Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Bioengineering
 

Summary

Zirkulierender Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten ohne zugleich Zellschäden isoliert. Isolierung von Tumorzellen wird unter Verwendung eines bimolekularen Oberfläche von E-Selektin neben Antikörpern gegen epitheliale Marker. Ein Nanoröhrchen-Beschichtung fördert gezielt Krebs Zelladhäsion was zu hohen Reinheiten Gefangennahme.

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Hughes, A. D., Mattison, J., Powderly, J. D., Greene, B. T., King, M. R. Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples. J. Vis. Exp. (64), e4248, doi:10.3791/4248 (2012).

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Abstract

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind Zellen, die aus einem Primärtumor durch das Kreislaufsystem zu verbreiten und das kann letztlich bilden sekundäre Tumoren an entfernten Stellen. CTC Zählung kann zur Progression der Erkrankung über die Korrelation zwischen CTC-Konzentration im Blut und der Schwere der Erkrankung ein Basis folgen werden. Als Bearbeitungswerkzeug, konnte CTC im Labor, um persönliche Therapien zu entwickeln studiert werden. Zu diesem Zweck ist die Isolierung zu CTC keine Zellschädigung und Kontamination durch andere Zelltypen, insbesondere Leukozyten zu bewirken, muss so weit wie möglich 2 vermieden werden. Viele der aktuellen Techniken, darunter die einzige FDA-zugelassene Gerät für CTC-Enumeration, zerstören CTC als Teil des Isolations-Prozess (für weitere Informationen vgl. Rz. 2). Mikrofluidische Vorrichtung, um lebensfähige CTC erfassen beschrieben, bestehend aus einer Oberfläche mit E-Selektin-Glykoprotein neben Antikörpern gegen epitheliale Marker 3 funktionalisiert. Um Geräte-Performance steigernfunktion sollten eine Nanopartikel-Beschichtung wurde von Halloysit-Nanoröhren, ein Aluminosilikat Nanopartikel aus Ton 4 geerntet angewandte bestehend. Die E-Selektin-Moleküle stellen ein Mittel, um sich schnell bewegende CTC, die durch das Gerät gepumpt werden und verleiht ein Vorteil gegenüber alternativen mikrofluidischen Bauteilen, bei längeren Bearbeitungszeiten sind notwendig, um Zielzellen mit genügend Zeit, um mit einer Oberfläche interagieren zu erfassen. Die Antikörper gegen epitheliale Ziele vorgegeben werden CTC-Spezifität zu dem Gerät, sowie eine leicht einstellbare Parameter, um eine Isolation zu stimmen. Schließlich ermöglicht die Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung deutlich verbesserte Isolation zu anderen Techniken, indem sich schnell bewegenden Zellen einzufangen, Bereitstellen vergrößerte Oberfläche für die Proteinadsorption und Abwehr von Leukozyten, 3,4 verglichen. Dieses Gerät ist durch eine einfache Technik unter Verwendung von Off-the-shelf Materialien hergestellt, und wurde erfolgreich eingesetzt, um Krebszellen aus dem Blut von metastasierendem erfassenKrebspatienten. Captured Zellen werden für bis zu 15 Tage in Kultur nach der Isolierung gehalten wird, und diese Proben bestehen typischerweise aus> 50% lebensfähig primären Krebszellen von jedem Patienten. Dieses Gerät wurde verwendet, um lebensfähig CTC sowohl aus verdünntem Vollblut und Buffy-Coat-Proben zu erfassen. Schließlich präsentieren wir eine Technik, mit der Funktionalität in einer klinischen Umgebung, um persönliche Krebstherapien zu entwickeln.

Protocol

Das folgende Protokoll ist für die Herstellung eines einzelnen Mikroröhre Vorrichtung.

1. Vorbereitung von Halloysit Nanotube-Lösung

  1. Sonifikat (10-13 W (rms)) 250 ul Halloysit-Nanoröhrchen-Lösung (6,6 Gew.% in Wasser) 30 sek. Coole Lösung mit kaltem Wasser und wiederholen Sie die Beschallung einmal. Wieder cool.
  2. Zeichnen Sie beschallten Lösung in eine Spritze, legen Sie eine Spritze 0,45 um-Filter und Filter-Lösung in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Lösung gelegentlich bis zur Homogenität aufrechtzuerhalten.

2. Beschichtung von Reaktionscup innere Oberfläche mit Halloysit-Nanoröhren

  1. Erhalten 50 cm langen Abschnitt der Micro-Renathane microtubing (300 mu m Innendurchmesser, 35,3 ul Innenvolumen). Schneiden Sie ein Ende des Mikroröhrchen bei einer Diagonale und stecken in einem kleinen IDEX Adapterstück. Führen Sie die Nadel von einem 3/10 cc 29G Spritze in das andere Ende des Mikroröhrchens.
  2. Um die Mikroröhrchen reinigen, legen Sie das offene Ende des Mikroröhrchen (das Endemit dem Adapter) in 70% Ethanol und Auslosung ~ 50 ul Ethanol in die Spritze zu füllen Mikroröhrchen.
  3. Spülen Sie das Ethanol aus dem Mikroröhrchen, indem ein großzügiges Volumen von destilliertem Wasser in die Spritze.
  4. Lösen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen, entleeren Sie die Spritze, und dann wieder an die Mikroröhrchen.
  5. Eine Lösung aus 0,02% w / v Poly-L-Lysin in Wasser. Zeichnen Sie 50 ul in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu sitzen.
  6. Zeichnen Sie 100 ul gefiltert Nanotube-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 3 min bei RT inkubieren.
  7. Zeichnen Sie 100 ul Wasser durch die Mikroröhrchen zum Ausspülen des Nanotube-Lösung. Erlauben beschichteten Mikroröhrchen zu sitzen, mit Wasser gefüllt, über Nacht bei RT.

3. Vorbereitung der Mikroröhrchen zur Zellisolierung

  1. Eine Lösung aus 10 ug / ml Protein G in 1X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 - 7,2). Zeichnen Sie 50 ul PBS durch Mikroröhrchen und zeichnen Sie dann 50 uldas Protein-G-Lösung und zu ermöglichen, für 1,5 h bei RT inkubiert.
  2. Bereiten Sie eine Lösung mit 5 ug / ml E-Selektin-IgG und 50 pg / ml Antikörper (anti-EpCAM für die meisten Krebs-Proben, anti-PSMA für Prostatakrebs-Proben) in PBS. Zeichnen Sie 50 ul der E-Selektin und Antikörper-Lösung in die Mikroröhrchen und lassen Sie sie für 2 h bei RT inkubieren.
  3. Unspezifische zelluläre Adhäsion wird mit 5% Milch-Protein blockiert. Eine Lösung aus 5% (w / v) Milchprotein in PBS. 50 ul Malen Milchprotein Lösung in die Mikroröhre und lassen für 1 Stunde bei RT inkubiert.
  4. Zeichnen Sie 50 ul PBS in das Rohr und lassen bei RT, bis Blut oder Buffy-Coat-Proben für die Verarbeitung bereit sind.
  5. 10 min vor der Verwendung des Mikroröhrchen für Isolation, ziehen 50 ul PBS, die mit Ca 2 + ("PBS +") gesättigt wurde, um die Selektin-Moleküle aktivieren.

4. Vorbereitung der Proben für Zell-Isolierung

  1. Zeichnen oder erhalten 10 ml Blut von Patienten in heparinisierteRohr.
  2. 10 ml Ficoll-Paque Lymphozytenisolation Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig Schicht 10 ml Vollblut auf Ficoll, um nicht zu mischen, das Blut und Ficoll.
  3. Zentrifugieren bei 2000 x g für 15 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung.
  4. Entfernen Sie die Buffy-Coat-Schicht und in neues Röhrchen.
  5. Wash Buffy-Coat mit PBS (Zentrifuge bei 230x g für 10 min, den Überstand verwerfen).
  6. Vorsichtig resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 10 min bei RT, um Erythrozyten zu lysieren.
  7. Fügen Sie 10 ml PBS, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 230x g für 10 min. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig in 3 bis 4 ml PBS +.

5. Zellisolierung

  1. Befestigen Sie ein Ende des funktionalisierten Mikroröhrchen auf eine 5 ml Spritze mit IDEX-Adapter.
  2. Legen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe.
  3. Tauchen des offenen Endes des funktionalisierten Mikroröhre in die Zelle suspension.
  4. Verarbeiten Sie die Zellsuspension durch die Mikroröhrchen bei 1 bis 4 ml / h.
  5. Übertragen des offenen Endes der Mikroröhrchen in ein Röhrchen mit PBS + und stellt 300 ul PBS + in die Spritze mit 0,016 ml / min, um ungebundene und lose gebundenen Zellen aus dem Mikroröhrchen entfernen.
  6. Platzieren Sie das offene Ende des Mikroröhrchens in ein sauberes Röhrchen. Trennen Sie die Spritze aus dem Mikroröhrchen und fügen Sie eine Spritze mit Accutase vorgefüllt. Vorsichtig genug perfundieren Accutase in die Mikroröhrchen zu füllen (~ 50 ul) und lassen Sie sie bei RT für 10 min inkubieren.
  7. Befestigen Sie eine Spritze mit 1 ml Wachstumsmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin Streptomycin) und perfuse in Mikroröhrchen vorgefüllt, Sammeln Abwässer in Gewebekultur behandelt Well-Platte.
  8. Kultur Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 unter Bedingungen befeuchtet.

6. Repräsentative Ergebnisse

Das Ziel dieser Technik ist, um lebensfähige Krebszellen aus dem Blut von Krebspatienten zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden, um Krebszellen in Kultur zu identifizieren; eine notwendige Überprüfung des Gerätes Erfolg. Wir haben uns entschieden, Zellen in Kultur mit Antikörper gegen epitheliale Einheiten, wie EpCAM (epithelialen zelluläre Adhäsionsmolekül) oder PSMA (Prostata-spezifisches Membran-Antigen) zu färben, zusätzlich zu DAPI, um intakte Zelle Kerne (Abb. 2 und 3) zu identifizieren. Die Anzahl der Krebszellen aufgenommen unter Verwendung dieser Technik ist notwendigerweise eine Funktion der Anzahl von CTC in der Ausgangsprobe und Patienten-Schwankung kann hoch sein. Bei der Verarbeitung von Patienten mit Krebs diagnostiziert Stadium IV getroffen, wir routinemäßig zu erfassen zwischen 100 und 500 Zellen pro Röhrchen Krebs von Blut, mit einer Reinheit> 50%. Unmittelbar nach der Isolierung, kann eine größere Anzahl von kontaminierenden Leukozyten vorhanden sein. Allerdings sind diese Zahlen werden nach Inkubation in Kulturmedium für bis zu 5 Tage abgereichert werden.

1

2
Abbildung 2. Repräsentative Daten von CTC Isolierung aus Blutproben aus einer Brustkrebs-Patienten und einem Patienten mit Lungenkrebs gezeichnet. Die Zahl der lebensfähigen Zellen als positiv identifiziert CTC auf EpCAM-Färbung bezogen wird durch die festen Stäbe und beziehen sich auf die linke Ordinate und der Prozentsatz der Zellen, die identifiziert wurden dargestellt, wie CTC der Gesamtzahl der gefangenen Zellen im Vergleich wird durch die offene Balken dargestellt und gemessen auf der rechten Ordinate. Die Ergebnisse werden nach fünf Tagen in Kultur.

Abbildung 3
Abbildung 3. Vertreter Aufnahmen von verschiedenen Spendern (A und B) von CTC in Kultur 5 Tage im Anschluss an isolatiauf von einem Krebspatienten Blutprobe. Die Zellen wurden bei EpCAM Fluoreszenz mit AlexaFluor 488 (grün) und 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt, um den Kern (blau) zu visualisieren.

Discussion

Es ist oft der Fall, dass die frühen Schritte in der Entdeckung neuer Krebstherapien nutzen Krebszelllinien, die fragwürdig Ähnlichkeit mit primären Krebszellen tragen, bleiben doch in Handhabung durch ihre einfache Handhabung im Labor. Forschung in die Entwicklung neuer Krebstherapien, würde beschleunigt, wenn primären humanen Krebszellen früh im Roman Forschung genutzt würden. CTC sind die am leichtesten zugängliche Art der Krebszelle, die aufgrund ihrer Präsenz im Blut und der Leichtigkeit einer Standard-Blutprobe. Darüber hinaus repräsentieren zirkulierende Tumorzellen ein notwendiger Schritt im Prozess der Metastasierung 5,6, so dass ihre Relevanz für die Krankheit und Dienstprogramm für die Ausrichtung neuer Medikamente ist klar. Isolierung von CTC von Blut in vitro ist aufgrund ihrer geringen Konzentrationen kompliziert: in der Größenordnung von einem pro Million Leukozyten oder eines Erythrozyten pro Milliarde 7. Die Mehrheit der aktuellen Methoden zum Nachweis von CTC im Blut, darunter die einzige FDA-zugelassene Technik Zelle Suchen (Veridex), beschädigen oder zerstören Zellen bei der Erkennung Prozess, unter Ausschluss der Verwertung außerhalb Enumeration. Das oben beschriebene Verfahren nicht beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zellen und damit öffnet die Tür für zukünftige klinische Forschung über Krebs. Da die Wiederherstellung von intakten Zellen ist das Ziel dieser Technik ist es unerlässlich, dass Zellen mit Vorsicht behandelt werden, vor allem während Blut Trennschritte.

Es gibt eine Reihe von einstellbaren Parametern in diesem System, verändert werden, um verbesserte Ausbeute in Abhängigkeit von kritischen Merkmalen wie Krebs-Typ erreicht werden könnte. In den oben beschriebenen Schritten, haben wir entschieden, EpCAM als CTC-spezifischen Antikörper für alle Krebsarten außer bei der Verarbeitung von Prostatakrebs-Proben verwendet werden, wobei anti-PSMA verwendet wurde. Weitere Substitutionen von Krebs-spezifische Antikörper kann sicher verwendet werden, um die Leistung für den einzelnen Patienten zu verbessern. Darüber hinaus können Selektin und Antikörper-Konzentrationen verändert werden, um Capture 8 zu verbessern.

"> Ein wesentliches Merkmal der Vorrichtung ist der Einbau von E-Selektin-Moleküle auf der Oberfläche. E-Selektin wird in der Regel auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen und Funktion von sich schnell bewegenden Leukozyten zu einer Entzündung rekrutiert ausgedrückt. Fließenden Leukozyten zu binden, um transient Selektin-Moleküle, was zu einem langsameren, Abrollverhalten, die langsamer und stärkeren Bindung der Zellen an das Endothel durch Integrine erleichtert. eindeutig nachweisen existiert, die den Fall, dass CTC kann durch einen ähnlichen Mechanismus 9,10 extravasieren. Die Einbeziehung von Selektin auch kann das Gerät bei größeren Flussraten betrieben werden, Preise erzielen, die sonst verhindern Zellen, die aus der Bindung an Antikörper 11 wäre. So ist unser Gerät ahmt ein physiologisch Venole zu erfassen biomimetisch fließenden CTC ohne zugleich zellulären Verletzungen.

Verbesserte Leistung der Vorrichtung kann die Zugabe des Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung auf der luminalen Oberfläche zurückzuführender Vorrichtung. Frühere Studien haben gezeigt, dass es drei Hauptkomponenten der Nanoröhrchen-Beschichtung, die für eine verbesserte Funktionalität ermöglicht. Erstens stellt die Nanoröhrchen-Beschichtung eine vergrößerte Oberfläche, was eine größere Proteinablagerung auf die Oberfläche 4. Zweitens wird bei der Durchführung Rasterkraftmikroskopie auf der Nanoröhrchen-Beschichtung haben wir festgestellt, dass die einzelnen Nanoröhren von der Oberfläche in die Strömung ragen. Dies ermöglicht Selektin-Moleküle bis zu einem Mikrometer über der Oberfläche präsentiert werden, so dass Zellen aufnehmen können und eingestellt, um die Oberfläche weiter oben in ihrer Flugbahn durch das Rohr 4. Schließlich ist der Halloysit Nanoröhrchen-Beschichtung in der Lage, die Adhäsion von Leukozyten zu verhindern und Verteilen auf der Oberfläche, so dass für eine reduzierte Anzahl von Leukozyten zusammen mit dem CTC erfasst und somit eine größere Reinheit nachfolgenden CTC 3.

Disclosures

MRK ist ein wissenschaftlicher Berater CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

Acknowledgments

Die beschriebenen Arbeiten wurde von der Cornell Center auf der Mikroumgebung und Metastasierung durch Verleihungsnummer U54CA143876 vom National Cancer Institute unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde zusätzlich teilweise durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
300 um ID tubing Braintree Scientific, Inc. MRE025
Larger tubing for connection to syringe IDEX Health Science 1507L
5mL syringe for pump BD Biosciences 309603
Connector small to large tubing IDEX Health Science P-770
Connector large tubing to syringe IDEX Health Science F-120 and P-659
Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') BD Biosciences 309301
Accutase MP Biomedicals LLC 1000449
Ficol-Paque Plus GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) Qiagen 1014614
Protein G, 5 mg CalBiochem (calbiochem.com) 539303
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D Systems MAB960
PSMA Antibody (GCP-04) Abcam ab66911
96 well plates (Microtest 96) BD Biosciences 35-3072
Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g Bio-Rad 216005508
Halloysite Nanotubes NaturalNano NN-HNT200
Calcium Carbonate, 5g Aldrich Chemistry 481807
rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug R&D Systems 724-ES
RPMI Medium 1640 GIBCO, by Life Technologies 22400-089
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-095
Poly-L lysine 0.1% w/v in water Sigma-Aldrich P8920-100ML
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 100
Fetal Bovine Serum Atlanta Biochemicals S11056H
Penicillin Streptomycin Sigma Life Siiences P0781

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References

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