. Gjenta prosedyren til du har injisert all fisken på tallerkenen. Fjern eventuelle dEAD fisk og injisere utskiftinger å holde antallet riktig (50 fisk). For hver gruppe av 50 fisk injisert en ny mikroinjeksjon nål må være forberedt, eller C. albicans bosetter seg i bunnen av nål og tetter den, eller kaster av konsentrasjonen injisert.
  13. Vask fisken ut av fatet ved sportsfiske fatet og sprøyting egg-vann på fisken inn i en ren ekstra dyp petriskål inneholder 60 ml egg-vann. Det er viktig ikke å la fisken på agarose lenger enn 15-20 minutter, eller de vil tørke ut og dø.
  14. Gjenta hele injeksjon prosessen til ferdig. Ikke glem PBS og ikke-patogene injisert kontroller.
  15. Når du er ferdig, holde fisken ved 28 ° C.
  16. Lukk nitrogen tank ventilen. Flytt injeksjon enheten bryteren fra "puls" til "kontinuerlig" for å avlaste trykket i tanken linjen, bør trykkfallet til null på dette punktet. Bytt injeksjon enheten tilbake til "puls". Slå av injeksjon enhet og rydde opp arbeidsområdet.
  17. 4. Klargjøre Fish for Imaging

    Eksperimentell varighet: ** (30 minutter)

    Vanskelighetsgrad: **

    1. Forbered Tricaine metan sulfonate løsning som før (200 mikrogram / ml). Kom deg ut infisert fisk, og overføre dem til Tricaine.
    2. Forbered 47,9 ml 0,4% lav-melt agarose (VWR vitenskapelig) i egg-vann. Varm løsningen av mikrobølgeovnen. Kjølig til 37 ° C og legg Tricaine metan sulfonat (200 mikrogram / ml) til blanding
    3. Når fisken er immobilisert i Tricaine metan sulfonate, pipette enkelte fisk inn i en petriskål (VWR vitenskapelig) som inneholder 0,4% lavt smeltepunkt agarose (VWR Scientific).
    4. Deretter flytter fisk fra lavt smeltepunkt agarose i individuelle brønner på en glassbunn rett (Mattek Corporation) for bildebehandling. Bruk så lite lavt smeltepunkt agarose som mulig slik at fisken ligger flatt på bunnen av fatet. Bruk bare nok av Tricaine-agarose å fylle isamarbeidsland sirkler i glasset bunnen fatet.

    5. Modifikasjoner Relatert til Jove protokoller

    Mikropipetter for mikroinjeksjon

    Eksperimentell varighet: * (10-15 minutter)

    Vanskelighetsgrad: *

    1. Trekk hule glass stenger BF120-69-10 (Sutter Instruments) med en Flaming Brown mikropipette Puller Modell P-97 (Sutter Instruments) i henhold til Yuan et al. 30. Velg program # 7 med følgende vilkår Heat = 470, Velocity = 120, Time = 200. Den resulterende nålen er 8 mm fra skråkant til spissen, og en gang avkuttet 3 mm over spissen den har en diameter på ca 10 mikrometer.
    2. Legg en glass mikropipette inn i parentes. Velg "Pull". Den varme glødetråden vil varme nålen i henhold til programmet parametere og glasstav vil dele i to trakk mikropipetter. Oppbevar mikropipetter i en pipette oppbevaringsboks (Sutteh instrumenter).

    Embryo Collection, Morpholino Injection og vedlikehold

    Eksperimentell Varighet: *** (1-2 timer)

    Vanskelighetsgrad: ***

    1. Samle embryo i henhold til metoder for Rosen et al. 31. Bruk en plast sil (Wares av Knutsford) å samle egg fra gyting tank (akvatiske habitater). Hold silen opp ned over en ekstra dyp petriskål og skyll med tank vann å samle egg.
    2. For Morpholino forberedelse, legg 300 mL sterilt vann til 300 nanomoles av Morpholino (GeneTools, LLC). Dette gir en fungerende lager på 1,0 mm.
    3. Kontroller konsentrasjonen av Morpholino ved hjelp av en Nanodrop (Thermo Scientific). Velg "nukleinsyre og endre prøvetype til" annet "og bølgelengde til 265. Angi konstant ved å multiplisere den molekylære vekten av Morpholino med 1000 dividert med absorptivity koeffisient oppført i Morpholino oligo egenskapsarket.
    4. Blank den nanodrop med 2 mL 0,1 N HCl. Fortynn 5 mL av Morpholino løsningen i 95 mL av 0,1 N HCl (20x fortynning). Plasser to mL av fortynning på nanodrop pidestallen og klikk mål. Multipliser konsentrasjonen med fortynningsfaktoren (20). Dette gir en fungerende konsentrasjon av Morpholino. For å beregne millimolær konsentrasjonen dele konsentrasjonen innhentet av den molekylære vekten av Morpholino.
    5. Forbered en fungerende lager av Morpholino i Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0.4 mM MgSO 4, 0,6 mm Ca (NO 3) 2, 5,0 mm HEPES, pH 7,6) og 0,01% fenol rødt (VWR Scientific).
    6. For Morpholino injeksjon arbeid følge opplegget i henhold til Rosen et al. 31 og Yuan et al. 30. Skyll Morpholino injeksjon retter med egg-vann og varm til 28 ° C i 15 minutter. Fjern vann fra injeksjonsbrønner retter og line-up one-cell scene embryoer inn i sporene etter injeksjonen fatet (utarbeidet av § 1) med en overføringspipetten. Hver plate vil eie om lag 250 egg. Injiser 1-2 celle sceniske embryoer med Morpholino. Egg vil forbli i en celle scenen i 15 minutter 27.
    7. Skyll injisert egg med egg-vann når du er ferdig (sterilt avionisert vann med 60 mg / L Instant Ocean salter) og plasser i 60 ml egg-vann i ekstra dype petriskåler. Morpholino injeksjon retter kan gjenbrukes. Skyll med egg-vann når du er ferdig og oppbevar invertert ved 4 ° C.
    8. For lagring av befruktede egg legger 60 mL egg-vann til parabolen. Tell 110 embryoer med en overføringspipetten inn i separate ekstra dype petriskåler med 60 ml egg-vann. Legg 0,00003% metylenblått å hindre mikrobiell vekst og inkuber embryoer ved 28 ° C.
    9. Å fremskynde utviklingen av embryo holde embryo retter på 33 ° C i 24 timer og oppover, avhengig Kimmel et al. 27, slik at embryoene å utvikle seg til hodetbagasjerommet vinkel på 75 ° (Prim 25 trinn 27).
    10. For larve infeksjon arbeid holde embryoer ved 28 ° C etter injeksjon med C. albicans.
    11. Hver dag erstatte embryo retter med 60 ml friskt egg-vann.

    Imaging

    Eksperimentell varighet: ***** (1-5 timer)

    Vanskelighetsgrad: ***

    1. Tilberede fisk på lavt smeltepunkt agarose (i henhold til § 4.2) med Tricaine i glassbunn bildebehandling retter (Mattek Corporation) som beskrevet tidligere. Sett fatet på en Olympus IX-81 (Olympus) invertert mikroskop scenen. Ta fisken i fokus etter 4x forstørrelse henhold differensial interferens kontrast (DIC) lys. Bilder kan tas på 4x, 20x, og 40x forstørrelse i DIC, TRITC (Tetramethyl rhodamine isothiocyanate), og FITC (fluorescein isothiocyanate) filterinnstillinger.
    2. Bruk en Olympus IX-81 invertert mikroskop med en FV-1000 laserskanning confocal system i henhold til Ariga et al. 32. Gjennomføre gang kurs ved 40x forstørrelse ved å sette Z-stabler med 1-1,5 mikrometer skiver hver time for infeksjon.
    3. For lenge løpet avbildning av 2 timer eller mer, legger et lag med lavt smeltepunkt agarose på toppen av fisken i bildebehandling fatet hver 2-3 time. Dette forhindrer at agarose tørker ut og knuse fisken mens den blir fotografert. For lange tiden kurs med et lite antall fisk, bruk en oppvarmet scene (Bioptechs Inc.) for å opprettholde 28 ° C under infeksjoner.

    6. Representative Resultater

    Et eksempel på en vellykket hindbrain ventrikkel C. albicans infeksjon i en sebrafisk larve på 5 timer etter infeksjon (HPI) og 24 HPI er vist i (figur 1). Makrofag-lignende celler med oppslukt C. albicans er sett i hindbrain ventrikkelen ved 5 HPI. Ved 24 HPI, C. albicans er inne makrofag-lignende celles i dorsal halen vev indikerer disseminert candidiasis. Denne infeksjonen Resultatet er svært avhengig av en nøyaktig injeksjon av 10-15 gjær-skjema C. albicans inn i hindbrain ventrikkel. Screening av smittet fisk umiddelbart etter injeksjon kan sikre dette.

    Figur 1
    Figur 1 Transgen fli1:. EGFP 22, 33 larve infisert med CaF2-yCherry Candida albicans og avbildes intravitally av konfokalmikroskopi. (AC) 5 timer etter infeksjon (A) Infected larve med EGFP-uttrykke makrofag-lignende celler på stedet av infeksjon (hindbrain ventrikkel) Scale bar = 100 mikrometer. (B og C) Høyere forstørrelse bilder av samme fisken, viser C. albicans i fagocytter. Scale bar = 100 mikrometer for B og 10 mikrometer for C. (DF) 24 timer etter infeksjon (D) Infected larve med disseminert candidiasis med CaF2-yCherry C. albicans inne EGFP macrophage-lignende celler i dorsal halen vev. Scale bar = 100 mikrometer. (E og F) Høyere forstørrelse bilder av samme fisken, viser C. albicans i halen vev. Scale bar = 100 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sebrafisk mikroinjeksjon metoden presenteres her avviker fra Gutzman et al. 34 i det her vi demonstrere injeksjon gjennom otic vesicle inn hindbrain ventrikkel 36-48 HPF larver. Metoden vi beskrive tillater konsekvent injeksjon av 10-15 gjær i hindbrain ventrikkel med redusert vevsskade. Denne protokollen gir en i utgangspunktet lokal infeksjon som sprer seg i hele kroppen ved 24 HPI (figur 1) og fører til betydelig dødelighet / sykelighet 5. Den hindbrain ventrikkel er ikke helt tettet til 48 27 HPF, 29. I løpet av denne tidlige fasen av utvikling makrofager og nøytrofile migrere til stedet for infeksjon, phagocytose C. albicans, og kan flytte til andre deler av kroppen fem.

Den sanne kraften i dette systemet kommer fra evnen til å kombinere sebrafisk transgenics med selvlysende protein-uttrykke mikrober. Vi har nogineered villtype og mutant flekker av C. albicans til constitutively uttrykke mCherry, dTomato, og eqFP650. Ved å kombinere disse uttrykk konstruksjoner med oksidativt stress-responsive promotere tillater ratiometric kvantifisering av oksidativt stress i levende sebrafisk larver 5. Dual in vivo avbildning av fluorescerende sopp og fluorescerende medfødte immunceller i sammenheng med en mutant sopp eller fisk morphant kan også brukes til robust kvantifisere endrede immunreaksjoner som migrasjon til området for infeksjon, fagocytose av organismen, forebygging av sopp spiring , og drepte fem.

Det er flere teknikk-relaterte problemer som kan være problematisk til en nybegynner bruker av denne protokollen. Først er det viktig at nålen er klipset riktig og injeksjon trykket er riktig innstilt slik at 5 nL av C. albicans suspensjon er microinjected. For å sikre dette kan man sjekke at bolus kommer ut avnålen er størrelsen på elev av en prim 25 sebrafisk larve, som beskrevet i kapittel 3.8. Det er viktig at sebrafisk larvene får samme mengde injectant, som kan bekreftes ved screening umiddelbart etter smitte ved epifluorescence å verifisere at det er 10-15 gjær stede i hindbrain ventrikkelen. Injisert fisk kan også være homogenisert og belagt for verifisering av første koloni dannende enheter fem. For det andre er det viktig å unngå punktering blodkar i hindbrain ventrikkel, da dette fører til for tidlig død av larven. Det er viktig å injisere inn i otic vesikkel med en tilnærmet 45-graders vinkel, noe som sikrer direkte mikroinjeksjon i hindbrain hjertekammer. Tredje, ta ekstra forsiktighet for ikke å rive eller skade otic vesicle vev, noe som kan resultere i økt betennelse til infeksjon nettsted som er uavhengig av patogen infeksjon. Fjerde, må injeksjoner utføres raskt når larvene blir plassert på agarose sprøytepå fatet. Larvene igjen for lenge på fatet vil tørke ut, og hvis dette skjer vil det være dødelighet i PBS-injisert fisk. Fullfører infeksjoner innen 15 minutter, og etterlot en gjenværende mengde vann på fatet mens infisere fisk både kan bidra til å forbedre dette problemet. Imidlertid kan forlate for mye vann på fatet gjør injeksjonene vanskeligere med drivende larver. En alternativ metode for injeksjon beskrives for eldre (4 DPF) fisk som er mer kompleks, men unngår å utsette larvene til luft er levert av Cosentino og kolleger 28.

Sebrafisk Larven har hittil blitt brukt til å modellere medfødte immunreaksjoner til bakterier, sopp og virus patogener 5, 26, 35-46. Disse banebrytende studier har etablert nytten av denne modellen system for å oppdage nye cellulære og molekylære mekanismer i både vert og patogen. Tatt sammen med dette beskrives protokollen, disse andre publiserte arbeider gi grunnlag for annen LaboratoriesRIES å undersøke host-sopp samhandling i forbindelse med en intakt vert.

Selv nyttig i disse eksperimentene, fli1: EGFP transgen linje beskrevet her, har sine begrensninger. Den fli1 genet uttrykkes i endotelial blodkar i tillegg til makrofag-lignende celler 22. Ofte EGFP fluorescens av blodkar kan gjøre det vanskelig å oppdage C. albicans i makrofag-lignende celler. I tillegg blir EGFP uttrykk i makrofag-lignende celler redusert rundt 18-24 timer etter infeksjonen gjør det vanskelig å oppdage. En nylig publisert makrofag-spesifikk transgen sebrafisk linje har mange fordeler som en modell for macrophage studier 23.

Den beskrives infeksjon teknikken gir en entrée til en rekke kraftige genetiske og fluorescens mikroskopi verktøy tilgjengelig i sebrafisk. Det kan kombineres med passende transgen fisk og konstruerte C. albicans C. albicans, hyppigheten av C. albicans fordøyelsen, og delingen av C. albicans innen medfødte immunceller 5. Man kan også kombinere denne protokollen med bruk av Morpholino antisens oligonukleotider for å teste den rollen enkelte medfødte immunsystemet gener i infeksjon fem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke laboratoriet av Dr. Carol Kim for mikroinjeksjon trening, Clarissa Henry for å få råd om å påskynde embryo utvikling og bruk av utstyr, og Nathan Lawson for å bidra fli1: EGFP fisk. Vi takker medlemmene av Wheeler lab og Shawn Vegger for kritisk lesing av manuskriptet. Vi ønsker også å takke Mark Nilan for fisk omsorg og råd, og Ryan Phennicie og Kristin Gabor for teknisk råd om dette prosjektet. Dette arbeidet ble finansiert av en MAFES forskning assistantship til K. Brothers, en MAFES Hatch stipend E08913-08, og en NIH NCRR pris P20RR016463 til R. Wheeler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spawning tanks Aquatic habitats 2L
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific TC-7
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
  2. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  3. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
  4. Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. (2011).
  5. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  6. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
  7. Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
  8. de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
  9. Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
  10. Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
  11. Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
  12. Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
  13. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
  14. Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
  15. Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
  16. Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
  17. Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
  18. Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
  19. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
  20. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
  21. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
  22. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  23. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
  24. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  25. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
  26. Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203-253 (1995).
  28. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  29. Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  30. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  32. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
  33. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  34. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  35. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  36. Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
  37. Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  38. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  39. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
  40. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  41. Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
  42. Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
  43. Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
  44. van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  45. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
  46. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).

Comments

1 Comment

  1. That's really useful.

    Reply
    Posted by: Kane R.
    December 18, 2013 - 2:01 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics