ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

האינטראקציות של מלכודת (גורם oluble N-ethylmaleimide רגיש ceptor מחדש חלבון ttachment ים) חלבונים על שלפוחית ​​(V-מלכודות) ועל קרומי היעד (t-מלכודות) לזרז איחוי שלפוחית ​​תאית 1-4. מבחנים הם חיוניים לכינון מחדש לנתח את מנגנון הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך 5. בבדיקת איחוי תאי 6,7, חלבוני מלכודת מתבטאים ectopically בתא השטח. אלה "התהפכו" איחוי כונן מלכודת חלבוני תאי תאים, הוכחה כי מלכודות מספיקות לאיחוי קרום תא. בגלל assay איחוי התאים מתבסס על ניתוח מיקרוסקופי, הוא פחות יעיל כאשר משתמשים בו כדי לנתח מרובה v-ואינטראקציות t-Snare כמותית.

כאן אנו מתארים בדיקה חדשה 8 שמכמתת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז. שניםמרכיבים של מערכת ביטוי גני ט הכבויה 9 משמשים כמערכת readout: טטרציקלין המבוקר transactivator (tta) וכתב פלסמיד שמקודד גן LacZ תחת שליטה של אלמנט טטרציקלין-התגובה (TRE-LacZ). אנו transfect tta לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני v-Snare בתא השטח (V-תאים) וtransfect TRE-LacZ לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני t-Snare בתא השטח (T-תאים) . היתוך מלכודת תלויה של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ והביטוי של β-גלקטוזידאז. הפעילות של β-גלקטוזידאז היא לכמת בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר.

חלבוני קרום שלפוחית ​​הקשורים (VAMPs) הם V-מלכודות שנמצאות בתאים שונים לאחר Golgi שלפוחי 10-15. על ידי בעת 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באותה הרמה, אנו משווים איחויםפעילות באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. מבוסס על מדידת spectrometric, assay זה מציע גישה כמותית לניתוח איחוי מלכודת בתיווך ועל מחקרי תפוקה גבוהה.

Protocol

1. תא תרבות וTransfection

  1. COS-7 תאים בתרבית הבינונית של Dulbecco שינוי הנשר (DMEM) בתוספת 4.5 גר '/ הליטר וגלוקוז בסרום שור עוברי (10% FBS).
  2. transfection פלסמיד נעשה עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן (Invitrogen).

2. ניתוח מיקרוסקופי קרינה של ביטוי מלכודת תא שטח

  1. היום לפני transfection, 3 × 10 4 COS-7 תאי הזרע בcoverslips סטריליים 12-מ"מ הזכוכית (הפישר סיינטיפיק) הכלול בצלחות 24 כן.
  2. לV-תאים בכל אחד, 0.25 מיקרוגרם היטב של פלסמיד המקודד tta (pTet-Off, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם של פלסמיד שהתהפך VAMPs מפורש.
  3. לתאי ה-T בכל באר, 0.25 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם כל אחד מפלסמידים שהתהפכו מפורשים SNAP-25 וsyntaxins 1 או 4.
  4. 24 שעות לאחר transfection, תאים קבועים עם paraformaldehyde 4% ב PBS + + (PBS בתוספת 0.1 גר '/ ליטר CaCl 2 ו -0.1 ג'/ ליטר MgCl 2) למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסם ב10% FBS ב PBS + + למשך 30 דקות.
  5. התאים מודגרת עבור 1.5 שעות עם 9E10 נוגדנים אנטי-myc (supernatant תרבות היברידומה המסודר).
  6. אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, התאים מודגרת לשעה 1 עם נוגדני FITC-מצומדות משניים (מעבדות ג'קסון Immunoresearch) בדילול של 1:500.
  7. אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, תאי שהכותרת הם רכובים בהארכה מגיבה antifade זהב (Invitrogen).
  8. תמונות confocal נאספות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר אולימפוס. הדימויים מעובדים בתוכנת Photoshop Adobe.

3. ניתוח FACS של ביטוי מלכודת תא שטח

  1. היום לפני transfection, 2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן.
  2. 24 שעות לאחר transfection עם התהפך מלכודת, pTet-Off ופלסמידים PBI-G, תאים קבועים עם paraformaldehyde 1% בPBS + + במשך 15 דקות, ולאחר מכן חסמו ב10% FBS ב PBS + + במשך 15 דקות.
  3. התאים מודגרת עם 9E10 הנוגדנים אנטי-myc עבור 60 דקות.
  4. לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים מסומנים עם נוגדנים משניים FITC-מצומדות (1:200 דילול) עבור 45 דקות.
  5. לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים לגרד את הצלחות עם מגרד תא.
  6. 15,000 תאים מנותחים באמצעות cytometer זרימת FACSCalibur (BD Biosciences). עוצמת הקרינה הממוצעת של כל דגימה מתקבלת באמצעות תוכנת Pro CellQuest.

4. Assay איחוי תאים האנזימטית

  1. היום לפני transfection, 1.2 × 10 6 COS-7 התאים זרע בכל צלחת תרבית רקמה 100-מ"מ, ו2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן.
  2. עבור v-תאים, 0.5-5 ק"ג כל אחד מflippעורך נצלן פלסמיד הוא cotransfected עם 5 מיקרוגרם של-Off pTet לתוך התאים בכל מנת התרבות 100-מ"מ. תאי בקרה cotransfected עם pcDNA3.1 הריק וקטור (+) וpTet-Off. כדי למנוע את N-glycosylation של 1 VAMPs, 4, 5, 7 ו 8, tunicamycin (10 מיקרוגרם / מ"ל) כלול במדיום תרבות תא במהלך transfection.
  3. עבור T-תאים בכל באר של הצלחות 6-כן, מיקרוגרם 1 מתוך התהפך SNAP-25 פלסמיד וPBI-G הוא cotransfected עם 0.5 מיקרוגרם של התהפך מיקרוגרם syntaxin1 פלסמיד או 0.05 של התהפך syntaxin4 פלסמיד.
  4. 24 שעות לאחר transfection, V-תאים מנותקים ממנות התרבות עם תא דיסוציאציה מאגר אנזימים חינם (Invitrogen). תאים משפחתיים נספרים עם hemacytometer וresuspended בHEPES-נאגר DMEM בתוספת 10% FBS, 6.7 מיקרוגרם / המ"ל tunicamycin וDTT mM 0.67.
  5. 4.8 × 10 5 resuspended V-תאים נוספים לכל גם כבר מכיל את תאי ה-T.
  6. לאחר חולדת 6, 12 או 24 שעות 37 מעלות צלזיוס בCO 2 5%
  7. לאחר 90 דקות, תגובת colorimetric הוא נעצר על ידי הוספת סודיום קרבונט M 1.
  8. ספיגה ב420 ננומטר נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר 100-40 HITACHI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפתח assay איחוי תאי כמותיים, אנו מנצלים את הפעלת השעתוק החזקה על ידי הכריכה של tta לTRE. בהעדר tta, השעתוק של גן LacZ בTRE-LacZ שותק. כאשר tta קיים, הוא נקשר לTRE ומפעיל את השעתוק של LacZ. איור 1 מציג תרשים זרימה של assay איחוי התאים האנזימטית. tta הוא transfected לתוך V-תאים שחלבונים המפורש v-מוקש בתא השטח, וTRE-LacZ הם transfected לתוך תאי T שחלבונים מפורשים t-מוקש בתא השטח. היתוך של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ, והביטוי של β-גלקטוזידאז.

האיור 2 א ממחיש את מבנה התחום של מבני מלכודת התהפכו. רצף האות preprolactin הוא התמזג לN-Termini של מלכודות. מלכודות מהונדסות אלה נקראים 'התהפכו'מלכודות בגלל הנטייה של מוטיבי מלכודתם נגד קרום תא הוא התהפכה. כאשר COS-7 תאים transfected עם התהפכו מלכודת פלסמידים, התהפך חלבוני מלכודת לידי ביטוי בתא השטח (איור 2 ב '). cytometry הזרימה משמש למדידת רמות הביטוי של חלבוני מלכודת בתא השטח (האיורים 2C ו-D). על מנת להשוות יכולות היתוך הקרום שלהם, VAMPs צריך לבוא לידי ביטוי באותה הרמה. לכן, אנו טיטרציה ומותאמת הריכוז של כל התהפך מלכודת פלסמיד המשמש בtransfection. התהפכו בפלסמידים מלכודת הם transfected בריכוזים הבאים (לאזור 10 2 סנטימטרי צמיחה, כלומר, לכל גם בצלחות 6-כן): VAMP1, 0.2 מיקרוגרם; VAMP3, 0.5 מיקרוגרם; VAMP4, 0.5 מיקרוגרם; VAMP5, 0.05 מיקרוגרם; VAMP7, 1.0 מיקרוגרם; VAMP8, 0.1 מיקרוגרם; syntaxin1, 0.5 מיקרוגרם; syntaxin4, 0.05 מיקרוגרם. tta, TRE-LacZ והתהפך SNAP-25 היו cotransfected במיקרוגרם 1 לכל אזור גידול 10 סנטימטרים 2. תחת sucתנאי H, 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באים לידי ביטוי באותה הרמה, ואילו 1 ו 4 syntaxins באים לידי ביטוי באותה הרמה בתא השטח (איור 2 ד). כפי שמוצג על ידי ניתוח תמונת ניגוד confocal ושלב (2E איור), 80% מהתאים COS-7 הם transfected עם פלסמידים מלכודת התהפכו. ניתוח הדמית תיוג כפול (האיור 2F) עולה כי 70% מתאי ה-v transfected לבטא גם tta והתהפכו חלבונים נצלנים. כי גן LacZ בTRE-LacZ אינו מתבטא לפני איחוי תאים, אנחנו לא מסוגלים לקבוע את אחוז transfected תאי T שמבטא גם TRE-LacZ והתהפך חלבוני t-מלכודת.

הפחים העצביים (V-Snare VAMP2, ו-T-מלכודות syntaxin1 וSNAP-25) אשר מתווכים exocytosis סינפטי משמשים כדי לבדוק את הכדאיות של assay. ואכן, כאשר ה-V-התאים להביע VAMP2 ותאים T מבטא syntaxin1/SNAP-25 משולבים, חזק β-galacביטוי tosidase מזוהה (איור 3). עם זאת, כאשר האחד VAMP2 או SNAP-25 לא בא לידי ביטוי, רק פעילות בסיסית β-גלקטוזידאז מזוהית, המציין כי איחוי תאים ובביטוי של β-גלקטוזידאז להסתמך על אינטראקציות של V-וטריקו מלכודות. תוצאות אלו מצביעות על כך שבדיקת איחוי התאים האנזימטית מזהה זיווגי fusogenic בין v-ו-T-מלכודות ביעילות.

ידי ביטוי חלבונים נצלנים באותה הרמה בתא השטח (האיור 2D), אנו משווים פעילויות האיחוי שלהם. עם T-מלכודות syntaxin1/SNAP-25, 1 VAMPs, 3, 8 ויש להשוות ופעילויות ההיתוך הגבוהות ביותר, ואילו VAMPs 4 ו 7 יש 50% ופעילות 30% נמוכה היתוך, בהתאמה (איור 4). לעומת זאת, כאשר VAMP5 משתלב עם T-מלכודות, רק פעילות בסיסית β-גלקטוזידאז מזוהית (איור 4), מה שמרמז שVAMP5 לא לנהוג איחוי עם syntaxin1/SNAP-25.

איור 1
איור 1. Assay איחוי התאים אנזימתי. tta הוא cotransfected עם פלסמידים התהפכו v-מלכודת, וTRE-LacZ הוא cotransfected עם פלסמידים התהפכו t-מלכודת. ההיתוך של V-ו-T-תאים מוביל לעקידת tta לTRE והביטוי של β-גלקטוזידאז, הנמדד על ידי שיטת colorimetric.

איור 2
איור 2. ביטוי התהפך מלכודות בתא השטח. () מבנה התחום של התהפך מלכודות. רצף אות preprolactin (SS) הוא התמזג לN-Termini של מלכודות, ותג Myc מוכנס בין רצף האות והמוטיבים מפותלי המלכודת (סליל). (ב) COS-7 תאי cotransfected עם tta והווקטור הריק pcDNA3.1 (+) או התהפכו VAMP5 פלסמיד. 24שעות לאחר transfection, תאי unpermeabilized מגואלות בנוגדן חד שבטי אנטי-Myc. תמונות confocal-פרוסה אחת נציג מוצגות. (C ו-D) 24 שעות אחרי cotransfection עם tta וpcDNA3.1 (+) או התהפך VAMPs (V-תאים), או 24 שעות לאחר cotransfection עם TRE-LacZ, התהפכו SNAP-25 וsyntaxins 1 או 4 (תאי T ), תאי unpermeabilized מגואלות בנוגדן אנטי-Myc ונותחו על ידי cytometry זרימה. (ג) נציג FACS פרופילים של תאי transfected עם pcDNA3.1 (+) או התהפכו VAMP1 פלסמיד. עוצמת הקרינה הממוצעת של כל דגימה נקבעה באמצעות שימוש בתוכנת Pro CellQuest. (ד) כדי להביע VAMPs באותה הרמה ומפורשת syntaxins 1 ו 4 באותה הרמה בתא השטח, התהפך פלסמידים מלכודת הם transfected בריכוזים במנות קצובות. הראה הם את עוצמות קרינה הממוצעות של צביעת תא שטח של חלבוני המלכודת. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן של 4 ניסויים בלתי תלויים. (E ו-F) 24 שעות אחרי cotransfe ction עם tta והתהפך VAMP5 פלסמיד, תאי permeablized עם 0.2% Triton X-100 ב PBS + + ו (ה) מוכתם נוגדן אנטי-Myc, או (F) צבעוני כפול עם הנוגדן חד השבטי אנטי-Myc ונוגדן polyclonal ל ט המדכא (כדי לזהות tta). (ה) הראה הם תמונות לעומת שלב confocal ונציג. מספר תאי transfected שמתויגים על ידי הנוגדן אנטי-Myc (VAMP5) והמספר הכולל של תאים בערוץ ניגוד השלב נספרים (n = 60 תאים), ויעילות transfection מחושבת (80%). (ו) מספר תאי transfected שמבטאים גם VAMP5 וtta, והמספר הכולל של תאים שtransfected מפורשת VAMP5, tta או שניהם נספרים (n = 75 תאי transfected). האחוז של תאי transfected שמבטאים גם VAMP5 וtta יחושב אז (70%). ברי משקל 20 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

"Fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 3
איור 3. איחוי תאים תלויים באינטראקציות של v-ו-T-מלכודות. V-תאים שמבטאים tta וVAMP2 מודגרת עם תאי T שמביע TRE-LacZ, syntaxin1 וSNAP-25. לאחר 24 שעות, תאי lysed והפעילות של β-גלקטוזידאז בlysates הסלולרי נקבעה באמצעות שימוש בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר. פעילות בסיס בלבד ב-גלקטוזידאז הוא זוהה כאשר אחד התהפך VAMP2 או SNAP-25 פלסמיד מושמט מtransfection.

איור 4
איור 4. השוואה של פעילות מיזוג של VAMPs. בתנאים אופטימליים, transfection 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באים לידי ביטוי באותה הרמה בתא השטח של V-תאים. 24 שעות לאחר שילוב ה-V-תאים עם תאי T שאקסעיתונות syntaxin1/SNAP-25, איחוי תאים הוא לכמת באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן של 4 ניסויים בלתי תלויים. ** P <0.01; *** P <0.001 לעומת VAMP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay איחוי התאים המקורי 6 קובע אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו מתארים assay חדשני המכמת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז ומדידת spectrometric. שימוש assay זה, אנו שגרתי לנתח 15-20-V ו-T-Snare שילובים יחיד בניסוי. באמצעות cytometry זרימה למדוד ביטוי מלכודת בתא השטח, אנו כיל את רמות הביטוי של VAMPs ולהשוות יכולות האיחוי שלהם (איורים 2, 4). יתר על כן, באמצעות איחוי התאים assay אנזימטי, קבע את התלות של פעילות איחוי תאים על צפיפות תא שטח של VAMP1 חלבון, ולא הבחנתי בשום cooperativity של VAMP1 חלבון בתגובת היתוך תא 8, שמראים כי פעולה מתואמת של קומפלקסי מלכודת מרובים אינה נדרשת לאיחוי קרום תא.

ישנן מוטה משוער N-glycosylationFS (Asn-X-Ser/Thr) בחלבוני מלכודת. בגלל N-glycosylation מעכבת את פעילות חלבוני ההיתוך של התהפכה מלכודת 6, שתי גישות היו בשימוש כדי למנוע glycosylation של חלבוני מלכודת התהפכו. ראשית, מוטציות glycosylation אתר מוכנסים התהפך מלכודת בונה 6. שנית, כפי שתואר בפרוטוקול הנוכחי, tunicamycin מעכב N-glycosylation (6.7 מיקרוגרם / מ"ל) כלול בתגובת איחוי התאים. בנוסף, DTT 0.67 המ"מ הוסיף בתגובת איחוי תאים על מנת למנוע היווצרות קשרי דיסולפיד בין חלבוני מלכודת דפוקה, שמעכבת את פעילות היתוך מלכודת. הניסויים שלנו מראים כי תוספת של 6.7 מיקרוגרם / המ"ל tunicamycin וDTT 0.67 מ"מ במדיום תרבות תא אינה פוגעת בהתרבות וההישרדות של תאי COS-7. אנחנו באופן שגרתי לסיים את תגובת ההיתוך בתא 24 שעות לאחר שילוב v-ו-T-תאים. עם זאת, איחוי תאים משמעותי מלכודת בתיווך הוא זוהה 6 שעות לאחר שילוב v-nd t-תאי 8. בגלל תגובת היתוך התא האנזימטית תלויה בביטוי של β-גלקטוזידאז לאחר איחוי תאים, כמובן הזמן של מערכת readout זה מפגר כמובן זמן האיחוי מתווך על ידי חלבוני מלכודת התהפכו.

Assay איחוי התאים האנזימטית מציע בדיקה כמותית כינון מחדש לבחינת פעילות האיחוי של אינטראקציות v-ו-T-מוקש פוטנציאליים בתאי יונקים. על ידי חלבוני coexpressing רגולציה (למשל, Munc18) ומלכודות שנמצאות על פני התא או על ידי הכללת רקומביננטי חלבונים רגולטוריים בתגובת היתוך התא, assay זה יכול לשמש כדי להבהיר את מנגנוני הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך. בנוסף, בדיקה זו צריכה להיות יישומים בתפוקה גבוהה הקרנה למעכבים או activators של איחוי מלכודת בתיווך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי קרני הפעלה מהאוניברסיטה לואיוויל וCA135123 מהמכונים הלאומיים לבריאות (לCH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics