Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623

Immunology and Infection
 

Summary

Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma açıklar

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryptosporidium ve Giardia türlerin neden olan su kaynaklı ishal salgınları dünyada protozoa en yaygın ikisidir. Daha iyi bu patojenlerin prevalans karakterize etmek için, EPA Method 1623 geliştirilen ve ABD içme sularında bu organizmaların düzeylerini izlemek için kullanılan 12 sağlamaktadır. Metodu, üç ana bölümden oluşur; birinci ham yüzeyi su en az 10 L süzüldü edildiği Örnek konsantrasyonudur. Organizmalar ve tuzağa enkaz sonra filtreden yıkandı ve daha örnek konsantre santrifüje edilir. Yöntemin ikinci bölümü konsantre su numunesi özellikle konsantre enkaz gelen parazitler belirli çıkarılması için izin ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri bağlamak immunomanyetik boncuk için uygulanan bir immunomanyetik ayırma işlemi kullanır. Bunlar (oo) kistler sonra bir asit ayrışma Proce tarafından manyetik boncuk ayrıdırDure. Yöntemin son bölümü (oo) kistler bir slayt, lekeli uygulanır ve mikroskop ile numaralandırılan immünofloresan boyama ve numaralandırmasıdır.

Envirochek filtreleri (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtreler (Pall Corporation), Filta-Max filtreler (Idexx, Westbrook, MA): Yöntem 1623 suda ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri yakalamak için dört halka örnek konsantrasyonu sistemleri vardır veya Sürekli Akış Santrifüj (Haemonetics, Braintree, MA). Ancak, Cryptosporidium ve Giardia (oo) kist kurtarma 1,14 kullanılan su kaynağı matrisi ve filtreleri bağlı olarak büyük farklılıklar var. Yeni teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon (HFUF) sistemi kısa bir süre Cryptosporidium ookistleri geri at daha verimli ve daha sağlam olması gösterilmiştir ve çeşitli su matrislerinden Giardia kistleri, dahası, diğer kapsül filtre seçeneği daha ucuzdurs ve aynı anda birden fazla patojen 1-3,5-8,10,11 konsantre olabilirsiniz. Ayrıca, Hill ve arkadaşları tarafından daha önceki çalışmalarda doğrudan Envirochek HV filtreleri 4 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde HFUF Cryptosporidium ookistleri kurtarma geliştirilmiş olduğunu göstermiştir. Mevcut yöntem ek olarak modifiye metodu performansını iyileştirmek için rapor edilmiştir. Isı ile ayrışma asidin ayrılması prosedüre değiştirilmesi bazı matrisler 9,13 içinde manyetik boncuklar Cryptosporidium ayırma daha etkili olduğu gösterilmiştir.

Bu protokol, ısı ile ayrışma adım yeni HFUF filtrasyon sistemini kullanan bir modifiye Yöntem 1623 açıklanmaktadır. Bu modifiye Yöntemi ile HFUF kullanımı mevcut EPA Method 1623 filtreleme seçenekleri için daha ucuz bir alternatif olduğunu ve bir çok mikroorganizma konsantrasyonunu izin vererek daha fazla esneklik sağlar.

Protocol

1. Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon Prosedürü

  1. Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması:

    Elüsyon çözeltisi (1 L):
    Distile su 1 L 0,1 g sodyum polifosfat, 0.1 ml Tween-80 ve 0.01 ml Y-30 köpük eklemek için.

  2. Bir biyolojik güvenlik kabini filtre montajı (Şekil 1) hazırlayın:
    1. Bir Masterflex I / P hassas fırçasız Sürücüye bağlı bir Masterflex I / P Kolay Yük pompa kafası ile Masterflex I / P 73 laboratuvar tüp takın.
    2. Bir vidalı kelepçe ile pompa kafası upstream bir NPT şube T-konnektör takılmış 0-60 psi, gliserin dolu basıncı göstergesi tüp sabitleyin ve pompa kafası bir HDPE T-konnektör aşağı için.
    3. Bir Nalgene Masterflex L / S 15 laboratuvar boru ile 53-B dolum / havalandırma kapağı ve bir T-bağlayıcısı uyan ve 1 L Nalgene ağır polipropilen şişe sağlamca tarafından retentat şişe takılacak.
    4. Masterflex L / S 24 tüp w FitITH bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 2) ve HDPE T-konnektörüne retentat şişe bağlayın.
    5. Manometre gelen Asahi Kasei için Masterflex L / S 24 laboratuar boru bağlayın vidalı kelepçe ile 25S yüksek akılı diyalizer Rexeed ve diyalizer gelen retentat şişeye. Boş elyaf Ultrafiltreler için boru bağlamak için ¼ "ID boruları karşılamak için tasarlanmış ısmarlama DIN bağdaştırıcılarını kullanın.
    6. Bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 1) Masterflex L / S 24 laboratuvar tüp Fit ve numune alımı hattı olarak hareket etmek kaldırıldı ucu ve pamuk yumağı ile 10 ml plastik pipet bağlayın ve sonra HDPE için tüp takmak T- konektörü.
    7. Bir rampa filtrenin çıkış ucu yakınında bulunan atık noktasına hortum ve kelepçe ile bağlanmak Masterflex L/S-36 laboratuar hortumun bir ucunu takın. Atık kap içinde diğer ucu yerleştirin.
  3. % 0.01 (a / h) 10 L su örneği sodyum polifosfat ve 3 dakika boyunca karıştırılır.
  4. Tutam kelepçe 2 kapatınve retentat şişeden havalandırma kapağı çıkarın. Diğer tüm kelepçeler açık olması gerekir.
  5. Manometre (sol aşağıdaki Şekil 1 hakkı) için T-konnektör gelen sıvı taşımak için pompa yönünü ayarlayın. Maksimum hız% 25 pompa hızını ayarlayın ve pompa açın.
  6. Retentat şişenin 2/3 tam, açık tutam kelepçe 2 ve hızlı bir şekilde retentat şişe havalandırma kapağını değiştirdiğinizde. Hatları ve sızıntıların olmadığından emin olmak için bağlantı parçaları, her kontrol edin.
  7. Yavaş yavaş sızıntı kontrol, istenilen filtrasyon hızı (yaklaşık 1.5 L / dk) pompa hızını artırmak. Bir mezun silindir ve bir zaman sayacı veya akış ölçer kullanarak, atık su hattı (Şekil 1'de mavi L / S 36 tüp) ve çıkışlarında suyun süzüntü hızını kontrol edin. Hava kabarcıkları tipik olarak zor stabil bir basınç ve filtrasyon oranı elde etmek için filtre yapım çıkış ucunda oluşturabilirler. Bu, bir an için elle atık su hattı sıkıştırarak düzeltilir. Bu, eylemgenellikle süzüntü noktasına hava kabarcığı coax ve atık su hattı üzerinden çıkmak için. Bezelye büyüklüğünde hava kabarcıkları genellikle kaçınılmaz olduğunu akılda tutarak, gerektiği gibi tekrarlayın.
  8. Filtrasyon işlemi izleyin. Gerektiği gibi basınç ve filtrasyon hızını ölçün ve kaydedin. Basıncı 20 psi aşmamalıdır. Bu filtrasyon hızı 2.0 L / dk geçmemelidir önerilir. Bu retentat şişe içinde su hacmi boşaltmaktadır hiç sağlamak için izlenir olması önemlidir. Bu artırmak veya biraz azaltmak için ses seviyesi normaldir. Retentat şişede su hacmine göre 1/3 dolu düşerse, havalandırma kapağını ve yakın tutam retentat şişe hattı 2 kelepçe. Yaklaşık 2/3 geri ses getir, kelepçe açmak ve hızlı bir sızdırmazlık sağlanması, havalandırma kapağı değiştirin. Retentat şişe hacmi hızla ve sürekli düşerse, retentat şişe kapağı sıkı ve havalandırma kapağı sıkıca yerinde olduğundan emin olun ve bu tubing su numunesi ile temas halen devam etmektedir. Bu sorunları meydana değilseniz, o zaman retentat şişe kapağı içinde mühür kötü olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini muhtemeldir.
  9. Numune kabı boş olduğunda, hemen yakın tutam kelepçe 1, maksimum% 20 pompa hızını azaltmak, retentat şişeden havalandırma kapağını ve rampa kelepçe kapatın.
  10. Rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 200 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Hacminin yaklaşık 200 ml sonra, elüsyon adım (1,11-1,12) için rampa kelepçe sıkmak.
  11. Örnek kabına elüsyon çözeltisi 500 ml ilave edilir ve kabın içine durulanır. Elüsyon çözeltisi içeren bir kaba Örnek uptake hattına bağlı 10 ml pipetle yerleştirin. Rampa kelepçe kapalı olduğundan emin olun. Açık tutam 1 kelepçe ve yakın tutam elüsyon çözüm çizmek için bir an 2 kelepçe.
  12. Elüsyon çözeltisi 500 ml kadar çekilir sonraYakın, 1 kelepçe ve açık bir tutam kelepçe 2 çimdik. Elüsyon çözüm maksimum% 20 bir pompa hızı ile 5 dakika dolaşmasına izin verin.
  13. Atık su hattı üzerinde rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 100 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Rampa kelepçesini sıkın ve örnek 1 dakika dolaşmasına izin verin. Retentat şişe numune hacmi sağlayarak tüp içine hava çekerek kaçının retentat şişe giren L / S 15 tüp karşılamak için yeteri kadar yüksektir.
  14. Retentat şişeye örnek zorlar pompa yönünü tersine çevirmek. Pompa retentat şişede ~ 225 ml ve sonuç olarak toplam 20 saniye boyunca ters çalışmasına izin ver. Pompa kapatın.
  15. Pompa kafasından Masterflex I / P 73 tüp çıkarın ve manometre kesin. Boş elyaf Ultrafiltreler çıkmadan Masterflex L / S 24 tüp ayırın. Içine kalan örnek zorlamak için retentat şişe üstünde boru tutunşişe retentat.
  16. Şişeden tüm boru kesin olmayan bir havalandırma kapağı ile havalandırma kapağı değiştirin.
  17. ~ 225 ml retentat ile IMS / IFA prosedürü devam edin.

2. İmmunomanyetik Ayırma İşlemi

  1. Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması:
    1. Cryptosporidium / Giardia kombo kiti oda sıcaklığına ulaşmasını: Dynabeads dahil tamponlar izin verin.
    2. 1X SL-tampon A: 10X SL-tampon A 9 ml distile su 1 ml ekleyin.
  2. Etiketli 250 ml konik santrifüj tüpüne retentat şişe sıvı ~ 225 ml aktarın. Reaktif 10 ml su ile iki kez retentat şişede, durulama ve konik bir santrifüj tüpüne durulama ekleyin. 4. 15 dakika ° hiçbir fren C için 1500 xg'de süspansiyon santrifüjleyin.
  3. Dikkatle pelet hacmi her 0.5 ml (yani aspirat 1 için hava-su arayüzünden dolu pelet yukarıdaki 5 ml supernatant aspire5 1.3 ml'lik bir hacim pelet yukarıda ml ve aspirasyon 0.5 ml veya daha az) bir pelet için 5 ml kadar.
  4. Iyice vorteks ve / veya karıştırma pipet ile süpernatan içine pelletini. 1 ml içeren düz kenarlı Dynal L10 tüpüne sıvı her 5 ml hacimde transfer A ve SL-tampon B. 10X reaktif su 2.5 ml ile iki kez konik santrifüj tüpüne yıkayın ve durulama eklemek SL-tampon 10X her tamponlar dahil olmak üzere, L10 tüpe 12 ml toplam hacme getirmek L10 tüp.
  5. L10 tüpüne 100 ul iyi karıştırılmış tekrar süspanse edilir, anti-Cryptosporidium ve anti-Giardia Dynabeads her bir ekleme. Bir rotator karıştırıcı oda sıcaklığında 1 saat 18 rpm'de L10 tüp döndürün.
  6. MPC-6 mıknatıs ve hafifçe elini kaya 2 dakika tüp uçtan uca, 180 ° karşı L10 tüpün düz tarafı yerleştirin.
  7. Mıknatıs yüzü MPC-6 mıknatıs L10 tüp tutmak kadar, boncuk / (oo) kist kompleksleri bou uzak süpernatantı boşaltacaktırmıknatısa nd. Mıknatıs gelen L10 tüpünü çıkarın ve A tüpüne 1X SL-tamponu 0.5 ml ekleyin. Dikey konumda mıknatıslı MPC-S düzenlenen bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe A SL-tampon 1X 0.5 ml iki ek durulama kullanarak süspansiyonu aktarın.
  8. Yavaşça 1 dakika MPC-S mıknatıs 180 ° tüp sallayın. Yerde mıknatıs, mikrosantrifüj borusunun alt yönelik bir Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire.
  9. Mikrosantrifüj tüpünün ön tarafına 1X PBS 1 ml ekleyin, mıknatıs kaldırmak ve boncuklar süspanse kadar sadece hafifçe tüpü sallayın. Dikey konumda mıknatıs değiştirin ve yavaşça 1 dakika tüp 180 ° sallayın. PBS mümkün olduğunca fazla enkaz olarak kaldırmak için bir Pasteur pipeti kullanarak, boncuk pelet bozmadan, durulama aspire.
  10. Mıknatıs kaldırmak ve mikrosantrifüj tüpün arka yüzüne su reaktif 50 ul ilave edin. Vorteks 50 saniye boyunca tam hızda tüp,daha sonra, bir 30 ikinci bir vorteks takiben 10 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edilir tüpü. Mıknatısa boncuklar bağlayıcı ve sıvı içinde (oo) kistler bırakarak, eğimli bir konumda MPC-S içine mıknatıs yerini alır. Bir SingleSpot iyi slayt için (oo) kist süspansiyon uygulayın.
  11. İlk ayrışma içeren, aynı zamanda, sıvı uygulanması, adım 2.10 tekrarlanır. 37 ° C slayt iyi slayt için süspansiyon kuruması için 1 saat boyunca sıcak koyun slayt.

3. Boyama ve Sınav

  1. Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması:
    DAPI çözeltisi çalışmaktadır: 1X PBS ile 25 ml'ye DAPI stok solüsyonu (metanol içinde 2 mg / ml) 25 ul ekleyin. Mağaza stok ve 1 ° C ve karanlıkta 10 ° C arasında çalışma çözümleri.
  2. Ayrıca sürgüye metanol 50 ul uygulamak ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılır.
  3. Ayrıca sürgüye çalışma DAPI solüsyonu 50 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir.
  4. Bir Kimwi kullanınpe kuyudan DAPI fitil için. EasyStain 50 ul uygulayın. 30 dakika boyunca 35 ° C'de inkübe edilir.
  5. Bir Kimwipe ile iyi kapalı leke ve sonra yavaş yavaş iyi kenar üzerinde akmasını, soğuk EasyStain sabitleme tampon 300 ul ekleyin Wick. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir.
  6. Iyi olan tampon fitil ve EasyStain Montaj Orta 10 ul uygulamak için bir Kimwipe kullanın.
  7. Dikkatle oluşabilecek kabarcıkları çıkarırken, bir kapak kayma geçerlidir. Net oje ile kapak kayma sürün.
  8. Bir ookist veya kist andıran oval veya yuvarlak elma-yeşil flüoresan nesneler için, toplam 200X büyütmede, FITC filtresi kullanarak tüm slayt tarayın. Ayrıca 1000X toplam büyütmede, 1000X toplam büyütmede DAPI filtresi ile ve daha sonra DIC ile tüm bu nesneleri inceleyin. Kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ve morfolojik özellikleri kullanarak boyutu kaydedin.
  9. Belge sonuçları.

Not: Ek buluOrijinal prosedürü hakkında bilgi ver-EPA Method 1623 12 Aralık 2005 sürümü bulunabilir. Açıklanan teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon prosedürü EPA Method 1623 Bölüm 12.0 yerine kullanılır. Isı ayrışma EPA Method 1623 Bölüm 13.3.3 değiştirir. Bu prosedür, aynı zamanda ilave PBS bölümü 13.3.2.16 sonra Metot 1623 Aralık 2005 versiyonu içine sokulabilmektedir IMS durulama işlemi sırasında açıklanmaktadır. Bu değişiklikler dahil olmak üzere EPA Method 1623 için kullanılan sarf malzemeleri, reaktifler ve ekipmanların tam listesi ekipman listesi yer almaktadır.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Filtrasyon ve immunomanyetik ayırma işlemleri ile telafi ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri mikroskobik inceleme ile tespit edilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi toplam 200X büyütmede, her organizmanın tipik bir boyama desen, boyut ve şekle sergileyen Cryptosporidium küresel nesnesine bir oval olan parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3A parlak elma yeşili FITC floresanı sergileyen çapı 4 ila 6 mikron ). Yeşil bir jant ve belirgin bir çekirdek (DAPI negatif), yoğun mavi iç boyama, veya en fazla dört ayrı, gök mavisi çekirdeklerin (DAPI ile açık mavi iç boyaması: DAPI UV ile bir ookist aşağıdaki tipik özelliği kategorilerden birini sergileyecek pozitif - Şekil 3B). Atipik özellikler renk, yapı, ya DAPI floresans (örneğin, çok lekeli çekirdekleri, kırmızı iç yapıları floresanlama) sapmalar vardır. Flüoresan nesnenin tipik FITC ve DAPI boyaması için kriterleri karşıladığı takdirde, diferansiyel girişim con kullanılarak incelenirkontrast (DIC). Nesnesi, hücre duvarı süsleme veya hücre doldurma bir veya iki büyük çekirdek gibi atipik harici veya dahili morfolojik özellikleri incelenmiştir. Atipik yapılar tespit değilseniz, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedildi ve boş bir amorf yapı olarak veya mevcut 03:59 sporozoitlerine (Şekil 3C) ile kategorize edilir. Benzer şekilde, Giardia benzeri nesneleri FITC ve DAPI boyama gibi axonemes, medyan organları ve çekirdekleri gibi DIC özellikleri yönünden incelenir Giardia kistleri ovoid elma-yeşil parlak nesneler, 8 yuvarlak -. 5 tarafından uzun 18 um - 15 mikron parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3B) ile geniş. DAPI UV ile, Giardia kist DAPI negatif boyama veya DAPI pozitif özellikleri (Şekil 3E) sergileyecek. Cryptosporidium için tarif edildiği gibi floresan nesne ile aynı şekilde, tipik ve atipik özellikler için DIC tarafından incelenmiştir.Atipik gözlenen değilse, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedilir ve boş içeren amorf yapısında olarak, ya da bu iç yapı (Şekil 3F) bir veya daha fazla türü ile sınıflandırılmaktadır.

Atipik özelliklere sahip görülmektedir herhangi bir organizmanın (oo) kist olarak sayılmamalıdır. Çevre örneklerinin mikroskobik analizi otomatik floresan veya FITC-konjuge anti-Cryptosporidium ve / veya anti-Giardia antikorları 1 ile çapraz reaksiyona girebilir organizmalar olduğu gibi zor olabilir. Bir analist su mikrop ve Cryptosporidium ve Giardia belirlenmesi deneyim kazanmak için slaytlar gözden onlarca aşina olması önerilir. En az üç (oo) pozitif boyanma kontrolü slaytta kistler önce mikroskop her oturumuna karakterize edilmelidir.

Kalite kontrol örneklerinde yüzde rec belirlemek için (oo) kistleri ile çivili olabilirHesaplama kullanarak her protozoon için over:
(Oo) kist Yüzde Kurtarma = ((QC Örnek Sayısı - Unspiked Örnek gelen sayın) / Spike) x 100.

Şekil 1
Şekil 1. Teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon sisteminin grafik gösterimi. Tüp yardım için renk kodlu olan sistem montaj olduğunu.

Şekil 2
Şekil 2. Cryptosporidium ve Giardia (oo) kistler Temsilcisi floresan görüntü. Ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri FITC etiketli anti-Cryptosporidium / Giardia antikor ile boyandı. Oklar, Giardia kistleri, ok uçları, Cryptosporidium ookistleri. Dört Cryptosporidium ookistleri ve altı Giardia kistleri toplam odak düzlemi bulundu. Örnekleri gözlemler200X büyütme altında ed.

Şekil 3
. Karakterizasyonu için kullanılan Cryptosporidium ookistleri ve Giaridia kistlerin Şekil 3 Temsilcisi mikroskobik görüntüleri Cryptosporidium ookistleri (A - C).. Dört farklı gök mavisi DAPI çekirdekleri (B) ve oosit başına 1-4 sporozoitlerine (S) (C) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (A) çapında küresel nesneleri 4 ila 6 mikron parlak elma yeşili FITC floresans. Giardia kistleri (D - F). Ovoid nesnelere yuvarlak 8 Brilliant elma-yeşil floresans FITC - 5 tarafından uzun 18 um - dört gök mavisi DAPI çekirdek (E) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (D) ve bu tür bir veya daha fazla belirgin bir iç yapısı ile geniş 15 mikron çekirdek olarak (N), medyan gövdesi (M) ve ya axonemes (A) (F). Beyaz oklar, parlak elma yeşili floresans boyama ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri woturumlarda; beyaz ok uçları, DAPI pozitif çekirdek. Örnekler 1000X büyütme altında görülmektedir.

Discussion

Teğetsel akış boş elyaf ultrafiltrasyon Cryptosporidium ookistleri ve su Giardia kistlerinin başlangıç ​​konsantrasyonu için alternatif ve etkili bir tekniktir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon geleneksel filtreler daha ucuzdur. Farklı su matrisler çeşitli Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistleri konsantre yeteneğine sahiptir yana EPA Method 1623 için kullanılan mevcut filtrasyon teknikleri için yararlı bir alternatiftir. Diğer çoğu filtrasyon yöntemleri olduğu gibi, boş elyaf ultrafiltrasyon son derece bulanık örnekleri ile kirlenme eğilimli. Yüksek basınçlı su filtresi kirlenme sonucu olurdu; bu nedenle filtrasyon çalışması sırasında basıncı izlemek için tavsiye edilir. Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistler ek olarak, oyuk-fiber ultrafiltrasyon bakteri ve virüsler 1-3,5,8 konsantre yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon oBu yöntemde utlined tek bir örnek olarak birden organizmalar konsantre etmek için kullanılabilir. Bu, 200 ve 250 ml arasında nihai bir hacim elde etmek (oo) kist kaybına neden olabilir bu ekstra santrifüj adımları böylece konsantrasyon prosedürü kritik son adım, (adım 2.2) kaçınılmalıdır olduğu dikkat çekicidir. Retentat şişe içine tüm ookistleri veya kistler zorlamak için yeterince sıvı hacmi söz konusu olamayacağından Ancak, şişe hacmi çok düşük bırakabilirsiniz verimleri üzerindeki olumsuz etkileri olabilir. Bu nedenle, 200 ve 250 ml arasında bir nihai hacmi sağlamak için tavsiye edilir.

Isıl ayrışma Yöntem, 1623 yılında asit ayrışma adıma bir alternatiftir. Bu alternatif adım Cryptosporidium ookist kurtarma geliştirmek ve nehir veya su reaktif 9 ya izole, yöntem farklılıkları azaltmak için gösterilmiştir. Asit ve ısı ayrışma yöntemlerinin yan yana karşılaştırma göstermiştir ki çözülme için ısı kullanımıte immunomanyetik boncuklar organizmalar Cryptosporidium ve Giardia hem de yüksek ortalama kurtarma üretti. Buna ek olarak, Cryptosporidium ve Giardia kurtarma hassasiyeti asit ayrışma 9 ile karşılaştırıldığında ısı ayrışma ile işlenen örneklerin daha iyiydi.

Konsantrasyonu adım olarak HFUF ile birleşmesiyle bir çok mikroorganizma konsantre olma yeteneği sunarak daha fazla esneklik sağlar. Buna ek olarak mevcut Yöntem 1623 filtreleme seçenekleri daha az pahalı bir alternatif.

Disclosures

Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı Yeraltı Suyu ve İçme Suyu Teknik Destek Merkezi'nin Ofisi işbirliği ile Araştırma ve Geliştirme kendi Ofisi aracılığıyla burada açıklanan araştırma finanse. Tüm çalışmalar US EPA, Cincinnati, Ohio yerinde desteklenmiştir. Bu makalede açıklanan bilgiler Shaw Çevre ve Altyapı, Inc sözleşme kapsamında Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı (Sözleşme EP-C-06-031) tarafından kısmen veya tamamen finanse edilmiş olsa da, mutlaka görüşünü yansıtmaz Ajansı ve hiçbir resmi ciro sonucuna varılamaz. Bu Ajansı gözden geçirilir ve yayın için onaylanmıştır.

Acknowledgments

Biz onun teknik destek için bu yazının ve Doug Hamilton eleştiri için Ann Grimm ve Michael Zimmerman teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters Dial Medical REXEED25S/R
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent Cole-Parmer EW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-36
I/P Precision Brushless Drive Cole-Parmer EW-77410-10
I/P Easy Load Pump Head Cole-Parmer EW-77601-10
Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" US Plastics 62064
Masterflex T-connector L/S 15-25 Cole-Parmer EG-30613-12
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle Cole-Parmer EW-06257-10
10 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11C
Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B Cole-Parmer EW-06258-10
Pressure gauge Cole-Parmer A-680-46-10
Straight coupling, NPT(F), 1/4" Cole-Parmer EW-06469-18
NPT branch tee, natural pp Cole-Parmer A-30610-75
Pinch clamps, 1/2" Cole-Parmer EW-06833-00
Custom fit DIN adapters Molded Products Corp MPC-855NS.250
Ring stand Fisher Scientific 14-670B
Ring stand clamps Fisher Scientific 05-769-6Q
Keck ramp clamp, 14mm Cole-Parmer EW-06835-10
Sodium polyphosphate Sigma-Aldrich 305553
Sodium thiosulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 72050
Antifoam Y-30 emulsion Sigma-Aldrich A5758
Tween-80 Sigma-Aldrich P1754
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer VWR international IR314-0025
Centrifuge bottle rack Fisher Scientific 05-663-103
250 ml conical centrifuge tubes Corning 430776
Disposable funnel Cole-Parmer U-6122-10
Wash bottle Cole-Parmer U-06252-40
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-15R
Swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. ARIES SX4750
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes Beckman Coulter Inc. 349849
200 μl large bore pipette tips Fisher Scientific 02-707-134
VacuShield Filter Gelman 629-4402
5 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit IDEXX 73002
50 ml conical centrifuge tubes Falcon BD 352098
Dynal L10 flat sided tubes IDEXX 74003
Timer VWR international 23609-202
Dynal MPC-6 magnet IDEXX 12002D
1 ml pipettes VWR international 53283-700
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
1000 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P1000/DF1000ST
100 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P100/DF100ST
9 inch Pasteur pipettes VWR international 14672-412
Dynal MPC-S magnet IDEXX 12020D
Vortex VWR international 14216-188
Dynabeads rotator mixer IDEXX 94701
Heat block Fisher Scientific 11-718-2
Lab Armor Beads Lab Armor 42370-750
Digital thermometer Fisher Scientific 15-077-60
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) Sigma-Aldrich P4417
Single Spot slides IDEXX 30201
Cover glass Corning 287018
EasyStain direct kit BTF -
10 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P10 & DF10ST
4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Clear nail polish Fisher Scientific S30697
Methanol Fisher Scientific L6815
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Incubator Boekel Scientific 133000
slide warmer Fisher Scientific 11-474-521
Immersion oil, Type A ND= 1.515 Nikon Instruments MXA20234
Nikon 90i microscope with DIC capabilities Nikon Instruments MBA 77000
Plan APO 100X oil objective Nikon Instruments MRD01901
Plan Achro 20X Nikon Instruments MRL00202
FITC filter Nikon Instruments 96302
DAPI filter Nikon Instruments 96301
X-cite fluorescence illuminator Nikon Instruments 87540
Lens paper Nikon Instruments 76997
Biohazard disposable bag Fisher Scientific 01-829D
Biohazard sharps container Fisher Scientific 14-827-117
3 % hydrogen peroxide VWR international BDH3540-2
Bleach Fisher Scientific 1952030
Wypall Kimberly Clark 34790

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
  2. Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
  3. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
  4. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
  5. Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
  6. Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
  7. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
  8. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
  9. Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
  10. Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
  11. Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
  12. USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
  13. Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
  14. Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics