Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Published 12/17/2012
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Biology

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Summary

Una técnica llamada

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Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays . J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).

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Abstract

Paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos, que desempeñan un papel importante en la fisiología y el desarrollo de las plantas y proporcionar las materias primas para las sociedades humanas (por ejemplo, industrias de la madera, papel, textiles y de biocombustibles) 1,2. Sin embargo, la comprensión de la biosíntesis y función de estos componentes sigue siendo un reto.

Glucanos de la pared celular son químicamente y conformacionalmente diversa debido a la complejidad de sus bloques de construcción, los residuos de glicosilo. Estos forman uniones en las posiciones múltiples y difieren en estructura de anillo, configuración isomérica o anomérico, y además, están sustituidos con una matriz de no azúcar residuos. Glycan composición varía en células diferentes y / o tipos de tejidos o incluso sub-dominios de una sola célula de la pared 3. Además, su composición también se modifica durante el desarrollo 1, o en respuesta a señales ambientales 4.

En exproceso de 2.000 genes tienen paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos ha previsto que participen en la biosíntesis de la pared celular y la modificación de glicanos en Arabidopsis 5. Sin embargo, relativamente pocos de los genes biosintéticos se han caracterizado funcionalmente 4,5. Ida y enfoques de genética son difíciles debido a que los genes son a menudo expresados ​​diferencialmente, a menudo a niveles bajos, entre los tipos de células 6. Además, los estudios mutantes son a menudo obstaculizado por la redundancia de genes o mecanismos compensatorios para asegurar el funcionamiento adecuado de la pared celular se mantiene 7. Así, nuevos enfoques son necesarios para caracterizar rápidamente la diversa gama de estructuras de glucanos y para facilitar enfoques de la genómica funcional para la biosíntesis de la pared celular y la comprensión modificación.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) 8,9 han surgido como una herramienta importante para determinar la estructura de glicano y distribución en las plantas. En ellos se reconoce distINCT presentes dentro de las principales categorías de glicanos la pared celular vegetal, incluidas las pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos y arabinogalactanos epítopos. Recientemente su uso se ha extendido a los experimentos de cribado a gran escala para determinar la abundancia relativa de los glicanos en una amplia gama de plantas y tipos de tejidos simultáneamente 9,10,11.

Aquí presentamos un método basado en micromatrices glicano exploración llamada integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP) (Figuras 1 y 2) 10,11 que permite múltiples muestras (100 segundos) para ser seleccionados utilizando una plataforma de microarrays miniaturizado con reactivo reducida y volúmenes de muestra. Las señales de punto del microarray puede ser formalmente cuantificados para dar semi-cuantitativos de los datos sobre la ocurrencia glycan epítopos. Este método es muy adecuado para el seguimiento de los cambios en glicanos complejos sistemas biológicos 12 y que proporciona una visión global de la composición de la pared celular en particular cuando el conocimiento previo of este no estará disponible.

Protocol

1. Colección de tejidos y preparación

  1. Recoger 100 mg de peso fresco de los tejidos vegetales (un mínimo de 10 mg de peso seco) al menos por triplicado para cada tejido de interés. Los pasos siguientes describen la preparación de material de la pared celular de los tejidos vegetativos. En el caso de los tejidos de almacenamiento, no deseado almidón es enzimáticamente eliminado antes de proceder con la extracción de los polímeros de la pared celular como se ha descrito previamente 13.
  2. Homogeneizar las muestras a un polvo fino con nitrógeno líquido utilizando un Qiagen TissueLyser II, con 24 conjuntos de adaptador y el tubo 3 mm de tungsteno granos de carburo (30 Hz, 2 x 30 seg). Alternativamente, si solamente unas pocas muestras se procesan, un mortero y mano de mortero se utiliza.
  3. Transfiera los homogeneizados en 10 ml tubos cónicos de plástico.
  4. Preparar el material de la pared celular mediante el lavado de los homogeneizados en 10 ml de 80% v / v de etanol a temperatura ambiente y agitando vigorosamente durante 2 min.
  5. Centrifugar las muestras a 3.500 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el etanol al 70% se lava al menos tres veces o hasta que el sobrenadante es claro, en particular para los tejidos que contienen clorofila.
  6. Realizar un lavado final con 100% de acetona y dejar los gránulos que contienen residuos insolubles en alcohol (AIR) para secar al aire durante la noche.
  7. Tamiz las muestras de aire con un 0,4 mm de malla de 2 para conseguir un polvo fino y homogéneo y para eliminar más grande, mal partículas de tierra que en algún momento permanecen en el homogeneizado.
  8. Pesar 10 mg de muestra de aire en microtubos, conteniendo cada una 3 mm de perlas de vidrio para ayudar al mezclado de las muestras.

2. Extracción de los glicanos de la pared celular

  1. Pectinas, y polímeros asociados con pectinas se extraen de las muestras mediante la adición de 500 l de CDTA mu M 50 (pH 7,5) a cada muestra.
  2. Agitar brevemente los tubos para asegurar el disolvente está en contacto con el material de la muestra y, a continuación mezclar mediante el TissueLyser durante 3 horas a 8 Hz.
  3. Centrifugar las muestras a 12.000 xg, cuidadosamente reMove los sobrenadantes y se almacena a 4 ° C.
  4. Lavar gránulos en 1 ml de agua desionizada para diluir y eliminar cualquier disolvente restante vórtice, y se centrifuga a 13.000 x g. Repita este paso sin perturbar el precipitado y retirar todo el líquido de los tubos antes de proceder al siguiente paso.
  5. De reticulación glicanos son secuencialmente extraída de la pared celular restante pellet con 500 l de NaOH 4 M con 0,1% w / v NaBH4, usando el mismo procedimiento descrito en los pasos 2,1 a 2,4 para la extracción CDTA. NaBH 4 se añade para reducir el aldehído (o ceto) en el extremo reductor de los polisacáridos a un alcohol evitando de este modo la base de polisacáridos descamación.
  6. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se retira de nuevo, se almacenaron a 4 ° C, y los sedimentos se lavaron dos veces en agua desionizada antes de proceder a la extracción siguiente.
  7. Como una etapa opcional, los polímeros residuales, tales como la celulosa se extrajo con 500 cadoxen mu l (31% v / v 1,2-diaminanoethane con 0,78 M CdO) usando el mismo procedimiento como se describe en los pasos desde 2,1 hasta 2,4. Alternativamente, el contenido absoluto de celulosa en gránulos restantes se puede determinar usando ensayos acético / nítrico (véase la discusión).

3. Microarrays de impresión

  1. Sobrenadantes de centrífuga que contiene extrajo polímeros de la pared celular a 13.000 xg para eliminar cualquier materia en partículas.
  2. Cargar 50 l de cada muestra en un polipropileno de 384 pocillos placa de microtitulación usando un diseño personalizado prediseñada en donde las muestras se disponen de acuerdo con el tipo de tejido y del tipo de extracción.
  3. Diluir la muestra de polímero de la pared celular en una serie 0, 5 y 25 × dilución en serie con agua desionizada.
  4. Los parámetros tales como la altura pin, recogida y tiempo de permanencia, y los pasos de lavado se encuentra en el software que controla la microarrayer.
  5. La humedad de la cámara de impresión se controla a 60% para evitar la evaporación de la muestra.
  6. El trabajo de impresión se inicia mediante LabNEXT software y un programa que corresponde a la disposición de microarrays.
  7. El robot utiliza los pins de canal capilar para imprimir soluciones de la placa de muestra en 20 x 20 cm de membrana de nitrocelulosa que se une a una placa plana en la máquina. Cada punto de la matriz contiene 15 nl de solución y se imprime por triplicado.
  8. Microarrays idénticos se imprimen uno al lado del otro en la membrana y se cortó en matrices individuales después de que el trabajo de impresión.
  9. En cada experimento las matrices pueden ser modificados con el fin de acomodar muestras más o menos, diluciones o replicados.

4. Sondeo de Microarrays glicano

  1. Después de la impresión, bloquear los microarrays individuales en 5% w / v de leche en polvo desnatada disuelta en solución salina tamponada con fosfato (MPBS) a temperatura ambiente durante 2 horas para reducir la unión no específica.
  2. Microarrays de sondas con anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de la pared celular glicano durante 2 horas en MPBS al. La mayoría de antib monoclonalodies contra glucanos de la pared celular están disponibles comercialmente en tres compañías; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Servicios Carbosource ( www.carbosource.net ) y PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. Incluir un control negativo, un microarray incubaron con MPBS al solamente y sin anticuerpo primario.
  4. Lavar los microarrays de 3 veces en tampón fosfato salino (PBS) durante 5 minutos para eliminar la unión no específica.
  5. Controle los microarrays con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en MPBS al durante 2 horas. Más anticuerpos monoclonales contra glucanos de la pared celular requiere anti-ratón o anti-rata anticuerpos secundarios.
  6. Repetir las etapas de lavado 3 veces con tampón PBS durante 5 minutos para eliminar la unión no específica.
  7. Desarrollar los microarrays utilizando cromógeno (3,3-diaminobencidina) o chemiluminecent (luminol) sustratos.

5. Cuantificación

  1. Después del revelado, escanear los microarrays individuales utilizando una alta resolución (1.200 dpi) Escáner de sobremesa y guardar las imágenes como negativas, de 16-bit TIFF (Figura 3).
  2. Calcular la intensidad integral de cada mancha usando Xplore Software de procesamiento de imágenes (LabNEXT) equipado con una herramienta de cuadrícula automatizado. La intensidad de la mancha integral se deriva de la suma de los píxeles en el área de rejilla que rodean a cada punto.
  3. Los datos de la cuadrícula para cada microarray se exporta como un archivo de texto y se puede importarse manualmente en una hoja de cálculo Excel para su análisis. Una herramienta en línea ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) ha sido desarrollado para traducir automáticamente y procesar los datos de cada archivo de txt.
  4. La intensidad de la mancha integral se promedia a través de la impresión repeticiones y diluciones para obtener un lugar "justo mediointensidad "valor para cada muestra (Figura 2). Alternativamente, las señales de mancha correspondiente al valor de dilución sólo uno en la matriz se utilizan para cuantificar la abundancia relativa de glicano epítopo para cada muestra.
  5. Las intensidades relativas medias al contado entre las diferentes muestras se presentan como un mapa de calor (Figura 4) utilizando el formato condicional en Excel o HeatMapper herramientas en línea ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Los datos para cada tipo de anticuerpo se corrige a 100 y un valor de corte de 5% se impone para eliminar la señal de fondo y los falsos positivos.

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Representative Results

La abundancia relativa de los glicanos en seis tipos de tejido (filamentos de anteras, polen, ovarios, pétalos, sépalos y el estigma) de Nicotiana alata flores se determinó usando CoMPP. La Figura 3A muestra un microarray representante que se ha sondeado con mAb específico para JIM5 parcialmente (bajo) methylesterified homogalacturonan (HG), un epítopo que se produce en polisacáridos pécticos 14. El epítopo JIM5 se detecta en extractos CDTA de todos los tejidos de las flores sin embargo es más alta en el polen y la más baja en el tejido estigmático (Figura 3A y 4A). Curiosamente, el epítopo JIM5 también se detectó en los extractos de NaOH en polen, pero no en otros tejidos (Figura 3A).

La información cuantitativa acerca de la ocurrencia de un glicano de interés se obtiene mediante la inclusión de una serie de polisacáridos purificados como patrones internos en la micromatriz (Figura 3B). Intensidad lugar Integral de extractos de diferentes t cuestiones sondeadas con mAb JIM5 se corresponde con las señales in situ derivados de una serie de dilución de homogalacturonan (25% de grado de esterificación de metilo, DE). En el tejido de ovario, aproximadamente 157 g de homogalacturonan que contiene el epítopo JIM5 estaba presente en cada muestra, que representa aproximadamente el 1,5% (en peso) de los residuos totales de la pared celular (Figura 3C). Considerando que 625 g homogalacturonan que contiene el epítopo JIM5 estaba presente en el tejido de polen, que representa aproximadamente el 6,25% (en peso) de los residuos totales de la pared celular.

La abundancia relativa de 15 epítopes de glicano se resumen como un mapa de calor en la Figura 4, donde la intensidad de barras de color es proporcional a la intensidad de punto media ajustada para cada muestra. Una representación gráfica de estos datos se ilustra también en la Figura 5 y nos permite interpretar rápidamente las diferencias en glicano ocurrencia epítopo entre los diferentes tejidos de las flores.

ONTENIDO "> Nuestros resultados indican que individuales epítopes de glicano están singularmente distribuido entre N. alata tejidos de las flores. Por ejemplo, el epítopo LM13 (linealizado (1-5)-α-L-arabinano 15) es más abundante en los filamentos de las anteras y los tejidos sépalo en comparación con otros tejidos (Figura 5D). Este patrón es en contraste con la de cadena más corta (1-5)-α-L-arabinano preferentemente epítopos detectado por mAb LM6 (Figura 5E) 15. reticulación glicanos también tienen distinta patrones de ocurrencia en N. alata. flores el epítopo LM10 (poco sustituida (1-4)-β-D-xilano) es abundante en el tejido de estigma en comparación con otros tejidos, pero está ausente de tejido de ovario (Figura 5G). LM15 xiloglicano epítopos son más altas en pétalo y antera filamento en comparación con otros tejidos (Figura 5H), mientras que heteromannans son los más altos en los filamentos de las anteras (Figura 5J).


Figura 1. Diagrama de flujo simplificado que representa los cinco pasos clave de la integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP).

Figura 2
Figura 2. Una ilustración de los pasos clave de la integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP). (A) Los tejidos vegetales se recogen como tres repeticiones, se homogeneizaron y se lavó en EtOH al 70% y acetona para hacer que los residuos insolubles en alcohol (AIR). (B) glicanos de la pared celular se extrajo secuencialmente a partir de muestras de aire con 50 mM de CDTA y 4 M NaOH. (C) glicanos extraídos de la pared celular se imprimen en nitrocelulosa utilizando un robot de microarrays. Cada muestra se representa en tres concentraciones y como una serie de réplicas de impresión de cuatrotes. (D) Los arrays impresos se probaron individualmente con mAbs dirigidos a epítopos de células glicanos de pared. (E) Las señales de contado se cuantificaron utilizando microarrays de software de imagen, exportar como archivos txt como en relación los valores medios de intensidad al contado se calculan automáticamente mediante una herramienta de datos en línea de procesamiento.

Figura 3
Figura 3. Glycan perfiles de Nicotiana alata tejidos florales. (A) Un microarray representante probaron con anticuerpo monoclonal (mAb) específico para JIM5 homogalacturonan (parcialmente, methylesterification bajo) se indica como un negativo, 16-bit del archivo TIFF. (B) La cantidad de polisacárido que contiene un epítopo de glicano de interés se puede cuantificar mediante la impresión de una serie de estándares de polisacáridos. (C) Intensidad punto Integral de la muestra de interés sondeado por el mAbJIM5 se calcula y se corresponde con una curva estándar para estimar la cantidad (g) de polisacárido que contiene este epítopo en la muestra.

Figura 4
Figura 4. Glycan perfiles de Nicotiana alata tejidos de las flores representadas como un mapa de calor. La intensidad del color es proporcional a la relación valor medio identidad spot (barra de escala). La abundancia relativa de 15 epítopes de glicano detectadas por los anticuerpos monoclonales (listados en la parte superior), se analizó durante seis tipos de tejidos extraídos con CDTA y NaOH (a la izquierda). Los epítopes de glicano se dividen en tres grandes clases de polisacáridos; pectinas, reticulación glicanos y proteínas arabinogalactano (AGPS). me, metil-esterificación; DP, grado de polimerización; mAb, anticuerpos monoclonales; AGP, arabinogalactano-proteína.


Figura 5. Glycan perfiles de Nicotiana alata tejidos de las flores representarse gráficamente. AL representa la abundancia relativa de 12 epítopes de glicano detectados por los mAb en los tejidos florales diferentes. La intensidad de la barra de escala de color es proporcional a la relación valor medio identidad lugar obtuvieron a partir de extractos de CDTA o NaOH o la suma de ambos. me, metil-esterificación; DP, grado de polimerización; MAB, anticuerpos monoclonales;. AGP, arabinogalactano-proteína Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Discussion

CoMPP es un método rápido y sensible para perfilar la composición glicanos de cientos de plantas derivadas de las muestras en cuestión de días. Este método complementa las plataformas de glicano ya disponibles bacterianas o de mamíferos de matriz para cribado de alto rendimiento de las interacciones de hidratos de carbono con glicanos de proteínas de unión tales como lectinas, receptores, y anticuerpos 16. Con una gran diversidad de sondas disponibles para la detección de glucanos de la pared celular, es posible obtener información detallada acerca de epítopes de glicano que pertenecen a todas las clases principales de polisacáridos de la pared celular vegetal 8,9. Sin embargo, estos abarcan sólo una pequeña proporción de las estructuras de glicano que se han identificado 8,9, y en algunas circunstancias limitar la comprensibilidad de CoMPP. Sin embargo, esta capacidad se ha extendido recientemente mediante el uso de módulos de unión a carbohidratos (CBM) frente a 17 glicanos de plantas, y también contra los epítopos que se caracterizan por no-glicosil residues tales como compuestos fenólicos 18 y 19 restos de acetilo que modifican los residuos de glicosilo y desempeñan un papel importante en la función de glicano.

Aunque CoMPP determina los niveles relativos de los glicanos a través de un conjunto de muestras, es posible cuantificar los niveles de epítopos secuenciales en los extractos mediante la comparación de la señal de unión en muestras específicas para el de los estándares conocidos (Figura 3B y C). A pesar de las ventajas de la reducción de volúmenes de muestra en una plataforma de microarrays de base, la capacidad de cuantificar con precisión ocurrencia glicano puede ser obstaculizado por las diferencias en la morfología del terreno o de la saturación de la señal de punto. Estos problemas (así como falsos positivos) se evitan mediante la optimización de la cantidad de material de pared celular versos extractante volumen, antes del análisis, y que incluye una serie de repeticiones y las diluciones tal como se describe aquí y en mamíferos métodos de matriz de glicano 16. Además, las diferencias en la morfología del terreno (causada por la difusión de las muestrasa tasas diferentes desde el punto de contacto) se puede superar mediante el uso sin contacto de chorro de tinta 16 la tecnología de microarrays.

CoMPP se utiliza en combinación con los procedimientos establecidos para el aislamiento y la preparación de las paredes celulares 20. También puede ser usado en paralelo con los actuales métodos bioquímicos, enzimáticos y física para obtener más información sobre el contenido de glucano en muestras de interés. Por ejemplo en lugar de extraer polímeros celulósicos, ensayos acético / ácido nítrico 20 se puede usar para cuantificar el contenido de celulosa (mg) que queda después de la extracción secuencial de la pectina y de reticulación glicanos con CDTA y NaOH. El tratamiento con enzimas de microarrays de glicano 21 también puede revelar diferencias adicionales en glicano distribución epítopo entre muestras, o para confirmar la especificidad de las estructuras de epítopos detectados en el microarray. La determinación de la composición de glicanos por técnicas analíticas independientes, tales como los recientemente descritos

Demostramos que los glicanos se distribuyen en un órgano o tejido específico modo en N. alata flores. Esta información se puede dar una idea de la función biológica de glycan epítopos o glicano la síntesis o modificación de las enzimas presentes en estos tipos de células diferentes. CoMPP previamente ha proporcionado información sobre las alteraciones de la pared celular que se producen en relación con el tipo de planta 22 durante el desarrollo o en respuesta 23,24 a 10,25 mutación. En resumen, CoMPP es una herramienta valiosa para el. Estudio de la diversidad de papeles de glicanos y genes de glicano de síntesis y modificación de la pared celular vegetal

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

IEM gustaría reconocer el Consejo Danés de Investigación (FTP y FNU) para su financiación. ERL reconoce el apoyo de una subvención de ARC DP. AB reconoce el apoyo del Centro ARC de Excelencia en Plant Cell Paredes subvención.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Tungsten Carbide beads Qiagen 69997
Collection microtubes (1.2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml microfuge tubes can also be used
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 mm glass beads Sigma Aldrich Z143928
CDTA Sigma Aldrich 34588
Cadmium oxide Sigma Aldrich 202894
1,2-diamin–thane Sigma Aldrich 03550
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) GE-water process technologies EP2HY00010 different pore sized membranes are suitable for different pin types
Xact II microarrayer robot Labnext 001A the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached
Xtend RM microarray pins Labnext 0037-350 pins must be suitable for spotting on membranes
384 well microtiter plates (polypropylene) Greiner 781207
Anti-glycan monoclonal antibodies Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. Sigma A9037 the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc).
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293 the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermoscientific 34080 see above
Xplore Image Processing Software LabNext 008 many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots.
Plant polysaccharides Sigma/Megazyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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