En modifisert EPA Method 1623 som bruker tangentiell Flow Hollow-fiber ultrafiltrasjon og Heat dissosiasjon Fremgangsmåte for å oppdage vannfortynnbar

Immunology and Infection
 

Summary

Denne protokollen beskriver bruk av en tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon prøve konsentrasjon system og en varme dissosiasjon som alternative tiltak for påvisning av vannbårne

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryptosporidium og Giardia arter er to av de mest utbredte protozoer som forårsaker vannbårne diaré sykdomsutbrudd verden. For å bedre karakterisere utbredelsen av disse patogener, ble EPA Method 1623 utviklet og brukt til å overvåke nivåene av disse organismene i USA drikkevann leverer 12. Metoden har tre hoveddeler, den første er utvalget konsentrasjonen der minst 10 L av rå overflatevann blir filtrert. Organismene og fanget rusk blir deretter elueres fra filteret og sentrifugeres til videre konsentrere prøven. Den andre delen av metoden bruker en immunomagnetiske separasjon prosedyre hvor konsentrert vannprøven brukes til immunomagnetiske perler som spesifikt bindes til de Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster muliggjør spesifikk fjerning av parasitter fra konsentrert rusk. Disse (OO) cyster er så løsrevet fra de magnetiske kuler av en syre dissosiasjon proseDure. Den siste delen av metoden er immunfluorescens flekker og telling der (OO) cyster brukes på et lysbilde, beiset, og nummerert av mikroskopi.

Metode 1623 har fire børsnoterte prøven konsentrasjon systemer for å fange Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster i vann: Envirochek filtre (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtre (Pall Corporation), Filta-Max filtre (IDEXX, Westbrook, MA), eller kontinuerlig flyt Sentrifugering (Haemonetics, Braintree, Massachusetts). Imidlertid har Cryptosporidium og Giardia (OO) cyst inngang varierte sterkt avhengig av kilden vannet matrise og filtre brukt 1,14. En ny tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon (HFUF) system har nylig vist seg å være mer effektive og mer robust ved å utvinne Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra ulike vann matriser, dessuten er det billigere enn andre patronfilter alternativs, og kan konsentrere flere patogener samtidig 1-3,5-8,10,11. I tillegg tidligere studier av Hill og kolleger vist at HFUF betydelig forbedret Cryptosporidium oocyster inngang når sammenlignes direkte med de Envirochek HV filtrene 4. Ytterligere endringer av dagens metoder har også blitt rapportert å forbedre metoden ytelsen. Skifte syre dissosiasjon prosedyren med varme dissosiasjon ble vist å være mer effektiv på å skille Cryptosporidium fra de magnetiske perler i enkelte matriser 9,13.

Denne protokollen beskriver en modifisert metode 1623 som bruker den nye HFUF filtreringssystem med varmen dissosiasjon trinnet. Bruken av HFUF med dette endret Metode er et rimeligere alternativ til dagens EPA Method 1623 filtrering alternativer og gir mer fleksibilitet ved at konsentrasjonen av flere organismer.

Protocol

1. Tangentiell Flow Hollow-fiber ultrafiltrasjon Prosedyre

  1. Utarbeidelse av buffere og løsninger:

    Eluering Løsning (1 L):
    Til 1 L av reagens karakter vann legge 0,1 g natrium polyfosfat, 0,1 ml Tween-80 og 0,01 ml Y-30 Antifoam.

  2. Forbered filterenheten (figur 1) i en biologisk sikkerhet skap:
    1. Sett Masterflex I / P 73 lab slange gjennom en Masterflex I / P Easy-Load pumpehuset koblet til en Masterflex I / P presisjon børsteløs stasjonen.
    2. Fest slangen til en 0-60 psi, glyserin-fylt trykkmåler utstyrt med en PT gren T-kontakt oppstrøms av pumpen hodet med en skrue klemme, og til en HDPE T-kontakt nedstrøms av pumpehuset.
    3. Monter retentate flasken ved å montere en Nalgene 53-B fylling / lufting lue med Masterflex L / S 15 lab slange og en T-kontakt og feste det til en 1 L Nalgene heavy duty polypropylen flaske.
    4. Monter Masterflex L / S 24 rør wed en klype klemme (klype klemme 2) og koble den fra retentate flasken til HDPE T-kontakten.
    5. Koble Masterflex L / S 24 lab slangen fra trykkmåleren til Asahi Kasei Rexeed 25s høy-flux dialyzer med en skrue klemme, og fra dialyzer til retentate flasken. Bruk skreddersydde DIN adaptere designet for å imøtekomme ¼ "ID slange for å koble slangen til hul-fiber ultrafilter.
    6. Monter Masterflex L / S 24 lab rør med en klype klemme (klype klemme 1) og koble den til en 10 ml plast pipette med spissen og bomull plugg fjernet for å opptre som prøven opptak linjen og fest slangen til HDPE T- kontakten.
    7. Monter den ene enden av Masterflex L/S-36 lab rør med en rampe klemme og koble slangen til avløpsvannet porten plassert nær avkjøringen slutten av filteret. Plasser den andre enden i avfallsbeholderen.
  3. Legg 0,01% (w / v) natrium polyfosfat til 10 L vannprøven og bland i 3 min.
  4. Lukk klype klemme 2og fjern ventilen hetten fra retentate flasken. Alle andre klemmer bør være åpen.
  5. Sett pumpen retning for å flytte væske fra T-kontakten til trykkmåleren (høyre til venstre følgende figur 1). Juster pumpehastigheten til 25% av maksimal hastighet og slå på pumpen.
  6. Når retentate flasken er 2/3 full, åpen klype klemme 2 og raskt erstatte vent cap til retentate flasken. Sjekk alle linjene og beslag for å sikre det ikke er noen lekkasjer.
  7. Øk pumpehastigheten til ønsket filtrasjonshastighet (ca 1,5 l / min), se etter lekkasjer. Ved hjelp av en gradert sylinder og en timer eller strømningsmåler, sjekk filtratet rate av vannet spennende fra avløpsvannet linjen (blå L / S 36 rør i figur 1). Luftbobler kan vanligvis dannes ved utkjørselen slutten av filteret gjør det vanskelig å oppnå en stabil trykk og filtrasjonshastighet. Dette er korrigert ved å klemme avløpsvannet linjen for hånd for et øyeblikk. Denne handlingenvil generelt coax luftboblen til filtratet port og avslutte via avløpsvannet linjen. Gjenta etter behov, husk at ert størrelse luftbobler er ofte uunngåelig.
  8. Overvåk filtrering prosessen. Måle og registrere trykket og filtrasjonshastighet etter behov. Trykket skal aldri overstige 20 psi. Det anbefales at filtrasjonshastighet bør ikke overstige 2,0 l / min. Det er viktig at volumet av vann i retentate flasken overvåkes for å sikre at det aldri tømmer. Det er normalt for volumet å øke eller redusere litt. Hvis vannmengden i retentate flasken faller under 1/3 full, så ta ut ventilen hetten og lukk klype klemme 2 på retentate flasken linjen. Kok opp volumet tilbake til ca 2/3 fullt, åpne klemmen og raskt erstatte vent cap, sikrer en tett forsegling. Hvis volumet i retentate flasken faller raskt og kontinuerlig, deretter sikre retentate flasken lokket er tett og ventilen hetten er på plass, og at tubing er fortsatt i kontakt med vannprøve. Hvis disse problemene ikke er oppstått, så er det sannsynlig at forseglingen i retentate flasken lokket er dårlig og bør skiftes.
  9. Når prøven containeren er tom, umiddelbart nært klype klemme 1, redusere pumpehastigheten til 20% av maks, fjerne ventilen hetten fra retentate flasken og lukk rampen klemmen.
  10. Juster volumet av prøven i retentate flasken til ca 200 ml ved å stramme eller løsne rampen klemmen. Etter at volumet er ca 200 ml, stramme rampen klemme for eluering trinn (01.11 til 01.12).
  11. Legg til 500 ml eluering løsning på den prøven beholderen og skyll innsiden av containeren. Plasser 10 ml pipetten kobles til prøven opptak linjen inn i beholderen som inneholder eluering løsningen. Sørg for at rampen klemmen er avsluttet. Åpen klype klemme 1 og lukk klype klemme to øyeblikk for å trekke opp eluering løsningen.
  12. Etter 500 ml eluering løsning er utarbeidet, Nær klemmer klemme en åpen og klype klemme to. La eluering løsning å sirkulere i 5 minutter med en rotasjonshastighet på 20% av sitt høyeste.
  13. Juster volumet av prøven i retentate flasken til ca 100 ml ved å stramme eller løsne rampen klemmen på avløpsvannet linjen. Stram rampen klemmen og la prøven å sirkulere i 1 minutt. Unngå å trekke luft inn i slangen ved å sikre volumet av prøven i retentate flasken er høy nok til å dekke L / S 15 rør inn i retentate flasken.
  14. Omvendt retning av pumpen som tvinger prøven i retentate flasken. La pumpen kjøres i revers i 20 sekunder resulterer i en totalt ~ 225 ml i retentate flasken. Slå av pumpen.
  15. Fjern Masterflex I / P 73 slanger fra pumpehodet og koble fra trykkmåler. Koble Masterflex L / S 24 rør ut av hul-fiber ultrafilter. Hold slangen over retentate flasken for å tvinge noen gjenværende prøve iretentate flaske.
  16. Koble fra alle slanger fra flasken og erstatte lufting hetten med et ikke-ventilering cap.
  17. Fortsett til IMS / IFA prosedyre med ~ 225 ml retentate.

2. Immunomagnetiske Separasjon Prosedyre

  1. Utarbeidelse av buffere og løsninger:
    1. La buffere som inngår i Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit til romtemperatur.
    2. 1X SL-buffer A: Tilsett 1 ml 10X SL-buffer A til 9 ml reagens karakter vann.
  2. Overfør ~ 225 ml væske fra retentate flasken til en merket 250 ml konisk sentrifugerør. Skyll retentate flaske to ganger med 10 ml reagens vann, og legge til skyllinger til den koniske sentrifugerør. Sentrifuger suspensjonen ved 1500 xg i 15 min ved 4 ° C uten brems.
  3. Nøye aspirer supernatanten fra luft-vann-grensesnittet til 5 ml over pakket pellet for hver 0,5 ml av pellet volum (dvs. aspirer til en5 ml over en pellet volum på 1,3 ml, og aspirer til 5 ml for en pellet på 0,5 ml eller mindre).
  4. Grundig resuspender pellet inn supernatanten ved virvling og / eller pipette miksing. Overfør hver 5 ml volum av væsken til den flate ensidig Dynal L10 tube inneholder 1 ml hver av 10X SL-buffer A og 10X SL-buffer B. Skyll den koniske sentrifugerøret to ganger med 2,5 ml reagens vann og tilsett skyll til L10 røret, og det totale volumet i L10 tube til 12 ml, inkludert buffere.
  5. Tilsett 100 mL hver av godt blandede resuspendert anti-Cryptosporidium og anti-Giardia Dynabeads til L10 røret. Roter L10 røret ved 18 rpm i 1 time ved romtemperatur på en rotator blandebatteri.
  6. Plasser den flate siden av L10 røret mot MPC-6 magnet og forsiktig hånd stein røret ende-til-ende, 180 ° i 2 minutter.
  7. Holde L10 rør i MPC-6 magnet med magnet siden opp, dekanter supernatanten bort fra bead / (oo) cyste komplekser Bound til magneten. Fjern L10 røret fra magneten og tilsett 0,5 ml 1X SL-buffer A til røret. Overfør suspensjonen ved hjelp av to ekstra skyllinger med 0,5 ml 1X SL-buffer A inn en 1,5 ml mikrosentrifuge tube holdt i MPC-S med magnet i vertikal posisjon.
  8. Rist røret i MPC-S magnet 180 ° i 1 minutt. Med magneten på plass, aspirer supernatanten med en Pasteur pipette rettet til bunnen av mikrosentrifuge røret.
  9. Tilsett 1 ml 1X PBS til forsiden av mikrosentrifuge røret, fjerne magneten og rock røret forsiktig like før perlene blir resuspendert. Bytt magneten i loddrett stilling og rist røret 180 ° i 1 minutt. Aspirer PBS skyll, uten å forstyrre perle pellet, ved hjelp av en Pasteur pipette for å fjerne så mye søppel som mulig.
  10. Fjern magneten og tilsett 50 mL av reagens vann til baksiden av mikrosentrifuge røret. Vortex røret på full hastighet i 50 sekunder,Deretter Inkuber røret ved 80 ° C i 10 minutter, etterfulgt av en 30 andre vortex. Bytt magneten inn i MPC-S i skrå posisjon, binding perlene til magneten og forlate den (OO) cyster i væsken. Påfør (oo) cyste suspensjonen til en SingleSpot godt lysbilde.
  11. Gjenta steg 2,10, bruke middelet på samme brønn inneholder den første dissosiasjon. Plasser lysbilde på en 37 ° C lysbilde varmere i 1 time for å tørke suspensjonen til lysbildet godt.

3. Farging og eksamen

  1. Utarbeidelse av buffere og løsninger:
    Arbeid DAPI: Tilsett 25 mL av DAPI stamløsning (2 mg / ml i metanol) til 25 ml 1X PBS. Lagre lager og arbeidsvilkår løsninger mellom 1 ° C og 10 ° C i mørket.
  2. Påfør 50 mL av metanol til lysbildet godt og la det tørke i romtemperatur.
  3. Tilsett 50 mL av arbeids DAPI løsningen til lysbildet godt og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
  4. Bruk en Kimwipe å veken den DAPI fra brønnen. Påfør 50 mL av EasyStain. Inkuber ved 35 ° C i 30 minutter.
  5. Wick flekken av brønnen med en Kimwipe, og deretter sakte legge 300 mL med kaldt EasyStain innfesting buffer, slik at det å flyte over brønnen kanten. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
  6. Bruk en Kimwipe å veken buffer fra brønnen og gjelder 10 mL av EasyStain Mounting Medium.
  7. Nøye bruke et dekkglass, fjerne eventuelle bobler som oppstår. Tett dekkglass med klar neglelakk.
  8. Skann hele lysbildet bruker FITC filter, ved 200X total forstørrelse, for avrundede eller sfærisk eple-grønne fluorescerende objekter som ligner en oocyst eller cyste. Undersøke alle slike objekter med DAPI filter på 1000x total forstørrelse og deretter med DIC, også på 1000x total forstørrelse. Noter på størrelse med en kalibrert okulær mikrometer og morfologiske egenskaper.
  9. Dokumentere resultater.

Merk: Ytterligere informasjon om den opprinnelige prosedyren kan bli funnet i desember 2005-versjonen av EPA Method 1623 12. Den tangentielle flyt hul-fiber ultrafiltrasjon beskrevet brukes i stedet for § 12.0 av EPA Method 1623. Varmen dissosiasjon modifiserer § 13.3.3 av EPA Method 1623. Prosedyren beskriver også en ekstra PBS skylling under IMS prosess som kan settes inn i desember 2005-versjonen av Method 1623 etter avsnitt 13.3.2.16. Den komplette listen av forbruksvarer, reagenser og utstyr som brukes for EPA Method 1623 inkludert disse endringene er oppført i utstyrslisten.

4. Representative Resultater

Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster utvinnes gjennom prosesser av filtrering og immunomagnetiske separasjon oppdaget av mikroskopisk analyse. På 200X total forstørrelse, hver organisme viser en typisk farging mønster, størrelse og form som vist i Figur 2 Cryptosporidium er en sone til sfærisk objekt 4 til 6 mikrometer i diameter som viser strålende eple-grønne FITC fluorescens med lyst markerte kanter (figur 3A ). Med DAPI UV, vil en oocyst stille en av følgende typiske trekk kategorier: lyseblå intern flekker med en grønn kant og ingen tydelig kjerner (DAPI negativ), intense blå intern flekker, eller opp til fire forskjellige, himmelblå kjerner (DAPI positive - Figur 3B). Atypisk funksjoner inkluderer avvik i farge, struktur, eller DAPI fluorescens (f.eks for mange beiset atomkjerner, rød fluoriserende interne strukturer). Dersom fluorescerende objektet har møtt kriteriene for typisk FITC og DAPI farging, blir det undersøkt ved hjelp av differensial forstyrrelser contrast (DIC). Objektet er undersøkt for atypiske eksterne eller interne morfologiske egenskaper som celleveggen ornamenter, eller en eller to store kjerner fylle cellen. Hvis atypiske strukturer ikke er observert, er objektet registrert i det totale IFA telle og kategorisert som en tom amorf struktur eller med ett til fire sporozoites presentere (Figur 3C). Tilsvarende er Giardia-lignende objekter undersøkt med hensyn til FITC og DAPI farging samt DIC egenskaper, som axonemes, median organer, og kjerner Giardia cyster er runde til avrundede strålende eple-grønne gjenstander, 8 -. 18 mikrometer lange med 5 - 15 mikrometer brede med lyst markerte kanter (Figur 3D). Med DAPI UV vil Giardia cyste vise DAPI-negativ farging, eller DAPI-positive egenskaper (Figur 3E). Det fluorescerende objektet undersøkes av DIC for typiske og atypiske trekk på samme måte som beskrevet for Cryptosporidium.Hvis atypiske funksjoner som ikke er observert, er objektet registrert i det totale IFA teller og kategorisert som tom holdig amorf struktur, eller med en eller flere type interne strukturer presentere (Figur 3F).

Enhver organisme som er observert å ha atypisk funksjoner bør ikke regnes som en (oo) cyste. Mikroskopisk analyse av miljøprøver kan være utfordrende som det er organismer som kan auto-fluoresce eller kryssreagerer med FITC-konjugert anti-Cryptosporidium og / eller anti-Giardia antistoffer en. Det anbefales at en analytiker være kjent med akvatiske mikrober og gjennomgang dusinvis av lysbilder til å få erfaring identifisere Cryptosporidium og Giardia. Minst tre (oo) cyster på positiv farging kontroll lysbildet skal være preget før hver økt på mikroskopet.

Kvalitetskontroll prøver kan bli tilsatt (OO) cyster å bestemme prosent recOvery for hver protozo bruke beregningen:
(Oo) cyste Prosent Recovery = ((QC Sample Count - Teller fra Unspiked Utvalg) / Spike) x 100.

Figur 1
Figur 1. Grafisk fremstilling av tangentielle flyten hul-fiber ultrafiltrasjon system. Slangen er fargekodet for å hjelpe er montering av systemet.

Figur 2
Figur 2. Representant fluorescens bilde av Cryptosporidium og Giardia (OO) cyster. Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster ble farget med FITC merket anti-Cryptosporidium / Giardia antistoffer. Piler, Giardia cyster; pilspisser, Cryptosporidium oocyster. Totalt fire Cryptosporidium oocyster og seks Giardia cyster ble funnet i flyet i fokus. Prøver observed henhold 200X forstørrelse.

Figur 3
. Figur 3 Representative mikroskopiske bilder av Cryptosporidium oocyster og Giaridia cyster som brukes for å karakterisere Cryptosporidium oocyster (A - C).. Brilliant eple-grønne FITC fluorescens av sfæriske objekter 4 til 6 mikrometer i diameter med lyst markerte kanter (A) inneholder opptil fire forskjellige, himmelblå DAPI kjerner (B) og ett til fire sporozoites (S) per oocyst (C). Giardia cyster (D - F). Brilliant eple-grønne FITC fluorescens av omg til avrundede gjenstander 8 - 18 mikrometer lange ved 5 - 15 mikrometer brede med lyst markerte kanter (D) som inneholder opptil fire himmelblå DAPI kjerner (E) og med en eller flere merkes intern struktur slik som kjerner (N), median kroppen (M) og eller axonemes (A) (F). Hvite piler, strålende eplegrønn fluorescens farging Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster walls, hvite pilspisser, DAPI positive kjerner. Prøver observert etter 1000x forstørrelse.

Discussion

Tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon er en alternativ og effektiv teknikk for den opprinnelige konsentrasjonen av Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra vann. Hollow-fiber ultrafiltrasjon er rimeligere enn tradisjonelle filtre. Siden det har evnen til å konsentrere Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra en rekke forskjellige vann matriser det er en nyttig alternativ til dagens filtrering teknikker som brukes for EPA Method 1623. Som med de fleste andre filtrering metoder, er hul-fiber ultrafiltrasjon utsatt for begroing med ekstremt grumsete prøver. Høyt vanntrykk ville følge av filteret begroing, derfor anbefales det å overvåke trykket under filtrering løp. I tillegg til Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster, har hul-fiber ultrafiltrasjon vist seg å være i stand til å konsentrere seg bakterier og virus 1-3,5,8. Hollow-fiber ultrafiltrasjon outlined i denne metoden kan brukes til å konsentrere flere organismer i en enkelt prøve. Det er bemerkelsesverdig at å skaffe en endelig volum mellom 200 og 250 ml er den kritiske siste trinnet i konsentrasjonen prosedyren slik at ekstra Sentrifugering trinn, som kan resultere i (oo) cyste tap, unngås (trinn 2,2). Imidlertid kan slik at volumet i flasken for å slippe altfor lavt ha ugunstige effekter på inngang siden det ikke vil være nok væske volum for å tvinge alle oocyster eller cyster i retentate flasken. Derfor anbefales det å opprettholde en endelig volum mellom 200 og 250 ml.

Heat dissosiasjon er et alternativ til syre dissosiasjon trinnet i metode 1623. Denne alternative trinnet har vist seg å forbedre Cryptosporidium oocyst utvinning og redusere metoden variasjon når isolert fra enten elven eller reagens vann 9. En side-by-side-sammenligning av syre og varme dissosiasjon metoder viste at bruk av varme til dissociaTe organismene fra immunomagnetiske perlene produseres høyere gjennomsnittlig inngang for både Cryptosporidium og Giardia. I tillegg var presisjonen av Cryptosporidium og Giardia inngang bedre i prøver behandlet med varme dissosiasjon sammenlignet med syre dissosiasjon 9.

Inkorporering av HFUF som konsentrasjonen steget tillater mer fleksibilitet ved å tilby muligheten til å konsentrere seg flere organismer. I tillegg er det et rimeligere alternativ til nåværende metode 1623 filtrering alternativer.

Disclosures

The United States Environmental Protection Agency gjennom sitt kontor for forskning og utvikling i samarbeid med Office of grunnvann og drikkevann tekniske Support Center finansiert forskningen som er beskrevet her. Alt arbeid ble støttet på stedet ved US EPA, Cincinnati, Ohio. Selv om informasjonen som er beskrevet i denne artikkelen har blitt finansiert helt eller delvis av United States Environmental Protection Agency under kontrakt (kontrakt EP-C-06-031) til Shaw miljø og infrastruktur, Inc, betyr det ikke nødvendigvis gjenspeiler synspunktene til den Agency og ingen offisiell godkjenning bør utledes. Det har blitt utsatt for Agency gjennomgang og godkjent for publisering.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Ann Grimm og Michael Zimmerman for kritisk gjennomgang av dette manuskriptet og Doug Hamilton for sin teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters Dial Medical REXEED25S/R
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent Cole-Parmer EW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-36
I/P Precision Brushless Drive Cole-Parmer EW-77410-10
I/P Easy Load Pump Head Cole-Parmer EW-77601-10
Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" US Plastics 62064
Masterflex T-connector L/S 15-25 Cole-Parmer EG-30613-12
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle Cole-Parmer EW-06257-10
10 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11C
Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B Cole-Parmer EW-06258-10
Pressure gauge Cole-Parmer A-680-46-10
Straight coupling, NPT(F), 1/4" Cole-Parmer EW-06469-18
NPT branch tee, natural pp Cole-Parmer A-30610-75
Pinch clamps, 1/2" Cole-Parmer EW-06833-00
Custom fit DIN adapters Molded Products Corp MPC-855NS.250
Ring stand Fisher Scientific 14-670B
Ring stand clamps Fisher Scientific 05-769-6Q
Keck ramp clamp, 14mm Cole-Parmer EW-06835-10
Sodium polyphosphate Sigma-Aldrich 305553
Sodium thiosulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 72050
Antifoam Y-30 emulsion Sigma-Aldrich A5758
Tween-80 Sigma-Aldrich P1754
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer VWR international IR314-0025
Centrifuge bottle rack Fisher Scientific 05-663-103
250 ml conical centrifuge tubes Corning 430776
Disposable funnel Cole-Parmer U-6122-10
Wash bottle Cole-Parmer U-06252-40
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-15R
Swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. ARIES SX4750
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes Beckman Coulter Inc. 349849
200 μl large bore pipette tips Fisher Scientific 02-707-134
VacuShield Filter Gelman 629-4402
5 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit IDEXX 73002
50 ml conical centrifuge tubes Falcon BD 352098
Dynal L10 flat sided tubes IDEXX 74003
Timer VWR international 23609-202
Dynal MPC-6 magnet IDEXX 12002D
1 ml pipettes VWR international 53283-700
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
1000 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P1000/DF1000ST
100 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P100/DF100ST
9 inch Pasteur pipettes VWR international 14672-412
Dynal MPC-S magnet IDEXX 12020D
Vortex VWR international 14216-188
Dynabeads rotator mixer IDEXX 94701
Heat block Fisher Scientific 11-718-2
Lab Armor Beads Lab Armor 42370-750
Digital thermometer Fisher Scientific 15-077-60
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) Sigma-Aldrich P4417
Single Spot slides IDEXX 30201
Cover glass Corning 287018
EasyStain direct kit BTF -
10 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P10 & DF10ST
4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Clear nail polish Fisher Scientific S30697
Methanol Fisher Scientific L6815
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Incubator Boekel Scientific 133000
slide warmer Fisher Scientific 11-474-521
Immersion oil, Type A ND= 1.515 Nikon Instruments MXA20234
Nikon 90i microscope with DIC capabilities Nikon Instruments MBA 77000
Plan APO 100X oil objective Nikon Instruments MRD01901
Plan Achro 20X Nikon Instruments MRL00202
FITC filter Nikon Instruments 96302
DAPI filter Nikon Instruments 96301
X-cite fluorescence illuminator Nikon Instruments 87540
Lens paper Nikon Instruments 76997
Biohazard disposable bag Fisher Scientific 01-829D
Biohazard sharps container Fisher Scientific 14-827-117
3 % hydrogen peroxide VWR international BDH3540-2
Bleach Fisher Scientific 1952030
Wypall Kimberly Clark 34790

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
  2. Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
  3. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
  4. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
  5. Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
  6. Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
  7. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
  8. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
  9. Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
  10. Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
  11. Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
  12. USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
  13. Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
  14. Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics