Passaging hues मानव भ्रूणीय स्टेम trypsin के साथ सेल लाइनों

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

हम इस वीडियो में प्रदर्शित कैसे हमारी प्रयोगशाला नियमित trypsin के साथ रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों अंश.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

हम इस वीडियो में प्रदर्शित कैसे हमारी प्रयोगशाला नियमित trypsin के साथ रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों अंश. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं सेल संस्कृति की कलाकृतियों हैं, और उच्च जनसंख्या दोहरीकरण के साथ karyotypic असामान्यताएं प्राप्त करते हैं. उचित passaging एक स्वस्थ, undifferentiated, karyotypically सामान्य रंग मानव भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. सबसे पहले, एक विस्तार संस्कृति पीबीएस में धोया जाता है अवशिष्ट मीडिया और सेल मलबे को हटाने के है, तो कोशिकाओं को गर्म 0.05% trypsin - EDTA की एक न्यूनतम मात्रा के साथ मढ़ा हैं. Trypsin पांच मिनट के लिए कोशिकाओं पर छोड़ दिया है, तो कोशिकाओं धीरे एक 2ml सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ उखाड़ फेंकना हैं. सेल निलंबन एकत्र की है और hues मीडिया की एक बड़ी मात्रा के साथ मिश्रित है, तो कोशिकाओं कोमल centrifugation द्वारा एकत्रित कर रहे हैं. निष्क्रिय trypsin मीडिया मिश्रण निकाल दिया है, और कोशिकाओं पूर्व गर्म hues मीडिया में resuspended. एक उचित विभाजन अनुपात (आम तौर पर 1:10 1:20) की गणना की जाती है, और कोशिकाओं को फिर से 1-2 दिन पुरानी विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast फीडर कोशिकाओं की एक monolayer युक्त थाली पर चढ़ाया. नव वरीयता प्राप्त hues संस्कृति की थाली 48 घंटे के लिए undisturbed छोड़ दिया है, हर दिन तो मीडिया उसके बाद बदल गया है. यह महत्वपूर्ण है एक एकल कक्ष निलंबन नहीं trpsinize नीचे, के रूप में इस karyotypic असामान्यताएं शुरू करने का जोखिम बढ़ जाती है.

Protocol

सामान्य

हम एक निश्चित समय पर कोई एक से अधिक नमूना विगलन की सिफारिश करने के लिए आसान हैंडलिंग सुनिश्चित. हैंडलर ख्याल रखना समय की लंबी अवधि के लिए संस्कृतियों नहीं छोड़ कमरे के तापमान और कम सीओ 2 चाहिए. सभी जीवित कोशिकाओं के centrifugation कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500-600 XG पर किया जाता है.

MEFs (माउस भ्रूणीय फीडर कक्ष)

  1. पूर्व गर्म 37 MEF मीडिया डिग्री सेल्सियस -80 से MEF शीशी निकालें डिग्री सेल्सियस और तुरंत डूब ट्यूब के नीचे एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में आधा. यह 30-45 सेकंड के बारे में लेने से पहले कोशिकाओं 80% (छोटे जमी बाएं हिस्से) thawed चाहिए.
  2. लामिना का प्रवाह हुड ट्यूब जल्दी लाने के, 70% शराब के साथ नीचे स्प्रे, और पूर्व गर्म मीडिया कोशिकाओं हस्तांतरण.
  3. पहले से तैयार प्लेटों से जिलेटिन समाधान Aspirate.
  4. विभाज्य छह कुओं के प्रत्येक में एक बूंद बुद्धिमान तरीके में MEF समाधान के 2 मिलीग्राम. MEFs अच्छी तरह के बारे में समान रूप से वितरित करने के लिए सुनिश्चित करें. तिथि MEF, थाली, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह MEFs थाली करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति रातोंरात.
  5. 6 घंटे के बाद MEFs थाली से जुड़ी होगी. यह सबसे अच्छा है MEF प्लेटें चढ़ाना के बाद 24-48 घंटे का उपयोग करें. एक MEF थाली है कि 4 दिन पुराना है का उपयोग नहीं करते.
  6. पूर्व गर्म hues मीडिया और 0.05% डिग्री सेल्सियस हुड के अंतर्गत / trypsin 37 EDTA, prelabel एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब.
  7. ध्यान संस्कृति से hues मीडिया विभाजित किया जा aspirate. धीरे 2ml 1X फॉस्फेट बफर (पीबीएस) समाधान के प्रति अच्छी तरह के साथ कुओं धो लो. पीबीएस Aspirate. अच्छी तरह से करने के लिए 0.75 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA जोड़ें.
  8. ढक्कन बदलें, और 4x बढ़ाई तहत कोशिकाओं का पालन. आसपास MEFs hues कालोनियों कदम खींचना आसान शुरू करना चाहिए. जब MEFs पर्याप्त गोल कर रहे हैं और hues कालोनियों की सीमाओं के किसी न किसी रहे हैं, डाकू के लिए थाली वापसी. इस प्रक्रिया के बारे में 5 मिनट, अब बिल्कुल सं 10 मिनट या अपने कोशिकाओं को फिर से विकसित होगा की तुलना में लेना चाहिए.
  9. धीरे से ऊपर विंदुक और नीचे, अच्छी तरह से नीचे धोने है, जब तक MEF monolayer पूरी तरह से (monolayer चिपचिपा है और एक टुकड़ा में रह सकता है) अलग है.
  10. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अतिरिक्त hues मीडिया युक्त ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए 500xg कोशिकाओं की ट्यूब स्पिन, मीडिया Aspirate सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहना.
  11. MEFs की एक नई प्लेट पर थाली करने के लिए, अतिरिक्त hues मीडिया के लिए कोशिकाओं की उचित मात्रा निर्धारित जोड़ने के लिए, और समाधान एक स्वचालित विंदुक के साथ 5-7 बार विंदुक.
  12. MEFs की एक ताजा थाली से MEF मीडिया निकालें.
  13. विभाज्य hues समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए बुद्धिमान ड्रॉप, समान रूप से अच्छी तरह के बारे बूँदें वितरित सुनिश्चित करने. थाली मिलाते हुए बिना, ध्यान से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर कोशिकाओं रातोंरात वापस hues कालोनियों बीज चलो.
  14. Hues एक विभाजन से बाहर आने कोशिकाओं इसी तरह एक पिघलना से बाहर आने के उन लोगों के लिए व्यवहार करना चाहिए.

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Discussion

इस वीडियो में हम कैसे हम नियमित बीतने hues हमारी प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों का प्रदर्शन किया. कुशल और नियमित बंटवारे और passaging एक स्वस्थ मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. Trypsin मध्यस्थता पारित hues सेल लाइनों की एक महत्वपूर्ण लाभ यह है, तथापि, यह महत्वपूर्ण है संस्कृतियों में नहीं trypsinize या पुनः platting के दौरान एक एकल कक्षों के बड़े अनुपात है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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