Passaging nyanser mänskliga embryonala stamceller-linjer med Trypsin

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denna video visar vi hur våra labb rutinmässigt passager nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer med trypsin.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I denna video visar vi hur våra labb rutinmässigt passager nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer med trypsin Mänskliga embryonala stamceller är artefakter i cellodling, och tenderar att förvärva karyotypic avvikelser med hög befolkning dubbleringar. Korrekt passaging är nödvändig för att upprätthålla en sund, odifferentierad, karyotypically normala nyanser mänskliga embryonala kultur stamceller. För det första är en växande kultur tvättas i PBS för att avlägsna rester media och cellfragment, då cellerna överdragen med en minimal mängd varma 0,05% Trypsin-EDTA. Trypsin är kvar på cellerna i upp till fem minuter, sedan cellerna försiktigt rubbas med en 2 ml serologisk pipett. Cellsuspensionen samlas och blandas med en stor mängd nyanser media, då cellerna samlas in genom försiktig centrifugering. Det inaktiverade trypsin media blandning tas bort och celler resuspenderas i förvärmda nyanser media. En lämplig Delningsfaktorn beräknas (i regel från 1:10 till 1:20), och celler åter klädd på en 1-2 dagar gammal skylt som innehåller ett monolager av bestrålade möss embryonala celler fibroblast mataren. Den nysådda nyanser odlingsplatta lämnas orörd i 48 timmar, då medierna förändras varje dag därefter. Det är viktigt att inte trpsinize ner till en enda cell fjädring, eftersom detta ökar risken för att införa karyotypic avvikelser.

Protocol

Allmänt

Vi rekommenderar att tina inte mer än ett prov vid en viss tidpunkt för att säkerställa enkel hantering. Föraren ska se till att inte lämna kulturer vid rumstemperatur och låga CO2 under långa perioder. Alla centrifugering av levande celler sker vid 500-600 xg under 5 minuter vid rumstemperatur.

MEFs (Mouse Embryonala Feeder celler)

  1. Pre-varm MEF media till 37 ° C. Ta bort MEF flaskan från -80 ° C och omedelbart dränka den nedre halvan av röret i 37 ° C vattenbad. Det bör ta ca 30-45 sekunder innan cellerna är 80% tinat (små frysta delen till vänster).
  2. Snabbt föra röret till laminär strömning huven, spraya ner med 70% alkohol, och överföra celler till förvärmda media.
  3. Sug gelatinet lösningen från tallrikar förberedda tidigare.
  4. Alikvotera 2 ml MEF lösning i en droppe klokt sätt i vardera av de sex brunnar. Var noga med att fördela MEFs jämnt om väl. Datum MEF plattan och lägg i en 37 ° C inkubator över natten så att MEFs att fästa plåt.
  5. Efter 6 timmar MEFs kommer att knytas till plattan. Det är bäst att använda MEF plattor 24-48 timmar efter plätering. ANVÄND INTE en MEF platta som är över 4 dagar gammal.
  6. Pre-varma nyanser media och 0,05% Trypsin / EDTA till 37 ° C under huven, prelabel en steril 50 ml koniska rör.
  7. Försiktigt aspirera nyanser media från den kultur som ska delas. Försiktigt Tvätta brunnarna med 2 ml 1X buffrad fosfat lösning (PBS) per brunn. Aspirera PBS. Tillsätt 0,75 ml 0,05% Trypsin / EDTA till brunnen.
  8. Sätt lock, och observera celler under 4x förstoring. Den MEFs kring nyanser kolonierna skulle börja dra tillbaka. När MEFs tillräckligt rundad och gränser nyanser kolonierna är grova, tillbaka plattan huven. Denna process bör ta cirka 5 min, absolut inte längre än 10 minuter eller dina celler kommer inte att åter växa.
  9. Försiktigt pipettera upp och ner, tvätta botten av brunnen, tills MEF cellslager har helt fristående (cellslager är klibbig och kan finnas kvar i ett stycke).
  10. Överför cellsuspension till ett 50 ml koniskt rör som innehåller fler nyanser medier. Spin röret av celler 500xg för 5 minuter, aspirera från media, vara noga med att inte störa cellpelleten.
  11. Till tallrik på en ny tallrik MEFs, lägg till lämpligt bestämd mängd celler för att ytterligare nyanser media, och pipettera lösningen 5-7 gånger med en automatiserad pipett.
  12. Ta bort MEF media från en ny tallrik MEFs.
  13. Alikvotera nyanser lösningen droppvis i varje brunn och se till att fördela dropparna jämnt om väl. Utan att skaka plattan försiktigt tillbaka cellerna till en 37 ° C inkubator över natten så att nyanser kolonier utsäde.
  14. Nyanser celler kommer ur en splittring bör bete sig på samma sätt som de som kommer ur en tina upp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här videon vi visat hur vi rutinmässigt passagen nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer i vårt laboratorium. Effektiv och regelbunden delning och passaging är nödvändigt för att upprätthålla en sund mänskliga embryonala stamcellslinje. Trypsin medierad passage är en betydande fördel av nyanser cellinjer, är det dock viktigt att inte över trypsinize kulturer eller att ha en stor del av enskilda celler under re-platting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats