Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere l'imaging tridimensionale senza lenti su chip di campioni biologici su un grande volume di imaging. Ciò si ottiene posizionando prima il campione direttamente sul chip del sensore e fornendo un'illuminazione parzialmente coerente. Il secondo passo consiste nello spostare lateralmente la sorgente luminosa di diverse posizioni per registrare.

I subpixel hanno spostato le immagini olografiche del campione. I subpixel successivi sono stati spostati. Le immagini olografiche vengono registrate a multipli di illuminazione per l'imaging tomografico.

La fase finale è l'elaborazione dei dati, in cui il set di dati acquisito viene ricostruito digitalmente per ottenere infine immagini tomografiche tridimensionali del campione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia ottica convenzionale è che fornisce immagini ad alta produttività in un'architettura compatta. Ciò rende la nostra piattaforma particolarmente utile per l'integrazione con le piattaforme di chip Lebanon.

In questo rapporto viene descritta la configurazione di imaging di base per un'implementazione da banco verso la tomografia di campioni statici. Un monocromatore con una lampada allo xeno è stato regolato per fornire un'uscita con una larghezza spettrale di circa 1-10 nanometri attorno a una lunghezza d'onda centrale da 450 a 650 nanometri. Questa uscita parzialmente coerente viene quindi accoppiata a una fibra ottica multimodale per fornire una luce parzialmente coerente al sistema.

La fibra ottica è montata su uno stadio di rotazione motorizzato per modificare l'angolo di illuminazione. Il tavolino motorizzato con la sorgente luminosa collegata è montato su un tavolino XY lineare bidimensionale, che viene utilizzato per ottenere spostamenti semplici della sorgente luminosa a un determinato angolo per il rilevamento. Viene utilizzato un array di sensori A-C-M-O-S da cinque megapixel con una dimensione dei pixel di 2,2 micron.

Il rivelatore viene utilizzato per registrare le immagini olografiche ad ampio campo visivo dei campioni. È fondamentale che l'array di sensori sia posizionato sullo stesso piano assiale dell'asse di rotazione della sorgente luminosa per garantire che controlliamo se il sensore riceve luce sufficiente a grandi angoli di illuminazione. Mentre la tomografia ottica senza lenti può visualizzare una varietà di oggetti come cellule e microrganismi, i principi di base sono dimostrati qui eseguendo la microscopia tridimensionale di un campione di elgano marino utilizzando un bisturi o una spatola.

Prendi un pezzetto di AGA dalla capsula di Petri contenente la coltura degli organi sigillanti. Un pezzo cubico di diversi millimetri lungo ogni dimensione conterrà centinaia di nematodi. Mettere il pezzetto di agar in una fiala di polipropilene contenente un millilitro di acqua deionizzata.

Agitare delicatamente per 30 secondi a un minuto. Dopo 10-15 minuti, il verme dovrebbe strisciare fuori dall'agar nell'acqua deionizzata. Si noti che i vermi sono troppo piccoli per essere visti qui per immobilizzare temporaneamente i vermi e un millilitro di Lima da cinque a 10 millimolari.

Quindi soluzione e attendi 10 minuti. Pipettare da cinque a 10 microlitri di campione dal fondo della fiala e inserirlo tra due vetrini. Questo campione contenente un gran numero di vermi temporaneamente immobilizzati può essere posizionato sul rivelatore per avviare l'acquisizione dei dati.

A scopo dimostrativo, le fasi di acquisizione delle immagini per una tipica tomografia ottica senza lente o esperimento LOT sono riassunte in questa sezione, tuttavia, l'intero processo è stato automatizzato utilizzando l'interfaccia di visualizzazione del laboratorio sviluppata su misura. Per iniziare i passaggi manuali, regolare l'angolo iniziale del tavolino di rotazione su un valore negativo di 50 gradi, dove zero gradi corrisponde alla posizione verticale della sorgente luminosa. Regolare la posizione iniziale del tavolino XY su zero zero, che è la posizione iniziale.

Regolare il tempo di esposizione del rivelatore per utilizzare al meglio la sua gamma dinamica in modo tale che l'immagine sia il più luminosa possibile senza pixel saturi senza modificare l'angolo dello stadio di rotazione. Cattura nove immagini per ogni immagine. Sposta lo stage XY in una nuova posizione in una griglia quadrata tre per tre, in modo che ogni immagine si sposti di circa un quarto di pixel rispetto alla precedente.

L'acquisizione di più immagini ad ogni angolazione potrebbe migliorare la risoluzione a seconda del tipo di oggetto e del rapporto segnale/rumore. Dopo aver raccolto nove immagini con l'angolo iniziale, regolare la posizione dello stadio XY riportandola alla posizione zero zero. Quindi aumentare l'angolo dello stadio di rotazione con incrementi di due gradi fino a raggiungere i 50 gradi positivi.

Dopo ogni incremento ad ogni nuova angolazione, ripetere i passaggi descritti. Gli incrementi angolari possono essere più fini o più grossolani a seconda dell'ottimizzazione del tempo di acquisizione rispetto alla risoluzione dell'imaging. Dopo l'acquisizione dei dati, viene acquisito un set di 459 immagini, che contengono nove immagini spostate in subpixel per ciascuno dei 51 diversi angoli di illuminazione.

Ogni set di nove immagini viene elaborato digitalmente utilizzando algoritmi di super risoluzione dei pixel per ottenere una proiezione ad alta risoluzione. I super risultati dell'ologramma per pixel angolari vengono quindi ricostruiti digitalmente per ottenere 51 immagini di proiezione. L'elaborazione dei dati viene mostrata qui utilizzando un laptop.

La ricostruzione richiederebbe meno di un secondo per l'intero campo visivo utilizzando unità di elaborazione grafica. Questo set di 51 immagini di proiezione viene quindi riproiettato utilizzando il plug-in Tom OJA. Per l'immagine J, le immagini di proiezione vengono prima caricate nell'immagine J, dopodiché viene richiamato il plug-in Tom OJ.

Una tabella di ricerca che fornisce l'angolo di visione per ogni immagine di proiezione viene caricata in OJ. Utilizzando il metodo della retroproiezione ponderata, è possibile ottenere immagini tomografiche tridimensionali del campione. L'ampio campo visivo della tomografia ottica senza lenti è dimostrato qui, poiché il campione viene posizionato direttamente sulla parte superiore dell'array di rivelatori. Le immagini olografiche degli oggetti possono essere registrate su un campo visivo di 24 millimetri quadrati, che può essere ulteriormente aumentato utilizzando array di rivelatori emergenti con aree attive più grandi.

Sebbene la dimensione dei pixel dell'array di rivelatori limiti la risoluzione delle immagini olografiche registrate, le tecniche di super risoluzione dei pixel mitigano questo problema, mostrate qui sono ologrammi con super risoluzione dei pixel, insieme alle immagini di proiezione ricostruite che offrono una risoluzione spaziale submicrometrica per tre diversi angoli di illuminazione. Le immagini di proiezione possono essere combinate utilizzando tecniche di ricostruzione tomografica dell'immagine per calcolare i terreni TOM del campione. Qui sono mostrate tre immagini di fette nel piano XY attraverso la parte anteriore del verme in cui il tubo faringeo è visibile solo nella fetta attraverso Z uguale a otto micron, come previsto da questa struttura approssimativamente cilindrica con un diametro esterno di circa cinque micron.

Inoltre, l'immagine della sezione trasversale nel piano XZ mostra chiaramente i confini del verme e del tubo faringeo all'interno, dimostrando il successo dell'imaging 3D della faringe. Con il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori per eseguire la microscopia tridimensionale su tubi di decine di millimetri di volume di imaging. Pertanto, la tomografia ottica senza lenti può essere uno strumento utile per applicazioni di imaging ad alta produttività nelle piattaforme di chip libaniche.