Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alle organismen bewonen een wereld vol van zintuiglijke prikkels die hun gedrags-en fysiologische reactie op hun omgeving te bepalen. Reukzin is vooral belangrijk in insecten, die hun olfactorische systemen te reageren op en onder complexe geur stimuli. Deze geuren roepen gedragingen die bemiddelen processen, zoals reproductie en habitat selectie 1-3. Bovendien, chemische detectie door insecten bemiddelt gedragingen die zeer belangrijk zijn voor de landbouw en de menselijke gezondheid, met inbegrip van bestuiving 4-6, herbivorie van voedingsgewassen 7 en overdracht van ziektes 8,9. Identificatie van olfactorische signalen en hun rol in insecten gedrag is dus belangrijk voor het begrijpen van zowel ecologische processen en menselijke voedselbronnen en welzijn.

Tot op heden heeft de identificatie van vluchtige stoffen die insecten gedrag sturen is moeilijk en vaak vervelend. Huidige technieken omvattengaschromatografie gekoppelde electroantennogram opname (GC-EAG), en gaschromatografie gekoppelde enkele sensillen opnamen (GC-SSR) 10-12. Deze technieken bleken vitaal belang in de identificatie van bioactieve verbindingen. We hebben een methode ontwikkeld die gaschromatografie gekoppeld aan multi-channel elektrofysiologische opnamen (aangeduid als 'GCMR') van neuronen in de antennaal kwab (AL; van het insect primaire olfactorische centrum) maakt gebruik van 13,14. Deze state-of-the-art techniek stelt ons in staat om door te dringen hoe geur informatie is vertegenwoordigd in het insect hersenen. Bovendien, omdat neurale respons op geuren op dit niveau van verwerking geur zeer gevoelig vanwege de mate van convergentie van de antenne receptor neuronen in AL neuronen zal AL opnamen de detectie van actieve bestanddelen van natuurlijke geuren efficiënt en met hoge gevoeligheid. Hier beschrijven we GCMR en een voorbeeld geven van het gebruik ervan.

Een aantal algemene stappen zijn INVOLmj in de detectie van bioactieve vluchtige en insecten reactie. Vluchtige stoffen moeten eerst worden verzameld uit bronnen van belang (in dit voorbeeld gebruiken we bloemen uit het geslacht Mimulus (Phyrmaceae)) en gekarakteriseerd als dat nodig is met behulp van standaard GC-MS technieken 14-16. Insecten worden bereid voor onderzoek met minimale dissectie, waarna een registratie-elektrode wordt in de antennelid kwab en meerkanaals neurale opname begint. Post-verwerking van de neurale gegevens blijkt dan welke specifieke geurstoffen belangrijke neurale reacties veroorzaken door het zenuwstelsel van een insect.

Hoewel het voorbeeld we hier specifiek is voor bestuiving studies kunnen GCMR worden uitgebreid met een groot aantal studie organismen en vluchtige bronnen. Zo kan deze methode worden gebruikt bij de identificatie van geurstoffen aantrekken of afstoten vector insecten en plagen. Bovendien kan GCMR ook worden gebruikt om lokstof identificeren voor nuttige insecten zoals pollinators. De techniek kan worden uitgebreid naar niet-insect vakken.

Protocol

1. Vluchtige Follection

  1. In dit voorbeeld worden vluchtige monsters van M. lewisii bloemen - een alpine wilde bloemen afkomstig uit Californië. Vluchtige stoffen worden verzameld via dynamische sorptie werkwijzen volgens Riffell et al.. 14. Kortom, deze werkwijze gebruikt een gesloten lus opvangsysteem waar bloemen bevinden zich in een Teflon zak. Met een inert vacuümpomp wordt de lucht rond de bloemen opgezogen door een "trap" uit een Pasteur pipet vol Porapak Q matrix. De retourlucht uit de pomp wordt gefilterd door geactiveerde kool. Na een bepaalde tijdsperiode, in ons geval 24 h wordt de Porapak Q matrix geëlueerd met een niet-polair oplosmiddel, typisch hexaan, het geconcentreerde extract verzamelen. Het extract wordt dan opgeslagen in -80 ° C tot analyse. Indien nodig kunnen de monsters vóór de analyse worden geconcentreerd onder een stroom stikstofgas. Tenzij het monster is al goed gekarakteriseerd, voert u een portie van het door eengaschromatograaf-massaspectrometer (GC-MS) voorafgaande identificeren vluchtige componenten met het monster.

2. Elektrofysiologische Voorbereiding

  1. Snij ongeveer 1 cm vanaf het einde van een 1.000 ul pipetpunt. Plaats een hommel (Bombus impatiens) in de basis van de pipetpunt en duw in de richting van het andere uiteinde van de tip tot alleen het hoofd wordt blootgesteld.
  2. Smelt tandtechnische waspreparaten en schimmel het rond de blootgestelde hoofd, zorg ervoor dat de wax hecht op het samengestelde ogen voor de veiligheid en om de bij het hoofd volledig immobiel is. Zorg ervoor dat er geen wax te krijgen op de antenne van de honingbij.
  3. Zodra het hoofd is veilig, een vierkant maken, raam-achtige, insnijding in het hoofd capsule met behulp van een scheermesje-breaker of de juiste maat scalpel om de cuticula te snijden. Met de blade-breaker, beginnen de dorsale zijde van het hoofd capsule, direct achter de antenne en grenzend aan een van de samengestelde ogen. Snijdeneen rechte lijn, van een verbinding met de contralaterale oog samengestelde oog. Na het snijden van een rechte lijn naar de andere samengestelde oog, het maken van een incisie dorsaal beginnen voordat het hoofd capsule bochten en eindigt nabij de thorax. Op dit punt begint te snijden naar de andere kant van de kop capsule. Ten slotte, wanneer een lijn is teruggebracht tot de andere kant, bezuinigen een lijn naar de uitgangspositie van de eerste incisie. Het is belangrijk verwijderen cuticula dat grenst aan de antenne, aangezien dit belemmert het inbrengen van de elektrode.
  4. Zodra de cuticula wordt gesneden, gebruik een pincet om de bij cuticula, die dan zou moeten blootstellen van de bij hersenen en, nog belangrijker, de antennaal lobben te verwijderen. Onmiddellijk beginnen superfusing de hersenen met insect zoutoplossing, zodat de hersenen niet wordt uitgedroogde vorm. Nadat de hersenen wordt blootgesteld, zorgvuldig gebruik maken van een paar zeer fijne tang om de perineurale omhulsel te verwijderen direct boven de antennaal lobben. Wees voorzichtig niet tedoorboren de bij de hersenen met de tang.

3. Gaschromatografie met multi-channel recording

  1. De bee "preparaat" - gefixeerd in een buis met blootgestelde hersenen - is nu klaar voor elektrofysiologische opnames. Plaats de bij in een klem bevestigd aan een magnetische basis die zich op een lucht tafel.
  2. Regelen van een infuuszak, stroomregelaar en buizen (gevuld met saline insect) zodat de zoutoplossing continu de hersenen superfuses.
  3. Met behulp van een micromanipulator, insertareference elektrode, gemaakt van wolfraam draad, in het oog van de bijen.
  4. Met een afzonderlijke micromanipulator Plaats de meerkanaals elektrode, zoals een spiraaldraad tetrode of silicium meerkanaals elektrode (Neuronexus Technologies) in de antennaal lobben van de honingbij. Deze electrode is verbonden met een voorversterker zoals S-3 TDT het systeem Z serie met de Z-bus bioamp processor van de TDT systeem. Uitvoer van de Gas Chromatogram de detector via een afgeschermde BNC kabel kan worden aangesloten op de versterker en data acquisitie systeem, dat zowel de neurale en GC signaal gesynchroniseerd.
  5. Wacht ongeveer 30-60 minuten voor de neurale opnames te stabiliseren. Zodra de spontane activiteit en golfvorm van eenheden in de opname kanalen geworden consistent met een geur spuit de bij stimuleren en de respons van de opname kanalen om de geur te observeren.
  6. Opnemen extracellulaire spikes van neuronen door auto-drempelen de opname kanalen 3,5 tot 5 sigma van het signaal op de individuele opname kanalen. Handmatig drempelwaarde kan nodig zijn voor sommige kanalen om besmetting van elektrische ruis te voorkomen. De actiepotentialen van neuronen zal verschijnen als spanningspieken in de opname kanaal. Wanneer het kanaal spanning de drempel overschrijdt, het systeem buffers en slaat de enkele milliseconden vóór en na het overschrijden van de drempelwaarde, waardoor takinga snap-shot van de golfvorm, of spike.
  7. Direct naast de lucht tabel is de GC. Voor het injecteren van de bloemen-extract in de GC, zorg ervoor dat de methode voor de temperatuurverhoging van de GC run correct is. In ons voorbeeld gebruiken we een methode temperatuur vanaf 50 ° C gedurende 4 min gevolgd door een verhoging van de temperatuur met een snelheid van 10 ° C / min. tot 220 ° C, waarna wij het GC gedurende 6 min. We gebruiken een DB-5 GC kolom (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), met helium als draaggas. De inlaat is splitless, met een temperatuur tot 200 ° C. De vlamionisatiedetector temperatuur op 230 ° C.
  8. Injecteer het extract steekproef van de bloemen headspace in het verwarmde injectiepoort van de GC om de geadsorbeerde vluchtige stoffen vrijkomen in de GC-kolom. Het effluent uit de kolom wordt gesplitst 1:1 tussen de vlamionisatiedetector (FID) en de bij antenne met een glazen "Y" connector (J & W Scientific). Begin recording van de elektrode als je een monster te injecteren in het GC.
  9. Na de GC run is voltooid, laat de bereiding rusten gedurende 5 tot 15 minuten. Vervolgens injecteren een monster in de GC of stimuleren de preparatie met enkele vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen. In deze laatste werkwijze voor het stimuleren van de bereiding worden pulsen van lucht van een constante luchtstroom omgeleid door een glazen spuit met een stuk filtreerpapier waarop de verbindingen zijn gedeponeerd. De geur stimulus werd gepulseerd met een elektromagnetische klep geactiveerd door de software.
  10. Als eenheid activiteit plotseling stopt of verandert, controleer dan de zoutoplossing druppelen en laat de voorbereiding rusten gedurende 15 minuten. Als de spontane activiteit niet weer bij het oude niveau wordt het preparaat moet worden weggegooid en een andere bijen gebruikt, indien beschikbaar.
  11. Na het experiment vast de hersenen met 5% formaline gedurende 20 min met de probe nog in het weefsel. Vervolgens accijnzen de hersenenen plaats deze in 2% glutaaraldehyde gedurende 4 uur, en vervolgens doe een gegradeerde ethanol uitdroging serie en duidelijk de hersenen met methylsalicylaat. Op basis van de vaststelling en verrekening van het weefsel, de locaties in de AL waar de elektroden doorboord het weefsel moet duidelijk waarneembaar zijn door confocale microscopie.

4. Data-analyse

  1. Analyseer de verzamelde gegevens na het experiment te scheiden en identificeren van de opgenomen neurale eenheden. Gebruik typische softwareprogramma's (Offline Sorter, MClust, en SClust) te scheiden golfvormen, of "spikes", gebaseerd op spike vormen, zoals piek of dal amplitude, piek halve breedte, enz., of verminderde maatregelen (principale componenten) 17 , 18 (figuur 2). Alleen die clusters van pieken die gescheiden in de driedimensionale ruimte (PC1-PC3) en statistisch verschillend zijn van elkaar (multivariate ANOVA p <0,05) (Figuur 2) voor verdere analyse. Raadpleegcitaat # s 17 tot 19 voor de volledige beschrijving van tetrode opname en spike-sorteren methodieken.
  2. Tijdstempel pieken in elke cluster, en exporteer deze gegevens voor analyse met behulp van MATLAB of Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) naar raster percelen en vuursnelheid reacties (figuren 2, 3A) te creëren.
  3. Identificeer de retentietijden van vluchtige stoffen met behulp van de gelijktijdig opgenomen GC-gegevens. Gebruik de retentietijden van de vluchtige stoffen, door de top van de piek van het chromatogram te onderzoeken apparaat reageert op die tijdstippen.
  4. Om individuele eenheid reacties te onderzoeken door de GC run, bak het aantal pieken in de 100 msec intervallen en onderzoekt het tijdsverloop van de vuursnelheid reacties met betrekking tot de retentietijd van eluting vluchtige stoffen. De binning van pieken in 100 msec intervallen levert voldoende gegevens of signalen over het tijdsverloop van de neuronale respons op een geurstof elueren van GC.
  5. Om EXAmijnen bevolking reacties op de verschillende eluting vluchtige integreren de vuursnelheid reacties van individuele eenheden over een bemonsteringsperiode 3 sec, 1,5 sec vóór en 1,5 sec na de retentietijd van de vluchtige (figuur 3). Deze periode is kenmerkend voor de duur van een vluchtige eluerende van GC. We tonen vuursnelheid reacties van de eenheden door kleurcodering hen (rood is een hoge vuursnelheid reactie; blauw is een lage respons) en het regelen van hen als een activiteit matrix waarbij elke rij die de ensemble reactie op de GC effluent (kolommen) ( figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de assay met de GCMR M. lewisii bloemengeur, we injecteren 3 pl van het extract in de GC. Het totale aantal vluchtige elueren door de GC typisch 60-70 vluchtige stoffen. De geur van M. lewisii bestaat voornamelijk uit monoterpenoids, zoals β-myrceen (acyclisch) en α-pineen, waarbij de rest van de geur uit zes koolstof-vluchtige, zoals 2-hexanol en sesquiterpenoiden dat <1% van de headspace omvatten.

GCMR maakt gebruik van de gevoeligheid van neuronen antennelid lob en de neuronale verwerking van biologisch belangrijke vluchtige stoffen. Echter meerkanaalsopnames van deze aard in feite nemen een aselecte steekproef van neuronen in de antennelid kwab. Dit is omdat kleine veranderingen in de positie van de sonde positie tussen verschillende preparaten kunnen de opname array verschillende neuronen proeven. Bovendien is de exacte posities en morphologies van de opgenomen neuronen onbekend omdat de opname extracellulaire. Om tegemoet voor deze effecten, we hebben doorgaans GCMR experimenten met 8 tot 16 preparaten, met 8 tot 18 neurale eenheden in elk preparaat. Ter illustratie zullen echter gebruik gemaakt van data van slechts een preparaat (8 units).

Van de GCMR experimenten hebben we gevonden dat eenheden verrassend selectief in hun reactie op vluchtige, zoals in figuur 3A. Het onderste spoor (in zwart) geeft het ion chromatogram, waarbij elke piek overeenkomt met een bepaalde vluchtige die arriveert bij de detector tijd. De bovenste curve (blauw) toont het werkingsveld reacties van een unit. Unit reacties werden berekend door het aantal binning spikes die in een interval 100 msec, en delen door die periode de koers. In het voorbeeld is de neurale eenheid selectief in reactie op D-limoneen. Merk op dat, in dit toestel, de spontane Firing tarief kan nog steeds variabel en afhankelijk van toevallige schommelingen. Toch reacties op D-limoneen waren ruim boven de 95%-betrouwbaarheidsinterval, zoals berekend door de variantie in de vuursnelheid reacties door de tijd.

Niet alle eenheden echter in op de vluchtige elueren van de GC. In feite gemiddeld ongeveer 50% van de geregistreerde eenheden in elk ensemble waren reageren (Figuur 3B). Dit is verrassend, gezien de diversiteit van de vluchtige verbindingen in de bloemen kopruimte die elueren van de GC. Echter, het aandeel van niet-responsieve eenheden in een ensemble is verrassend consistent tussen preparaten, zoals gevonden in eerdere studies 13,14.

Voorbij de antwoorden van afzonderlijke eenheden, GCMR systeem maakt ook de analyse van de bevolking niveau antwoorden op de geurstoffen elueren van de GC. In het hier getoonde voorbeeld, is er een sterke ensemble selectiviteit voor een groep van enkele geurstoffen ( trans-β-ocimeen respectievelijk) uitgebreide reacties die in het ensemble, vertegenwoordigd door de genormaliseerde stooksnelheid van elke eenheid in de ensemble (kleurschaal).

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van headspace sorptie en GCMR systeem. (A) In het schema een bloem wordt omsloten door een Teflon zak en met een vacuumpomp wordt de lucht uit de zak opgezogen door een vluchtige trap (Porapak Q) aan het concentraat uitgestoten vluchtige stoffen. De lucht wordt gefiltreerd en naar de bijgevoegde bloem. (B) Het extract monster van de bloemen headspace is injecterened in de GC en de effluent uit de kolom wordt verdeeld zodanig dat de helft van de stroming treedt ofwel de GC's vlamionisatiedetector, en de andere helft van het effluent wordt gedragen door een verwarmde transportleiding en komt gelijktijdig op de antenne van de bijen. Actiepotentialen van de AL neurale ensemble worden continu extracellulair opgenomen tijdens de 20 min van geur levering via GC. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Sorteren van eenheden opgenomen met de multi-channel recording array (MR) in AL de bijen. De twee schachten zijn verdeeld, dat de matrix een groot volume van de AL omvat. (A) De golfvorm kenmerk (bijvoorbeeld amp litude, dal) van elk "spike" in de tetrode opname kan worden uitgezet in de driedimensionale ruimte. In het hier getoonde voorbeeld, wordt de hoogte van elke piek in 3 van de 4-opname kanalen uitgezet in 3-D. Omdat elke eenheid zijn eigen spike vorm, de spikes van een gegeven eenheid cluster samen, waardoor de eenheden worden geïdentificeerd en gesorteerd van elkaar. Gesorteerd eenheden worden duidelijke verschillen in het afvuren reacties (B; raster plot) en golfvorm (C) Positionering van de vier kanalen op elke schacht voorzien opname van uitgestrekte zones binnen het verwerken van glomeruli en neuropil. Neurale activiteit werd op elk van de vier kanalen uitgezet in 3-dimensionale ruimte (zie A), en gesorteerd volgens golfvorm kenmerken. Klik hier om groter bedrag bekijken .

manieren "> Figuur 3
Figuur 3. (A) vuursnelheid histogrammen van apparaat reageert op de elutie van de verbindingen M. lewisii headspace-extract (3 ul injectie) (bodemtrace, zwart). Bepaalde geurstoffen (bijv. D-limoneen; rode pijl) significante responsen opgeroepen in eenheden (B) Reactie van alle eenheden die werden uit de MR opgeslagen, waardoor we elke geurstof in het eluaat uit de GC.. Het oppervlak perceel is een kleurcodering volgens de genormaliseerde vuursnelheid reacties van de afzonderlijke eenheden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insect olfactorische-gemedieerde gedrag rijden veel verschillende processen, waaronder reproductie, host-selectie van locaties, en de identificatie van geschikte voedselbronnen. De studie van deze processen vereist het vermogen om de vluchtige stoffen die uit de bron, en het vermogen om die verbindingen die bemiddelen het gedrag identificeren identificeren. Complicerende zaken is dat geuren bestaan ​​uit tientallen tot honderden verschillende verbindingen die samen een unieke geur die anders wordt ervaren dan de afzonderlijke bestanddelen 6,7,13,19,20. Research, aanvankelijk uitgevoerd in het sexferomoon systeem 12, en meer recent in food-en ovipositie gerelateerde geuren 13,20, is gebleken dat het gedrag doeltreffendheid van het mengsel bevindt als functie van een aantal, belangrijkste vluchtige stoffen in het mengsel, en dat de mengsels te lokken significant groter gedragsreacties zijn dan de afzonderlijke bestanddelen. Het identificeren van die sleutelbestanddelen is dus een belangrijk onderdeel in de hedendaagse chemische ecologie en olfactorische neurobiologie.

Een verscheidenheid van technieken zijn ontstaan ​​in de laatste vijftig jaar voor de identificatie van bioactieve verbindingen die gedrag sturen bij insecten. De primaire techniek voor de detectie van vluchtige stoffen door het insect antenne gaschromatografie-electroantennography (GC-EAG). EAG werd oorspronkelijk ontwikkeld door Schneider 21, die opgenomen kleine spanningsschommelingen algemeen aangenomen te worden veroorzaakt door elektrische depolarisaties van vele olfactorische neuronen tussen de top en de basis van een insect antenne tijdens de stimulatie. EAG werd later geïntegreerd met de GC voor een nauwkeurige identificatie van de headspace vluchtige stoffen die uitlokken antennaal reacties 12,22. Voorts is het registreren van individuele neuronen receptor van het insect antenne later ontwikkeld 11,23 en gekoppeld aan de GC voor single-sensillen opnamen of GC-SSR leveren. EenH oewel GC-SSR is tijdsintensief en moeilijk dan GC-EAG, de opnames informatie over de individuele cel responsen via actiepotentialen in antwoord op de GC-effluenten, en maakt de identificatie van de receptoren die gespecialiseerd zijn op bepaalde stoffen die zou kunnen worden gemist door GC-EAG 24.

De GC-EAG en GC-SSR technieken bieden de identificatie van de vluchtige stoffen die reacties uitlokken in de periferie, en dus betrokken bij de geurstof receptie. Meer recente technieken begonnen behandeling reacties in het centrale zenuwstelsel van zowel zoogdieren en insecten en zodoende betrokken in odorant waarneming. Deze technieken vallen onder twee categorieën: beeldvormende technieken 25 genoemd GC-I (gaschromatografie-imaging) en directe elektrofysiologische methoden (bijvoorbeeld GCMR). GC-I en GCMR bieden verschillende voordelen vanwege de convergentie van de sensorische neuronen van de projectie of output, neuronen in deAL, alsmede dat deze methoden de bepaling van hoe geurstoffen worden in de hersenen mogelijk insect. Bovendien zijn dergelijke methoden nu gebruikt in de hersenen van zoogdieren 25.

Ondanks deze voordelen, GCMR en GC-bied ik nadelen ook. Data analyse kan tijdrovend, en in het geval van de GCMR, glomerulaire projecties van de opname neurale eenheden onbekend vanwege de opnamen zijn extracellulaire. Bovendien is het insect AL gestimuleerd door verschillende neuronale types inclusief de uitsteeksels neuronen (PN) en lokale interneuronen (LNS) waardoor identificatie van de opgenomen eenheden moeilijk. Echter in de mot, M. sexta, heeft recent werk aangetoond dat PNS en LNS kunnen worden geïdentificeerd door de pieken gedrag van de neuronen, waardoor de identificatie van deze types neuron hun spontane activiteit 26. Toch GCMR en GC-I bij het identificeren van de geurstoffen die geactie gespecialiseerde neuronen receptor die niet sterk opwekken EAG reacties, en bepalen hoe de populatie van neuronen in de hersenen proces de vluchtige stoffen. Een vergelijkende studie van deze verschillende methoden nog niet uitgevoerd, hoewel onze voorlopige gegevens suggereren dat de GCMR mogelijk meer geschikt dan de GC-EAG voor die verbindingen die bioactieve maar lage concentraties in het extract (Riffell ongepubliceerde resultaten). Toekomstige werkzaamheden kunnen onderzoeken of het trade-off in de gevoeligheid voor het detecteren van bioactieve geurstoffen met de analyse tijd tussen de verschillende methodologieën.

Hoewel we hier gericht op waarin de test methoden die we gebruiken voor B. impatiens bijen en de geur van M. lewisii, het extract en de gebruikte insectensoorten kan worden gewijzigd als bepaalde wijzigingen worden aangebracht. Insectensoorten worden geplaatst in verschillende pipetpunten (10 tot 200 pi) afhankelijk van hun grootte. Grotere soorten, zoals de mot, Manducasexta, kan worden geplaatst in 6 ml monster injectieflacons. Op een dergelijke wijze wordt het preparaat in leven gehouden waardoor stabiele opnamen enkele uren duren.

Tezamen analysemethoden voor het isoleren van verbindingen met elektrofysiologische opnames in de hersenen insect onderhavige krachtige hulpmiddelen voor de identificatie van bioactieve verbindingen en bij gebruik in combinatie met gedragsexperimenten kan een middel vormen voor belangrijke vluchtige voor voedselgerelateerde bepalen gedrag in insecten 13, alsmede die betrokken zijn bij host-site 2, en bloed-host gedragingen 27 die belangrijk zijn voor landbouwplagen en ziekteoverdrachtvectoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​IOS 1121692, en door de Universiteit van Washington Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics