एकल अणु इमेजिंग के लिए कॉम्पैक्ट क्वांटम डॉट्स

Published 10/09/2012
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Summary

हम एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए कम से कम hydrodynamic आकार के साथ कोलाइडयन क्वांटम डॉट्स की तैयारी का वर्णन करता है. पारंपरिक क्वांटम डॉट्स की तुलना में, इन नैनोकणों गोलाकार प्रोटीन के आकार में समान हैं और एकल अणु चमक, खिलाफ स्थिरता photodegradation, और प्रोटीन और कोशिकाओं को nonspecific बाध्यकारी प्रतिरोध के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.

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Smith, A. M., Nie, S. Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging. J. Vis. Exp. (68), e4236, doi:10.3791/4236 (2012).

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Abstract

Protocol

निम्नलिखित संश्लेषण प्रक्रिया मानक हवा मुक्त तकनीक और एक वैक्यूम / अक्रिय गैस कई गुना का उपयोग शामिल है, विस्तृत कार्यप्रणाली 10 और 11 संदर्भ में पाया जा सकता है. सभी संभावित विषैले और ज्वलनशील पदार्थों के लिए MSDS का उपयोग करने से पहले परामर्श किया जाना चाहिए और सभी ज्वलनशील और / या हवा अस्थिर यौगिकों एक दस्ताना बॉक्स या दस्ताने बैग में पट सील शीशियों में aliquoted किया जाना चाहिए.

1. पारा कैडमियम selenide के संश्लेषण (Hg एक्स सीडी 1-x से) क्वांटम डॉट कोर

  1. एक सेलेनियम का 0.4 trioctylphosphine (ऊपर) में एम समाधान तैयार करें. सेलेनियम (.316 छ, 4 mmol) एक 50 मिलीलीटर फ्लास्क 3 गर्दन जोड़ें, तो खाली और argon एक Schlenk लाइन का उपयोग करने के साथ भरें. हवा मुक्त शर्तों के तहत (सूखी नाइट्रोजन या argon माहौल), 100 से 10 मिलीलीटर शीर्ष और गर्मी जोड़ने ° C जबकि 1 घंटा के लिए एक स्पष्ट, बेरंग समाधान उपज क्रियाशीलता. कमरे के तापमान को हल शांत और कुप्पी अलग निर्धारित करें.
  2. 250 मिलीलीटर फ्लास्क 3 गर्दन, कैडमियम ऑक्साइड जोड़ने (CDO ०.०,७७० छ, 0.6 mmol), tetradecylphosphonic एसिड (TDPA, 0.3674 छ, 1.32 mmol), और octadecene (क़सीदा, 27.6 मिलीग्राम), और एक Schlenk लाइन का उपयोग करते हुए क्रियाशीलता समाधान खाली. 100 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बढ़ाने के लिए और कम उबलते बिंदु अशुद्धियों को दूर करने के लिए के लिए एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए को खाली करने.
  3. Argon या नाइट्रोजन गैस के तहत, 1 घंटे के लिए 300 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण करने के लिए पूरी तरह से भंग CDO गर्मी. समाधान एक लाल रंग से स्पष्ट और बेरंग बदल जाएगा. कमरे के तापमान को हल बढ़िया.
  4. कैडमियम समाधान के लिए जोड़ें hexadecylamine (HDA, 7.0 छ), 70 से गर्मी ° C को खाली करने, और. एक बार एक निरंतर दबाव उपलब्ध हो जाता है, 100-110 के तापमान में वृद्धि डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए समाधान भाटा. अक्रिय गैस Schlenk लाइन वाल्व स्विच और thermocouple समाधान में सीधे डाल.
  5. हवा मुक्त शर्तों के तहत, इस समस्या का समाधान करने के लिए जोड़ने के diphenylphosphine (डीपीपी, 100 μl) और 310 डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि 0.4 एम शीर्ष से समाधान के 7.5 मिलीलीटर को निकालें(3 mmol सेलेनियम) एक 16 गेज सुई जुड़ी एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक सिरिंज में.
  6. एक बार तापमान 310 डिग्री सेल्सियस पर equilibrates, 0 तापमान नियंत्रक सेट डिग्री सेल्सियस और तेजी से कैडमियम समाधान में शीर्ष से समाधान सीधे इंजेक्षन. समाधान बेरंग से पीला, नारंगी के लिए परिवर्तन और तापमान जल्दी छोड़ ~ 280 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर से वृद्धि होगी प्रतिक्रिया के 1 मिनट के बाद, पोशिश हीटिंग से फ्लास्क को हटाने और जल्दी से हवा की एक धारा के साथ शांत जब तक तापमान में कम से कम 200 डिग्री सेल्सियस है
  7. जब तापमान 40 ~ तक ° सी, 30 मिलीलीटर hexane साथ पतला, शेष कैडमियम अग्रदूत के सबसे बाहर समाधान के आदी हो जाएगा. Centrifugation (५,००० XG, 10 मिनट) द्वारा इस तलछट निकालें.
  8. छह 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में से प्रत्येक में कच्चे तेल nanocrystal समाधान की 12 मिलीग्राम, 40 मिलीग्राम एसीटोन, अपकेंद्रित्र (10 मिनट के लिए 5000 XG) के साथ पतला, और ध्यान से छानना और तैरनेवाला त्यागें.
  9. Nanocr भंगhexane में ystal (25 मिलीलीटर कुल मात्रा छर्रों). इस समाधान मेथनॉल की एक समान मात्रा के साथ 3 बार निकालें, शीर्ष चरण को बनाए रखना है. निकासी के लिए 3, मेथनॉल की मात्रा ~ 15 मिलीलीटर समायोजित किया जा सकता है के लिए लगभग 200 सुक्ष्ममापी शुद्ध सीडीएसई QDs की एक केंद्रित हेक्सेन समाधान प्राप्त करने के लिए. इस प्रतिक्रिया के ठेठ उपज 2.3 एनएम (50-60% प्रतिक्रिया उपज) की एक व्यास के साथ सीडीएसई nanocrystals की 3 μmol है.
  10. Nanocrystal व्यास और अवशोषण यूवी विज़ स्पेक्ट्रम को मापने और Mulvaney और सहकर्मियों 12 आकार ढाले चार्ट और Bawendi और 13 सहकर्मियों के विलुप्त होने correlations परामर्श एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. जानकारी के लिए देखें परिशिष्ट.
  11. पारा कटियन विनिमय nanocrystals: आंशिक रूप से पारा के साथ विमर्श किया जा सकता अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन लाल पारी. 3 मिलीग्राम हेक्सेन, 2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म, एक मिलीलीटर 200 सुक्ष्ममापी सीडी: निम्नलिखित के साथ एक 20 मिलीलीटर stirbar (इस प्रतिक्रिया को वांछित के रूप में बढ़ाया जा सकता है) के साथ कांच की शीशी में क्रम में मिक्ससे QD समाधान (200 nmol), 15 μl (ओला) oleylamine, और 0.1 क्लोरोफॉर्म (ओटी) में पारा 2 एम समाधान के 500 μl. पारा octanethioate (2 HgOT) प्रतिक्रिया पारा एसीटेट और मिथेनॉल में octanethiol (परिशिष्ट देखें) द्वारा तैयार किया जा सकता है. कटियन विनिमय प्रतिक्रिया आय के रूप में, लाल पारी की हद यूवी विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के साथ नजर रखी जा सकती है. वांछित अवशोषण बैंड के बाद प्राप्त किया गया है, 350 एनएम nanocrystal समाधान के अवशोषण को मापने के लिए और नए विलुप्त होने गुणांक निर्धारित करते हैं, सोचते हैं कि nanocrystal एकाग्रता (इस उदाहरण में 30.7 सुक्ष्ममापी) नहीं बदला है. Unreacted पारा को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने: 5 decane मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर हेक्सेन, और 7 मिलीग्राम मेथनॉल जोड़ने और समाधान निकालने के लिए, शीर्ष चरण युक्त nanocrystals रखने. दो बार हेक्सेन और मेथनॉल के साथ और अधिक निकालें, और मेथनॉल की मात्रा समायोजित इतना है कि शीर्ष चरण ~ 7 मिलीग्राम है. यदि चरणों के लिए अलग करने के लिए धीमी गति से कर रहे हैं, समाधान (5,000 XG centrifuged किया जा सकता है,10) मिनट. 40 मिलीलीटर एसीटोन द्वारा पीछा वर्षा प्रेरित nanocrystals 100 μl टॉप, 100 μl ओला, और 100 μl oleic एसिड जोड़ें. Centrifugation माध्यम nanocrystals एकत्र और 3 मिलीग्राम हेक्सेन में फैलाने. फिर अपकेंद्रित्र अघुलनशील घटकों nanocrystal एकाग्रता को हटाने और फिर से निर्धारित करने के लिए, 350 एनएम पर नए विलुप्त होने गुणांक का उपयोग. अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 24 घंटे के लिए nanocrystal उम्र के लिए समाधान की अनुमति दें.

2. कैडमियम जस्ता सल्फाइड के विकास शैल (सीडी y Zn S-1-y)

  1. 50 मिलीलीटर 3 गर्दन बोतल में 0.1 एम खोल अग्रदूत समाधान तैयार. Cadmium अग्रदूत कैडमियम एसीटेट (230.5 मिलीग्राम, 1 mmol) हाइड्रेट और 10 मिलीलीटर oleylamine (ओला):. जिंक अग्रदूत: जस्ता (183.5 मिलीग्राम, 1 mmol) एसीटेट और 10 मिलीलीटर ओला. सल्फर के अग्रदूत: सल्फर (32.1 मिलीग्राम, mmol 1) और 10 मिलीलीटर क़सीदा. वैक्यूम के अंतर्गत, 1 घंटे के लिए भाटा के लिए प्रत्येक समाधान गर्मी स्पष्ट समाधान उपज है, और फिर argon साथ चार्ज. सल्फर समाधान हो सकता हैकमरे के तापमान पर ठंडा हो, लेकिन कैडमियम और जस्ता व्यापारियों लगभग 50 पर बनाए रखा जाता है डिग्री सेल्सियस खोल अग्रदूत मात्रा की गणना 14 संदर्भ में पाया जा सकता है.
  2. 3 गर्दन एक फ्लास्क जोड़ें: पारा x सीडी 1-x एसई (120 nmol, 2.3 एनएम व्यास) QDs, स्तोत्र (2 मिलीग्राम), और trioctylphosphine ऑक्साइड (Topo, 250 मिलीग्राम). Schlenk लाइन का उपयोग कर कमरे के तापमान पर हेक्सेन खाली. 100 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए भाटा तापमान बढ़ाएँ. Argon या नाइट्रोजन गैस Schlenk लाइन वाल्व बदलें और nanocrystal समाधान में thermocouple डालने.
  3. 120 तापमान बढ़ाएँ डिग्री सेल्सियस, सल्फर अग्रदूत समाधान के 0.5 monolayers (140 μl) जोड़ने के लिए, और प्रतिक्रिया के लिए 15 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं. लघु aliquots (<50 μl) करने के लिए प्रतिक्रिया प्रतिदीप्ति और / या यूवी विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के प्रगति की निगरानी के लिए एक गिलास सिरिंज का उपयोग कर हटाया जा सकता है. 140 तापमान बढ़ाएँ डिग्री सेल्सियस, कैडमियम अग्रदूत समाधान की 0.5 monolayers जोड़ने (140) μl, और 15 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं. 500 μl प्रतिक्रिया समाधान के लिए ओला निर्जल जोड़ें.
  4. 160 डिग्री सेल्सियस पर सल्फर अग्रदूत समाधान के 0.5 monolayers (220 μl) 170 में जस्ता अग्रदूत समाधान की एक बराबर मात्रा द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस से इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बीच 15 मिनट के साथ जोड़ने के लिए. फिर 180 डिग्री सेल्सियस पर सल्फर अग्रदूत (150 μl) समाधान और जस्ता 15 मिनट के अंतराल में अग्रदूत समाधान के 0.25 monolayers जोड़ें.
  5. समाधान को कमरे के तापमान को शांत करते हैं और फिर इन कणों के लिए एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रम का उपयोग कर एक नया विलुप्त होने गुणांक की गणना करने के लिए, यह सोचते हैं कि nanocrystals की संख्या (3.8 मिलीलीटर प्रतिक्रिया समाधान में nmol 120) नहीं बदला है. एक फ्रीजर में स्टोर एक कच्चे मिश्रण के रूप में प्रतिक्रिया समाधान, nanocrystals thawed किया जा सकता है और शुद्ध रूप में एक ही वर्गों 1.8 और 1.9 में वर्णित विधि का उपयोग करने की आवश्यकता है.
  6. nanocrystals इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, यूवी विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी, और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग लक्षण वर्णन किया जा सकता है. क्वांटम उपज हो सकता हैबिल्कुल एक एकीकृत या अपेक्षाकृत एक ज्ञात संदर्भ 15 के तरीकों का उपयोग कर मानक की तुलना में क्षेत्र की गणना का उपयोग कर.

3. चरण हस्तांतरण

  1. एक 50 मिलीलीटर 3 गर्दन फ्लास्क / कोर खोल पारा x 1 x से सीडी सीडी / y 1-y QDs Zn (5 मिलीग्राम, 20 सुक्ष्ममापी) शुद्ध जोड़ें और एक सूखी फिल्म उपज के लिए एक उच्च वैक्यूम के तहत हेक्सेन को हटा दें. Argon साथ फ्लास्क भरें, nanoparticle फिल्म और गारा गर्मी निर्जल pyridine 80 (3 मिलीग्राम) जोड़ने के डिग्री सेल्सियस नैनोकणों 1-2 घंटा के दौरान पूरी तरह से भंग होगा.
  2. समाधान के लिए 1 thioglycerol (1 मिलीग्राम) जोड़ें और 80 में हलचल सी ° 2 घंटे के लिए. फिर कमरे के तापमान को हल शांत और triethylamine (0.5 मिलीलीटर) को जोड़ने के लिए thioglycerol deprotonate. 30 मिनट के लिए हिलाओ. समाधान triethylamine के अलावा इस विलायक मिश्रण में ध्रुवीय nanocrystals की गरीब विलेयता के कारण बाद बादल बन सकते हैं.
  3. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब cont में QD समाधान स्थानांतरण20 मिलीलीटर हेक्सेन और 20 मिलीलीटर एसीटोन का एक मिश्रण aining, और अच्छी तरह से मिश्रण. Centrifugation (5,000 XG, 10 मिनट) के माध्यम से उपजी nanocrystals अलग, और एसीटोन के साथ गोली धो लो.
  4. QD DMSO में गोली (5 मिलीग्राम) स्नान sonication के साथ, और फिर अपकेंद्रित्र (सात हज़ार XG, 10 मिनट) को भंग करने के लिए संभव समुच्चय को दूर. एक अवशोषण यूवी विज़ स्पेक्ट्रम nanoparticle से एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. शुद्ध QDs का यह समाधान 3 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए, के रूप में सतह thiols धीरे हवा में परिवेश की स्थिति के तहत oxidize सकते.
  5. DMSO के साथ 10 या उससे कम सुक्ष्ममापी QD समाधान पतला और एक 50 मिलीलीटर फ्लास्क हस्तांतरण. DMSO में thiolated polyacrylic एसिड (परिशिष्ट में वर्णित संश्लेषण) की 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें. बहुलक (प्रति nmol QDs 0.15 मिलीग्राम बहुलक) QD समाधान के लिए समाधान dropwise जबकि भावप्रवण और degas 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान जोड़ें.
  6. Argon और 80 ° C 90 मिनट के लिए करने के लिए गर्मी के साथ समाधान / QD बहुलक शुद्ध. फिर कमरे के तापमान को शांत समाधान एकघ dropwise 50 मिमी सोडियम borate, पीएच 8 के एक बराबर मात्रा जोड़ने. 10 मिनट के लिए हिलाओ.
  7. डायलिसिस (20 केडीए cutoff) के माध्यम से 50 मिमी सोडियम borate, पीएच 8 में QDs शुद्ध, और फिर एक केन्द्रापसारक फिल्टर (10 केडीए cutoff) कणों का उपयोग ध्यान केंद्रित. एक अवशोषण यूवी विज़ स्पेक्ट्रम से एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.

4. खूंटी कोटिंग

  1. में एक 4 मिलीलीटर stirbar साथ कांच की शीशी में 750 दा monoamino polyethylene glycol (30 मिलीग्राम, 40 μmol) 40,000 x दाढ़ अतिरिक्त के साथ मिश्रण borate बफर में 1 nmol QDs. यदि एक विशिष्ट कार्यक्षमता रासायनिक को nanocrystals (जैसे hydrazide या maleimide) के लिए जोड़ा जा रहा है, यह एक heterobifunctional अमीनो खूंटी (30% तिल अंश आम तौर पर अच्छी तरह से काम करता है) के साथ एमिनो खूंटी के एक अंश की जगह द्वारा शुरू किया जा सकता है. Nanocrystal borate बफर के साथ 1 सुक्ष्ममापी समाधान पतला. इस प्रतिक्रिया के रूप में वांछित बढ़ाया जा सकता है.
  2. DMSO (144 μl) में DMTMM (20 मिलीग्राम, 72 μmol) की एक ताजा समाधान तैयार. यह समाधान संक्षेप में गर्म किया जा सकता यूनल का पानी गर्म या एक स्नान sonicator में जलमग्न करने के लिए पूरी तरह से भंग DMTMM की एक धारा nder. जल्दी QD समाधान के लिए इस 0.5 एम DMTMM समाधान का एक 25,000 x दाढ़ अतिरिक्त (50 μl) को जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हलचल.
  3. दोहराएँ 4.2 चार गुना अधिक कदम खूंटी के साथ nanocrystal सतह तर. अंत में, 200 μl 1 एम Tris बफर जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया बुझाना और डायलिसिस, केन्द्रापसारक फिल्टर, या ultracentrifugation का उपयोग nanocrystals को शुद्ध.
  4. nanocrystals monodispersity, hydrodynamic आकार, सतह और तरल क्रोमैटोग्राफी, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रभारी के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. Hydrodynamic आकार और आकार वितरण एक स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (जीई AKTAprime प्लस) का उपयोग निर्धारित करने के लिए, 260 या 280 एनएम पर एक Superose 6 कॉलम, 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक PBS बफर eluent के साथ प्रवाह की दर, और अवशोषण का पता लगाने का उपयोग करें. आणविक भार मानकों में से उन लोगों के साथ nanoparticle क्षालन बार से तुलना कर लें. Agarose जेल के लिए electrophoप्रतिरोध, 50 मिमी सोडियम borate (8.5 पीएच) बफर या 50 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 0.5% agarose जेल तैयार करते हैं, 10% और कुओं में ग्लिसरॉल लोड के साथ 1 सुक्ष्ममापी नमूने मिश्रण है, और 30 मिनट के लिए 100 वी पर चलाने . एक यूवी हाथ छड़ी या यूवी transilluminator का उपयोग जेल में और प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए nanocrystals छवि. एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्तर पर nanocrystals छवि, 10 मिमी फॉस्फेट बफर में कण 0.2 एनएम को कमजोर करने के लिए, एक गिलास coverslip पर समाधान के 2.5 μl ड्रॉप, और ध्यान से तरल मनका के शीर्ष पर एक दूसरे coverslip का प्रसार करने के लिए जगह coverslips के बीच एक फिल्म. सतह बाध्य छवि उत्तेजना के साथ 400-580 एनएम और एक इलेक्ट्रॉन बढ़ सीसीडी कैमरा के बीच तरंगदैर्य पर दोनों epifluorescence या TIRF मोड में एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (आदर्श रूप में कम से कम 1.40) का उपयोग कर कणों. सटीक इमेजिंग पैरामीटर माइक्रोस्कोपी सेटअप के बीच अलग अलग होंगे.

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Representative Results

चित्रा 2 प्रतिनिधि और सीडीएसई nanocrystals, पारा एक्स सीडी 1 x कटियन विनिमय के बाद से nanocrystals, और पारा x 1-x से सीडी सीडी / y 1-y खोल वृद्धि के बाद nanocrystals Zn लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के अवशोषण को दर्शाया गया है. कोर सीडीएसई nanocrystals 15% के पास एक प्रतिदीप्ति की मात्रा उपज (लंबी तरंगदैर्य गहरे जाल उत्सर्जन सहित), लेकिन इस दक्षता पारा आदान प्रदान के बाद 1% से कम है, संभावना सतह परमाणु विघटन 9 के माध्यम से शुरू करने के लिए वाहक जाल चार्ज के कारण चला जाता है. हालांकि सीडी y S-1-y Zn की एक पतली खोल के विकास के अधिक से अधिक 70% है, जो काफी हद तक पानी (50% ठेठ है) को हस्तांतरण के बाद बनाए रखा है इस क्षमता को बढ़ा देता है. इसके विपरीत, पारा समावेश के बिना सीडीएसई / सीडी y Zn S-1-y nanocrystals उनके पानी में मात्रा उपज का एक बड़ा हिस्सा खो जब तक एक मोटी खोल उगाया जाता है. के इस प्रकार कोर nanocrysta में पारा शामिल द्वाराएल, छोटे आकार nanocrystal की चमक त्याग के बिना हो सकता है (3 चित्रा में मंदिर देखें) रखा जा सकता है. यह ध्यान दें कि सीडी y S-1-y Zn साथ कैपिंग खोल सामग्री में इलेक्ट्रॉनिक चार्ज वाहक के रिसाव की वजह से लाल स्पेक्ट्रा बदलाव के लिए महत्वपूर्ण है, इस बदलाव सीडीएसई 16 कोर के लिए 20-30 एनएम के आसपास है, और के साथ बढ़ता है कोर में पारा सामग्री बढ़ रही है (100 एनएम).

एक चरण 2 पानी के लिए कदम हस्तांतरण उपयोग nanocrystals है कि आगे करने के लिए समूहों और समुच्चय को दूर छँटाई आकार की आवश्यकता नहीं है की एक सजातीय जनसंख्या को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. पहले चरण में, nanocrystals 1 thioglycerol, जो nanocrystal की सतह पर oleylamine displaces का उपयोग DMSO स्थानांतरित कर रहे हैं. तो Thioglycerol एक रेखीय multidentate बहुलक के साथ बदल दिया है, hydrodynamic आकार में एक न्यूनतम वृद्धि कोटिंग जैविक (<4 एनएम contributi से उत्पन्न साथ अत्यधिक स्थिर कणों में जिसके परिणामस्वरूपhydrodynamic व्यास). आकार अपवर्जन chromatogram चित्र 4a में चित्रित की पुष्टि करता है कि आकार (75 केडीए) conalbumin के लिए इसी तरह की है, और 750 दा अमीनो खूंटी के साथ संशोधन के बाद सिर्फ 12 एनएम, आकार में वृद्धि हुई है, एक आईजीजी एंटीबॉडी के समान . खूंटी संशोधन सतह प्रभारी, के रूप में 4b चित्रा में चित्रित agarose जेल वैद्युतकणसंचलन प्रयोग में पुष्टि neutralizes. हम नियमित रूप से आकार के त्वरित लक्षण, आकार के वितरण, और सतह के प्रभारी के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करें. गतिशील प्रकाश बिखरने और जीटा potentiometry भी इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन इन ultrasmall कणों के पार अनुभाग बिखरने बहुत छोटा है, और हमने पाया है कि वाणिज्यिक उपकरणों से परिणाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं चित्रा 5a पता चलता है कि इन nanocrystals की एक epifluorescence माइक्रोग्राफ एक पर जमा है. कांच coverslip और 545 एनएम दिखाई प्रकाश के साथ उत्साहित. ये nanocrystals ओ आसानी से कर रहे हैंएक इलेक्ट्रॉन बढ़ सीसीडी कैमरा के साथ 30 फ्रेम प्रति सेकंड के स्तर पर एकल अणु bserved चित्रा 5b से पता चलता है कि फ्लोरोसेंट हर फ्रेम में मनाया कणों की संख्या लगातार उत्तेजना के साथ समय के साथ घटती - बढ़ती है, इस निमिष और photodegradation के एक संयोजन के कारण है . निमिष 1 ~ 7 मिनट के लिए हावी पहले oxidative photodegradation धीरे स्पष्ट हो जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 nanoparticle संश्लेषण प्रक्रिया के योजनाबद्ध चित्रण. (क) कैडमियम और सेलेनियम व्यापारियों सीडीएसई nanocrystals, जो पारा octanethiolate के साथ व्यवहार कर रहे हैं, आंशिक सीडी → पारा कटियन विनिमय उत्प्रेरण Hg x 1 x से त्रिगुट मिश्र धातु nanocrystals सीडी उपज उत्पन्न की प्रतिक्रिया है. सीडी y S-1-y Zn की एक खोल तो कैडमियम एसीटेट, जस्ता एसीटेट, और सल्फर का उपयोग कोर पर उगाया जाता है. (ख) के रूप में synthesized, इन nanocrystals nonpolar जैविक ligands (oleylamine) के साथ लेपित हैं. Buffers में जलीय इन कणों solubilize, ligands एक multidentate बहुलक ligand, जो covalently एमिनो खूंटी युग्मित है के साथ बदल रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 पारा x 1 x से सीडी सीडी / y S-1-y nanocrystals Zn ऑप्टिकल गुण. (एक) (काला) अवशोषण और प्रतिदीप्ति सीडीएसई nanocrystal कोर के स्पेक्ट्रा (लाल), पारा X CD कटियन विनिमय के बाद 1 x से कोर, और पारा x 1-x से सीडी / y 1-y खोल वृद्धि के बाद nanocrystals Zn सीडी . स्पेक्ट्रा स्पष्टता (ख) पारा x 1 x से सीडी सीडी / y 1 y पारा निगमन के रिश्तेदार अलग मात्रा के साथ एस Zn प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के लिए भरपाई कर रहे हैं. नीले स्पेक्ट्रम शून्य पारा सामग्री (0 = एक्स, सीडीएसई) के साथ कोर को दर्शाया गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (क) और (ख) पारा x 1 x से सीडी सीडी / y 1-y एस nanocrystals Zn कण आकार के वितरण, एक औसत व्यास ± 3.2 के मानक विचलन ± 0.6 एनएम दिखा.

चित्रा 4
चित्रा 4 पारा x 1 x से सीडी सीडी / y 1-y जलीय घोल में QDs Zn Hydrodynamic लक्षण वर्णन. (एक) का आकार nanocrystals के बहिष्कार chromatogram (लाल) से पहले और बाद में (नीला) एमिनो खूंटी संयुग्मन एक multidentate बहुलक ligand में लेपित. आण्विक वजन प्रोटीन मानकों भूखंडों ऊपर संकेत कर रहे हैं. (ख) सोडियम borate बफर में QDs agarose जेल वैद्युतकणसंचलन प्रयोग (पीएच 8.5 ~) (बाएं से पहले) और बाद में (दाएं) एमिनो खूंटी विकार. अच्छी तरह से एक तीर और इलेक्ट्रोड छोर सही पर संकेत के साथ चिह्नित है, दिखा रहा है कि विकार से पहले nanocrystals विस्थापित anionic कणों और PEGylated nanocrystals electrostatically तटस्थ हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5 Hg X CD 1 / एक्स से सीडी y Zn 1-y एस QDs फॉस्फेट बफर में एक गिलास coverslip, epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ imaged adsorbed पर. (क) QD छवि प्रति सेकंड 33 तख्ते पर प्राप्त की. छवि 15 सुक्ष्ममापी x 15 सुक्ष्ममापी है. (ख) 545 (30 एनएम bandpass) उत्तेजना फिल्टर एनएम के साथ पारा आर्क दीपक के साथ 20 मिनट और एक 625 एनएम (20 एनएम bandpass) उत्सर्जन फिल्टर और 100x 1.4 NA उद्देश्य के लिए निरंतर रोशनी के दौरान देखने के क्षेत्र के प्रति फ्लोरोसेंट QDs की संख्या. देखने के 3 क्षेत्रों से माप 20 मिनट से अधिक 12.5 फ्रेम प्रति सेकंड में औसतन थे.

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Discussion

पारंपरिक सीडीएसई क्वांटम डॉट्स की तुलना में, त्रिगुट मिश्र धातु पारा एक्स सीडी 1-x से nanocrystals आकार और प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य स्वतंत्र रूप में देखते जा सकता है. आकार 1 सीडीएसई nanocrystal कोर के संश्लेषण के दौरान चयन किया जाता है, और प्रतिदीप्ति एक माध्यमिक पारा कटियन विनिमय कदम है, जो काफी हद तक nanocrystal 9 आकार में परिवर्तन नहीं करता तरंगदैर्ध्य में चुना जाता है. यह महत्वपूर्ण है शुद्ध पारा x सीडी 1-x से nanocrystals कैपिंग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं करने के लिए अनुमति देते हैं. यह कमजोर adsorbed पारा फैटायनों के कुछ nanocrystal जाली में विसरित करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रक्रिया के होते हैं, निकट अवरक्त में एक दूसरे प्रतिदीप्ति बैंड की अनुमति के बिना अक्सर dissociated पारा आयनों से HGS nanocrystals की सजातीय nucleation की वजह से मनाया जाता है.

इस काम में दिखाए गए उदाहरण में, हम 2.3 एनएम के पास एक आकार के साथ सीडीएसई कोर तैयार है, जो किया जा सकता हैपारा के राशि कोर जाली में शामिल फेरबदल करके कैपिंग के बाद 550-800 एनएम के बीच प्रतिदीप्ति में देखते है. एक 2.5 monolayer खोल, इन QDs के अंतिम व्यास 3.2 एनएम के पास था, जो अनिवार्य रूप से छोटे आकार nanoparticle कि है कि हम दोनों पर्याप्त photostable और पर्याप्त उज्ज्वल है एकल अणु इमेजिंग के लिए तैयार कर सकते हैं (350,000 एम -1 सेमी निकट विलुप्त होने के गुणांक 400 एनएम और पानी में 50% के पास मात्रा उपज) -1. इन nanocrystals काफी उज्ज्वल है और अधिक तुलनीय आकार है कि इस वर्णक्रमीय रेंज (जैसे CdTe, आई एन ए एस, InP) पर उत्सर्जन के साथ पहले से वर्णित nanocrystals से photostable हैं. सबसे fluorophores तरह, एकल अणु के स्तर पर इन कणों से प्रतिदीप्ति आंतरायिक है (पलक) 5,6.

कुछ अनुप्रयोगों के लिए, यह कुछ बड़ा nanocrystals का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. एक बड़ा सीडीएसई nanocrystal कोर, प्रतिदीप्ति bandwi का उपयोग करकेडीटीएच पारा कटियन विनिमय के बाद संकरा है. ठेठ पारा एक्स सीडी 1 x 600-650 एनएम विंडो में उत्सर्जन के साथ से nanocrystals के लिए प्रतिदीप्ति शिखर चौड़ाई 2.3 एनएम कोर के लिए 50-70 एनएम और 3.2 एनएम कोर के लिए 40-50 एनएम हैं. इस प्रकार, बड़े nanocrystals वर्णक्रमीय बहुसंकेतन के लिए अधिक से अधिक क्षमता सक्षम. इसके अलावा, आकार में वृद्धि इसी तरह अवशोषण nanocrystals के पार अनुभाग में वृद्धि होगी. सीडीएस अंतरिम खोल परत की मोटाई बढ़ाने से भी चमक बढ़ाने के लिए होगा, और आगे उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति स्थिरता लम्बा. सीडीएसई मूल आकार सीडीएसई कोर संश्लेषण की अवधि का विस्तार, और यूवी विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से प्रभावी आकार की निगरानी के द्वारा आसानी से बढ़ सकता है.

हमने पाया है कि जलीय कार्बोक्जिलिक एसिड के साथ लेपित QDs nonspecific सोखना कोशिकाओं और प्रोटीन के लिए प्रवण हैं, और उनके शारीरिक buffers में मजबूत नकारात्मक चार्ज के निराकरण करोड़ हैnonspecific बातचीत का कम से कम 17 के लिए itical. यहाँ उदाहरण में, हम लघु श्रृंखला खूंटी का इस्तेमाल करने के लिए सतह के प्रभारी को बेअसर करने के लिए और पानी में स्थिरता बनाए रखने के. खूंटी या तो पहले QDs में लगाव या कोटिंग के बाद बहुलक रीढ़ की हड्डी में पेश किया जा सकता है. दोनों लगभग तटस्थ कणों में परिणाम प्रक्रियाओं, लेकिन carboxyl बहुलक के साथ उन 1 लेपित काफी छोटे होते हैं, संभवतः सतह के साथ सुधार multidentate बातचीत के कारण. खूंटी के साथ पूरी सतह निराकरण के लिए, हमने पाया है कि कार्बोक्जिलिक एसिड को सक्रिय कर एजेंटों के दोहराया अलावा कारण प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से कम आधा जीवन के लिए आवश्यक है. हम भंडारण में DMTMM की स्थिरता में सुधार और 18 पानी में प्रतिक्रिया, दक्षता में सुधार के कारण की वजह से अधिक आम carbodiimide अभिकर्मकों (EDC) जैसे जगह में DMTMM का उपयोग करें.

अंत में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि क्वांटम डॉट्स और nanocrystals के कई अन्य प्रकार के होते हैंसाइटोटोक्सिक तत्वों 5. कैडमियम और पारा आयनों जीवित कोशिकाओं और जीवों की सामान्य प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं और 19-21 कैंसर हो सकता है. हालांकि पारंपरिक सीडीएसई / ZnS nanocrystals cytotoxicity व्यापक रूप से किया गया अध्ययन किया गया है और यह बताया गया है कि स्थिर जैविक ligands के साथ मजबूती के साथ लेपित nanocrystals अपने घटक तत्वों की तुलना में खुलकर साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना नहीं है, सिर्फ इसलिए कि उनके विषाक्त तत्वों को कुशलतापूर्वक ऑक्सीकरण एजेंट से दूर तनहा 5. इसके अलावा, एकल अणु इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, विषाक्त प्रभाव की संभावना नहीं अत्यंत छोटे इमेजिंग (आमतौर पर 1 या कम एनएम) जो detectable विषाक्त प्रभाव (50-100 एनएम) की शुरुआत की तुलना में छोटे परिमाण के आदेश हैं के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता के कारण हैं. एकल अणु तारीख QDs लागू करने प्रयोगों के अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडीएसई ZnS / nanocrystals, जो काफी हद तक यहाँ बताया उन लोगों की तुलना में बड़े होते हैं का उपयोग किया है. N कम करकेanocrystal आकार, कण और कण प्रति विषाक्त परमाणुओं की कुल संख्या के अनुसार सतह परमाणुओं की कुल संख्या काफी कम कर रहे हैं जिससे विषाक्तता प्रभाव के लिए कुल क्षमता को कम करने. nanocrystal में पारा का समावेश करने के लिए आगे विषाक्तता क्षमता को कम करने के लिए, के रूप में द्विसंयोजक पारा कम कई सेल प्रकार 19-21 में द्विसंयोजक कैडमियम से विषाक्त हो जाता है की उम्मीद है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों के Emory विश्वविद्यालय के एकीकृत माइक्रोस्कोपी कोर में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए डा. हाँग यी धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम NIH अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया था (PN2EY018244, CA108468 R01, U54CA119338, और-01 1K99CA154006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Selenium Sigma-Aldrich 229865
Tri-n-octylphosphine Strem 15-6655 97% pure, unstable in air
Cadmium oxide Sigma-Aldrich 202894 Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid PCI Synthesis 4671-75-4
Octadecene Alfa Aesar L11004 Technical grade
Hexadecylamine Sigma-Aldrich H7408
Diphenylphosphine Sigma-Aldrich 252964 Pyrophoric
Mercury acetate Sigma-Aldrich 456012 Highly toxic: use caution
1-Octanethiol Sigma-Aldrich 471836 Strong odor
Oleic acid Sigma-Aldrich W281506
Zinc acetate Alfa Aesar 35792
Cadmium acetate hydrate Sigma-Aldrich 229490 Highly toxic: use caution
Oleylamine Fisher Scientific AC12954 Unstable in air
Sulfur Sigma-Aldrich 344621
Trioctylphosphine oxide Strem 15-6661 99%
Pyridine VWR EM-PX2012-6 Anhydrous
Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753 Strong odor
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 Anhydrous
Dialysis tubing Spectrum Labs 131342 20 kDa cutoff
Centrifugal filter Millipore UFC801024 10 kDa cutoff
Monoamino-PEG Rapp Polymere 12 750-2 750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate Alfa Aesar H26333
AKTAprime Plus Chromatography System GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column GE HealthCare 17-5172-01
Agarose, OmniPur VWR EM-2120

Appendix

Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum.

Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon.

Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:

Equation 1

Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:

Equation 2

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References

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