水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623

Immunology and Infection
 

Summary

このプロトコルは、水性の検出のための代替手順として、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過試料濃度システムの使用と熱解離について説明します。

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Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

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Abstract

Cryptosporidiumおよび Giardiaの種が世界的に水性下痢性疾患の発生を引き起こすこと原虫最も一般的の2つです。優れたこれらの病原体の有病率を特徴づけるために、EPAメソッド1623を開発し、米国の飲料水中のこれらの生物のレベルを監視するために使用されたは12を供給しています 。メソッドは3つの主要な部分を持っています。最初の生の表層水の少なくとも10 Lがフィルタリングされているサンプルの濃度である。生物と閉じ込められた破片は、フィルターから溶出し、さらにサンプルを濃縮するために遠心分離されています。メソッドの第二部では、濃縮水のサンプルは、特に濃縮された破片から寄生虫の具体的な除去を可能にするクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストにバインド免疫磁気ビーズに適用される免疫分離の手順を使用しています。これらの(OO)嚢胞は、酸解離proceことにより、磁性ビーズから切り離されdure。メソッドの最後の部分は、(OO)嚢胞が染色されたスライドに適用され、顕微鏡で列挙されて免疫蛍光染色と列挙です。

Envirochekフィルタ(ポール·コーポレーション、アナーバー、MI)、Envirochek HVフィルター(ポール·コーポレーション)、Filta-Maxのフィルター(IDEXX、ウェストブルック、MA):方法1623は、水のクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストをキャプチャするための4つの上場サンプル濃度のシステムを持っているまたは連続フロー遠心分離(Haemonetics、ブレーンツリー、MA)。しかし、 クリプトスポリジウム及びジアルジア (OO)嚢胞の回収率は1,14を使用したソース水行列およびフィルタに応じて大きく変化しています。新タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過(HFUF)システムは、最近クリプトスポリジウムオーシストを回収する時に、より効率的で堅牢であることが示されている 様々な水行列からジアルジアのシスト、また、他のカプセルフィルターオプションよりも安価であるsと1-3,5-8,10,11同時に複数の病原体を集中することができます。さらに、ヒルらによる以前の研究では、直接Envirochek HVフィルター4と比較した場合HFUFが大幅に改善されることプトスポリジウムオーシストの回収率を示した。現在のメソッドに追加の変更は、メソッドのパフォーマンスを向上させることが報告されている。熱解離して酸解離手順を置き換えることは、いくつかの行列の9,13の磁性ビーズからクリプトスポリジウムを分離することで、より効果的であることが示された。

このプロトコルは、熱解離ステップで新しいHFUFろ過システムを使用して変更された方法1623について説明します。この修​​正法を用いたHFUFの使用は、現在のEPAメソッド1623ろ過オプションへの安価な代替手段であり、複数の生物の濃度を許容することによって、より多くの柔軟性を提供します。

Protocol

1。タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過手順

  1. バッファーおよび溶液の調製:

    溶出液(1 L):
    試薬グレード水1 Lは、0.1グラムのポリリン酸ナトリウム、0.1ミリリットルのTween-80、0.01ミリリットルY-30消泡剤を追加することができます。

  2. 生物学的安全キャビネット内でフィルタアセンブリ( 図1)を準備します。
    1. Masterflex I / P精密ブラシレスドライブに接続Masterflex I / Pイージーロードポンプヘッドを介してMasterflex I / P 73研究室チューブを挿入します。
    2. ねじクランプ付きポンプヘッドの上流NPTブランチT-コネクタを装備0から60 PSI、グリセリン充填圧力計にチューブを固定し、ポンプヘッドのHDPE T-コネクタの下流に。
    3. Masterflex L / S 15ラボチューブおよびT-コネクタとナルゲン53-B充填/ガス抜きキャップを装着し、1リットルのナルゲンヘビーデューティポリプロピレンボトルにそれを確保することにより残留液ボトルを組み立てる。
    4. Masterflex L / S 24ワットチューブに適合i番目のピンチクランプ(ピンチクランプ2)HDPE T-コネクタに残留ボトルからそれを接続します。
    5. 圧力計から旭化成にMasterflex L / S 24ラボのチューブを接続するには、ネジクランプで25SハイフラックスダイアライザーをRexeedし、ダイアライザーから残留ボトルに。中空糸限外ろ過にチューブを接続するための¼ "IDチューブを収容するために設計されたカスタムメイドのDINアダプタを使用しています。
    6. ピンチクランプ(ピンチクランプ1)でMasterflex L / S 24ラボのチューブに合わせて、サンプルの取り込みラインとして機能するように除去し、チップと綿プラグを10 mlのプラスチックピペットに接続し、HDPEにチューブを取り付け、T-コネクタに接続します。
    7. ランプクランプMasterflex L/S-36ラボチューブの一方の端に合わせて、フィルタの出口端近くに排水ポートにチューブを接続します。廃棄物のコンテナ内のもう一方の端に置きます。
  3. 0.01%(w / v)の10リットルの水試料にポリリン酸ナトリウムと3分のミックスを追加します。
  4. ピンチクランプ2を閉じます。と残留ボトルからベントキャップを取り外します。他のすべてのクランプが開いている必要があります。
  5. 圧力計(左、次の図1の右)にT-コネクタから流体を移動させるポンプの方向を設定します。最高速度の25%にポンプ速度を調整し、ポンプの電源をオンにします。
  6. 残留ボトルが2月3日、フルオープンピンチクランプ2であり、迅速に残留ボトルにベントキャップを交換するとき。漏れがないことを確認するために行と継手の全てをチェックしてください。
  7. 徐々に漏れがないかチェックし、希望のろ過率(約1.5 L /分)にポンプ速度を増加させます。メスシリンダーやタイマーや流量計を使用して、排水ライン( 図1の青L / S 36チューブ)から出る水のろ過率を確認してください。気泡は、通常、それが困難な安定した圧力とろ過速度を達成するために行うフィルタの出口端部に形成することができます。これは、しばらく手で廃液ラインをつまんで修正されています。このアクション一般的にろ液ポートに気泡を同軸し、排水ラインを経由して終了します。エンドウ豆のサイズの気泡がしばしば不可避であることを念頭に置きつつ、必要に応じて繰り返します。
  8. ろ過プロセスを監視します。必要に応じて圧力とろ過速度を測定し、記録します。圧力は20 psiを超えないようにしてください。これは、ろ過速度は2.0 L / minを超えてはならないことをお勧めします。それが残留ボトルの水の体積は、それが空にすることが決して起きないように監視することが重要です。ボリュームが増加したり、わずかに減少することは正常です。残留液ボトルの水の量は完全に下の3分の1を下回る場合は、残留ボトルラインのベントキャップを閉じピンチクランプを取り外します2。約2/3完全に戻ってボリュームを持って、クランプを開き、すぐに密封性を確保、ベントキャップを交換します。残留液ボトルのボリュームを迅速かつ継続的に低下した場合は、残留ボトルの蓋がタイトで、ベントキャップが所定の位置にしっかりとあり、tubiことを確認してくださいngは、水試料との接触のままです。これらの問題が発生していない場合は、それが残留ボトルの蓋のシールが不良であり、交換する必要がある可能性があります。
  9. 試料容器が空になったら、すぐに近くにピンチクランプ1は、その最大値の20%にポンプ速度を低減し、残留液ボトルからベントキャップを取り外し、ランプクランプを閉じます。
  10. ランプクランプを締めたり緩めて約200mlに濃縮水ボトルのサンプルの音量を調整します。量が約200mlになった後、溶出ステップ(1.11から1.12)のランプクランプを締めます。
  11. 試料容器に溶出液500mlを追加して、コンテナの内部をすすぎます。溶出液を含む容器にサンプル取り込みラインに接続された10 mlのピ​​ペットを配置します。ランプクランプが閉じていることを確認します。オープンピンチ溶出液を描画するために一時的に1に近いピンチクランプ2をクランプします。
  12. 溶出液500mlを策定された後、近く、ピンチクランプ1とオープンピンチクランプ2。溶出液は、その最大値の20%のポンプ速度で5分間循環させることができます。
  13. 廃液ラインのランプクランプを締めたり緩めて約100mlに濃縮水ボトルのサンプルの音量を調整します。ランプクランプを締めて、サンプルが1分間循環させることができます。残留瓶にサンプルの体積を確保することによって、チューブに空気を引っ張って避けて残留液ボトルを入力してL / S 15チューブをカバーするのに十分な高さです。
  14. 残留瓶に試料を強制的にポンプの方向を反​​転させます。ポンプが残留瓶の中に〜225ミリリットルの合計で20秒間逆に実行することができます。ポンプの電源をオフにします。
  15. ポンプヘッドからMasterflex I / P 73チューブを外し、圧力計を外します。中空糸限外ろ過を終了Masterflex L / S 24チューブを外します。に任意の残りのサンプルを強制的に残留ボトル上記のチューブを保持するボトルを残留。
  16. ボトルからすべてのチューブを外し、非通気キャップベントキャップを交換します。
  17. 〜225ミリリットルの残留とIMS / IFAの手順に進みます。

2。免疫分離の手順

  1. バッファーおよび溶液の調製:
    1. クリプトスポリジウム/ジアルジアのコンボキットは室温に到達する:ダイナに含まれているバッファができます。
    2. 1X SL-バッファー:10X SL-バッファーに9 mlの試薬グレード水1 mlを追加します。
  2. 残留液ボトルからラベル250ミリリットルコニカル遠心チューブに液体の〜225ミリリットルを転送します。試薬水10mLで2回残留ボトルをすすぎ、円錐遠心管にすすぎを追加します。 4℃、15分ブレーキなしのCは1500×gで懸濁液を遠心分離する。
  3. 慎重にペレットボリュームのすべての0.5ミリリットル(すなわち吸引1に、空気 - 水界面からパックペレット上記5mlに上清を吸引5 1.3 mlのペレットの体積上記ミリリットル、0.5 ml以下のペレットを5 mlに吸引)。
  4. ボルテックス、および/またはピペット混合することにより上清中にペレットを再懸濁します。 1ミリリットル10X SL-バッファーおよび10X SL-バッファーBの各試薬水2.5 mlで2回コニカル遠心チューブを洗浄し、すすぎに追加を含むフラット両面Dynal社L10チューブに液体の各5 mlのボリュームを転送L10チューブ、バッファを含む、12ミリリットルにL10チューブの総ボリュームをもたらします。
  5. L10チューブに100μlをよく混合し、再懸濁し、抗クリプトスポリジウムジアルジア抗ダイナビーズをそれぞれ追加します。ローテータミキサーで室温で1時間18 rpmでL10チューブを回転させます。
  6. MPC-6マグネットとそっと手をロックで2分間チューブはエンドツーエンドの、180°に対してL10チューブの平らな面に置きます。
  7. MPC-6までの磁石側と磁石、離れてビーズ/からの上清をデカント(OO)嚢胞錯体BouのL10チューブを保持する磁石を購入する。磁石からL10チューブを外し、チューブに1×SL-バッファー0.5 mlを加える。縦位置で磁石をMPC-Sで開催された1.5 mlのマイクロチューブに1×SL-バッファー0.5mlのつの追加リンスを使用して懸濁液を移す。
  8. 穏やかに1分間MPC-Sマグネット180°にチューブを揺する。代わりに磁石で、遠心チューブの底に向けパスツールピペットを用いて上清を吸引除去する。
  9. マイクロ遠心チューブの前面側に1X PBSを1 ml添加し、マグネットを削除して、ビーズを再懸濁しているだけになるまで穏やかにチューブを揺する。垂直位置に磁石を取り付けて、穏やかに1分間チューブを180°を揺する。 PBSは、できるだけ多くの破片のように削除するには、パスツールピペットを用いて、ビーズペレットを乱すことなく、リンス吸引除去する。
  10. マグネットを取り外し、マイクロ遠心チューブの裏面に試薬水50μlを加える。ボルテックス50秒間フルスピードでチューブ、その後、30秒の渦に続いて10分間80℃でチューブをインキュベートします。マグネットビーズを結合し、液体中で(OO)嚢胞を残して、斜めの位置にMPC-Sに磁石を交換してください。 SingleSpotよくスライドに(OO)嚢胞懸濁液を適用します。
  11. 第一解離を含む同じウェルに液体を適用すると、ステップ2.10を繰り返します。 37°Cのスライドもスライドに懸濁液を乾燥させる1時間の​​ウォーマーの上に置きスライドさせます。

3。染色試験

  1. バッファーおよび溶液の調製:
    DAPI溶液を操作する:1X PBS 25 mlにDAPIストック溶液(メタノールで2 mg / ml)を25μlのを追加します。店舗の在庫と1°C、暗所で10°Cの間に働くソリューションを提供しています。
  2. よくスライドにメタノール50μlを適用して室温で乾燥させます。
  3. よくスライドに取り組んでDAPI溶液50μlを加え、室温で2分間インキュベートします。
  4. Kimwiを使用します。井戸からDAPIを芯に、PE。 EasyStain 50μlを適用します。 30分間35℃でインキュベートします。
  5. キムワイプでよくオフ染色し、その後徐々にそれがよくエッジ上に流すため、冷たいEasyStain固定バッファー300μlを加えるウィック。室温で2分間インキュベートします。
  6. 井戸からバッファを芯とEasyStain封入剤10μlを適用するためにキムワイプを使用しています。
  7. 慎重に発生した気泡を除去し、カバースリップを適用します。透明なマニキュアでカバースリップをシールします。
  8. オーシスト、または嚢胞似ている卵形または球形のリンゴ緑色蛍光のオブジェクトに対して、200X合計倍率で、FITCフィルターを用いてスライド全体をスキャンします。また、1000X総合倍率で、1000X総合倍率でDAPIフィルタを使用して、その後DICとそのようなすべてのオブジェクトを調べます。キャリブレーション接眼マイクロメータと形態的特徴を使用してサイズを記録します。
  9. ドキュメントの結果。

注:追加の情元のプロシージャについての報はEPAメソッド1623年12 2005年12月版に記載されています。説明したタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過手順は、EPAメソッド1623の12.0項の代わりに使用されます。熱解離は、EPAメソッド1623のセクション13.3.3を変更します。また、この手順では、追加のPBSは、セクション13.3.2.16後にメソッド1623年12月2005バージョンに挿入することができますIMSプロセス中にリンスを説明します。これらの変更を含むEPAメソッド1623のために使用する消耗品、試薬、機器の完全なリストは、機器リストに記載されています。

4。代表的な結果

濾過および免疫分離のプロセスを経て回復クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアのシストは、顕微鏡分析によって検出されます。 200X総合倍率は、 図2に示すように、典型的な染色パターン、サイズ、形状を示すそれぞれの生物においてクリプトスポリジウムは明るく強調表示されたエッジ( 図3Aと鮮やかな青リンゴ色のFITCの蛍光を示す球状のオブジェクトへの卵は直径4から6μmである。)緑のリムと、明確な核(DAPI負)、濃いブルーの内部染色、または最大4つの別個の、スカイブルーの核(DAPIと水色内部の染色:DAPI UVと、オーシストは、次のような一般的な機能のいずれかのカテゴリを示します。正- 図3B)。非定型の特徴は、色の偏差、構造、またはDAPI蛍光(例えば、あまりにも多くの染色された核、赤色蛍光の内部構造)が含まれています。蛍光オブジェクトは典型的なFITCおよびDAPI染色のための基準を満たしている場合は、それは微分干渉CONを用いて検討しているtrast(DIC)。オブジェクトは、細胞壁の装飾、またはセルを埋める1つまたは2つの大きな核として非定型の外部または内部の形態的特徴を検討している。非定型的な構造が観察されない場合、オブジェクトは合計IFAのカウントに記録され、空のアモルファス構造として、あるいは現在の一から四スポロゾイト( 図3C)と分類されます。同様に、 ジアルジアのようなオブジェクトは、FITCおよびDAPI染色などaxonemes、中央機関、および核のようなDIC特性に関して検討されジアルジアのシストは卵形の青リンゴ色の鮮やかなオブジェクトは、8へのラウンドです- 。5で長い18μmで- 15μmで明るく強調表示されたエッジ( 図3D)広い。 DAPI UVで、 ジアルジアのシストは、DAPI染色陰性、またはDAPI陽性特性( 図3E)出展いたします。蛍光オブジェクトは、 クリプトスポリジウムについての説明と同じ方法で、典型的な非定型機能のDICによって検討されています。非定型の特徴が観察されない場合、オブジェクトは合計IFAのカウントに記録され、空を含有する非晶質構造体として、または本の内部構造( 図3F)の1つまたは複数のタイプに分類されています。

非定型の特徴を持っていることが観察されているすべての生物は、(OO)嚢胞としてカウントすべきではありません。環境試料の顕微鏡分析は、自動蛍光またはFITC結合抗クリプトスポリジウムおよび/ ​​または抗ジアルジア抗体1と交差反応する可能性があり、生物が存在するので、挑戦することができます。それはアナリストがCryptosporidiumおよび Giardia 識別する経験を得るために水生微生物やスライドのレビュー数十に精通することをお勧めします陽性コントロールスライド上の少なくとも3(OO)嚢胞は顕微鏡で前のセッションごとに特徴づけされるべきである。

品質管理のサンプルは、%のRECを決定するために(OO)嚢胞でスパイクすることができ計算を使用して、各原虫のためにオーヴェリー:
(OO)シスト回収率=((QCサンプル数-ピーク値比較サンプルからカウント)/スパイク)×100。

図1
図1。タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過システムのグラフィック表現。チューブを支援するために色分けされているシステムのアセンブリです。

図2
2。Cryptosporidium および Giardia(OO)嚢胞の代表的な蛍光画像。 クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアのシストは、FITC標識抗クリプトスポリジウム / ジアルジア抗体で染色した。矢印は、 ジアルジアのシスト、矢印、 クリプトスポリジウムオーシスト。 4 クリプトスポリジウムオーシストとジアルジア 6嚢胞合計は、焦点面で発見された。サンプルobserv200X倍率下編。

図3
特性評価に使用するクリプトスポリジウムオーシストとGiaridia嚢胞 図3に代表的な顕微鏡画像クリプトスポリジウムのオーシスト(A - C)。球状​​のオブジェクトの鮮やかな青リンゴ色のFITC蛍光の四季、スカイブルーDAPI核(B)とオーシストごとに一から四スポロゾイト(S)(C)までを含む明るく強調表示されたエッジ()で、直径4から6ミクロン。 ジアルジアのシスト(D - F)。卵形のオブジェクトへの円形の華麗な青リンゴ色のFITC蛍光を8から5、長さ18μm - 明るく強調表示されたエッジを持つ広い15μmの(D)は、4つの空色DAPI核(E)までを含む、このような1または複数の識別可能な内部構造を持つ核(N)、中央体(M)とするかaxonemes(A)〜(F)など。白い矢印は、鮮やかなアップルグリーン蛍光染色クリプトスポリジウムのオーシストとジアルジアシストワットalls、白矢印、DAPI陽性の核。サンプルは1000X倍率で観察した。

Discussion

タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過は、水からクリプトスポリジウムオーシストジアルジアシストの初期濃度の代替と有効な手法である。中空糸限外ろ過は、従来のフィルタより安価です。それは別の水の行列の様々なクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストを集中する能力を持っているので、それはEPAメソッド1623に使用されている現行の濾過技術に有用な代替手段です。他のほとんどのろ過方法と同様に、中空糸限外ろ過は、非常に濁ったサンプルで汚れが発生しやすくなります。高水圧は、フィルタ目詰まりに起因する、従ってそれはろ過の実行中に圧力を監視することをお勧めします。 クリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストに加えて、中空糸限外ろ過は、細菌やウイルス1-3,5,8を集中することが可能であることが示されている。中空糸限外ろ過Oこの方法でutlinedは、単一サンプル中の複数の生物を集中することができます。それは200と250ミリリットルの間の最終的な体積を求めること(OO)嚢胞が失われる可能性があり、余分な遠心操作ので、濃度の手順の重要な最後のステップ、(ステップ2.2)回避されていることは注目に値する。残留液ボトルにすべてのオーシストやシストを強制するのに十分な液量はないだろうしかし、ボトル内のボリュームが低すぎるドロップすることができますことは、回収に不利な影響を及ぼす可能性があります。したがって、それは200と250ミリリットルの間の最終的な音量を維持することをお勧めします。

熱解離法1623の酸解離のステップに代わるものです。この代替手順は、 クリプトスポリジウムオーシスト回収を改善し、川や試薬水9のいずれかから単離されたときに、メソッドのバリエーションを減らすことが示されている。酸と熱解離法のside-by-sideの比較では、解離に熱を使用していることを実証TEは、免疫磁気ビーズから生物がCryptosporidiumおよび Giardiaの両方に対して高い平均回収率を作り出した。さらに、 クリプトスポリジウムジアルジアの回収率の精度は、酸解離9と比較して熱解離で処理した試料で良好であった。

濃縮工程としてHFUFの取り込みは、複数の生物を集中する能力を提供することによって、より柔軟にすることができます。それに加えて、現在のメソッド1623ろ過オプションへの安価な代替手段です。

Disclosures

地下水や飲料水のテクニカル·サポート·センターのオフィスと共同で研究開発の自国の官庁を通じて、米国環境保護庁は、ここで説明する研究に資金を供給した。すべての作業は、米国環境保護庁(EPA)、シンシナティ、オハイオ州でのオンサイトでサポートされていました。この資料に記載されている情報は、ショーの環境とインフラ社との契約に基づき米国環境保護庁(契約EP-C-06-031)によって完全にまたは部分的に資金を供給されていますが、それは必ずしもの見解を反映するものではありません庁と公式承認を推測する必要があります。それは代理店のレビューに付し、出版のために承認されています。

Acknowledgments

私たちは彼の技術サポートについては、この原稿とダグ·ハミルトンの重要なレビューのためにアングリムとマイケル·ジマーマンに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters Dial Medical REXEED25S/R
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent Cole-Parmer EW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-36
I/P Precision Brushless Drive Cole-Parmer EW-77410-10
I/P Easy Load Pump Head Cole-Parmer EW-77601-10
Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" US Plastics 62064
Masterflex T-connector L/S 15-25 Cole-Parmer EG-30613-12
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle Cole-Parmer EW-06257-10
10 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11C
Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B Cole-Parmer EW-06258-10
Pressure gauge Cole-Parmer A-680-46-10
Straight coupling, NPT(F), 1/4" Cole-Parmer EW-06469-18
NPT branch tee, natural pp Cole-Parmer A-30610-75
Pinch clamps, 1/2" Cole-Parmer EW-06833-00
Custom fit DIN adapters Molded Products Corp MPC-855NS.250
Ring stand Fisher Scientific 14-670B
Ring stand clamps Fisher Scientific 05-769-6Q
Keck ramp clamp, 14mm Cole-Parmer EW-06835-10
Sodium polyphosphate Sigma-Aldrich 305553
Sodium thiosulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 72050
Antifoam Y-30 emulsion Sigma-Aldrich A5758
Tween-80 Sigma-Aldrich P1754
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer VWR international IR314-0025
Centrifuge bottle rack Fisher Scientific 05-663-103
250 ml conical centrifuge tubes Corning 430776
Disposable funnel Cole-Parmer U-6122-10
Wash bottle Cole-Parmer U-06252-40
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-15R
Swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. ARIES SX4750
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes Beckman Coulter Inc. 349849
200 μl large bore pipette tips Fisher Scientific 02-707-134
VacuShield Filter Gelman 629-4402
5 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit IDEXX 73002
50 ml conical centrifuge tubes Falcon BD 352098
Dynal L10 flat sided tubes IDEXX 74003
Timer VWR international 23609-202
Dynal MPC-6 magnet IDEXX 12002D
1 ml pipettes VWR international 53283-700
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
1000 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P1000/DF1000ST
100 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P100/DF100ST
9 inch Pasteur pipettes VWR international 14672-412
Dynal MPC-S magnet IDEXX 12020D
Vortex VWR international 14216-188
Dynabeads rotator mixer IDEXX 94701
Heat block Fisher Scientific 11-718-2
Lab Armor Beads Lab Armor 42370-750
Digital thermometer Fisher Scientific 15-077-60
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) Sigma-Aldrich P4417
Single Spot slides IDEXX 30201
Cover glass Corning 287018
EasyStain direct kit BTF -
10 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P10 & DF10ST
4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Clear nail polish Fisher Scientific S30697
Methanol Fisher Scientific L6815
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Incubator Boekel Scientific 133000
slide warmer Fisher Scientific 11-474-521
Immersion oil, Type A ND= 1.515 Nikon Instruments MXA20234
Nikon 90i microscope with DIC capabilities Nikon Instruments MBA 77000
Plan APO 100X oil objective Nikon Instruments MRD01901
Plan Achro 20X Nikon Instruments MRL00202
FITC filter Nikon Instruments 96302
DAPI filter Nikon Instruments 96301
X-cite fluorescence illuminator Nikon Instruments 87540
Lens paper Nikon Instruments 76997
Biohazard disposable bag Fisher Scientific 01-829D
Biohazard sharps container Fisher Scientific 14-827-117
3 % hydrogen peroxide VWR international BDH3540-2
Bleach Fisher Scientific 1952030
Wypall Kimberly Clark 34790

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
  2. Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
  3. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
  4. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
  5. Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
  6. Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
  7. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
  8. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
  9. Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
  10. Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
  11. Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
  12. USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
  13. Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
  14. Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).

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