肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

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Immunology and Infection

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Summary

同時に右心機能、肺の炎症、免疫応答を調査するために具体的かつ迅速なプロトコルが学習ツールとして記述されています。ビデオおよび図は大型の研究に小さなために使用されるのに適応され組織されたチーム·アプローチでは、生理学や顕微解剖の手法について説明します。

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Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

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Abstract

右心の機能は、このように右心生理学と肺血管生理学をつなぐ、肺から血液を送り出す事である。炎症細胞浸潤は、サイトカインや成長因子の産生を起草によって、リモデリングプロセス1を開始することによって、心臓や肺の機能の一般的な修飾子です。

左心室に比べて、右心室は圧力変化の比較的狭いゾーンで動作する低圧ポンプです。増加した肺動脈圧、肺血管床および肺高血圧2の圧力の増加に関連付けられています。肺高血圧症は、多くの場合、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、または自己免疫疾患の3に関連付けられています。肺高血圧症は、生命と平均余命の質のための予後不良を与えるので、多くの研究がそのMIGメカニズムを理解に向けられているhtは、薬学的介入のための目標である4。肺高血圧症のための効果的な管理ツールの開発のための主な課題は、右心、肺、免疫系の分子や細胞の変化の同時理解の複雑さのままです。

ここでは、マウスの右心内の圧力変化を迅速かつ正確に測定するための手続きのワークフローや心臓、肺、免疫組織からのサンプルの同時収穫を提示します。メソッドが最初に肺動脈5-13の圧力の代理指標として、1990年代後半に開発されたクローズ胸マウスにおける頸静脈を介して右心室の直接カテーテル法に基づいています。主催チームのアプローチは非常に急速な右心カテーテル法を容易にします。これにより、自発的に部屋の空気を呼吸するマウスで測定を行うことができます。異なる作業領域で作業の流れの組織時間遅延を低減すると同時に、生理学実験や収穫免疫、心臓と肺の組織を実行する可能性を開きます。

ここで概説手続きワークフローが大きい薬剤スクリーニングアッセイには、小さなターゲットの実験から、実験室の設定や研究デザインの多種多様に適合させることができる。心エコー検査5,14-17、心臓、肺、免疫組織の収穫を含むように拡張することができ、心臓の生理データの同時取得は、前方の科学的知識の基礎を移動するデータを取得するために必要な動物の数を減らすことができます。また、ここに提示され、手続きのワークフローは、免疫、肺や心臓の機能をリンクするネットワークの知識を得るための理想的な基盤を提供します。ここで概説同じ原則は、必要に応じて他のまたは追加の臓器を研究するために適合させることができます。

Protocol

1。準備

  1. 次のように以下の溶液とチューブを( 表1)を準備します。
    1. ハンクス液、ペニシリン(100単位/ ml)/ストレプトマイシン(100 mg / ml)を持つ無カルシウム、マグネシウムまたはインジケータ。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1X、ノーカルシウム、マグネシウムをバッファリングしない。
    3. エタノール、70%、500ミリリットルを作る。
    4. PBSでホルムアルデヒド、7から10パーセントバッファ付き、500ミリリットルを作る。
    5. 麻酔ソリューション:
      1. AVERTIN。 2,2,2 - トリブロモ慎重5gに2 - メチル-2 - ブタノール5mlを加える。一度溶解し、暗所で室温の原液を保つ。ストック溶液0.25ミリリットルを取ると、ガラス底の瓶で1xPBS 10mlで薄め。 37℃アルミ箔、場所でボトルを包む℃で溶解し、次いで、アリコート5mlのポリプロピレンチューブに、冷蔵庫にキープまで。実験日の朝に1つのアリコートを温める。
      2. バルビツレート。 2.6パーセントのバルビツール酸ゾルを与えるためにPBSで原液を希釈しution。ポリプロピレン管3-4 mlのアリコートを置きます。
  2. 3作業領域( 図1)を整理します。
    1. 体重を決定するために、精密スケール(0.01 gの精度で0〜50グラム)、調査研究の識別番号を記録するための形式、日付、体重、右心、左心とセプタムの重みミクロスケールを:エリア:次の項目を並べ替える0.001グラムの精度で心の重みを判別するために、船の重量を量る。麻酔ソリューション(明らかにマークされている)、液体窒素を用いて小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートの血液や組織標本( 表1)を収集するために、手術器具( 表2、図2)、楽器( 表1)をきれいにするソリューションを提供しています。
    2. エリアB:解剖顕微鏡、アンプやラップトップコンピュータに接続された圧力制御ユニットに接続されている右心カテーテル:以下の項目を配置します。カテーテルは、内に配置される水を入れたビーカー。手術器具を( 表2)を配置し、縫合糸の部分が最適な長さに切断し、重量を量るボートに入れ、テープ(オートクレーブテープが最適である)最適な長さと幅にカットして簡単にアクセスするための顕微鏡や実験室のベンチに並んで、綿棒と除毛·ソリューションを提供します。研究の開始時にカテーテルのキャリブレーションを行います。
    3. エリアC:は、気管カニューレ、1 mLシリンジ、縫合最適な長さにカットし、量るボートに入れ、液体窒素を持つ小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートのBAL収集するためのルーペレンズ:以下の項目を配置しますおよび組織標本( 表1)。手術器具( 表2);ソリューションは、BAL実行すると気管カニューレや楽器を( 表1)きれいにする。

2。右心カテーテル検査

  1. 優しく量るbにマウスを置くことによって、精度のスケールを使用して、マウスの重量を量る燕麦。ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。重量を記録する。それは静脈の大きさが十分である限り小さいマウス(17グラム以上)カテーテルを挿入することが可能であり、頸静脈の直径は圧力カテーテルを収容しなければならないので、説明されたプロトコルは20グラム以上であるマウスに最適です。
  2. 20グラムの25グラムが30グラム、300μlを与えるための250μlを、与えるために、200μlを与えるために、例えば体重(10μL/ g)を、に応じてAVERTIN注射でマウスをAnaesthetize。正確な注入量は、マウス系統に応じて調整する必要があります。ストレスが麻酔薬への応答を変更する可能性があるので、ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。
  3. ダブルプリーツティッシュペーパーの上にマウスを鎮静されたら、場所。紙の上にID番号をメモします。穏やかに手術野をクリアするために首の腹側面に脱毛ローションをこすります。紙の上に戻ってマウスを置き、1〜2分待つ。
  4. 腹側面から髪を削除する優しく綿棒と髪の成長の方向に対して髪をなでることで首の。
  5. 慎重につま先の反射の有無をチェックすることにより、麻酔の十分な深さを決定:マウスは、その足の指のピンチには反応しません。
  6. 迅速かつリラックスした作業を、右心カテーテル検査の残りの部分では、最適に3から6分、10分以上を服用してはいけません。これは、カテーテルが静脈に滑ると水分の層の上に静脈の内側に移動する必要があるため、組織が乾燥しないことが重要である。手順の一貫したタイミングは、グループ間で比較可能であるデータの生成のために重要である。
  7. 発泡スチロールの板の上にティッシュペーパーでティッシュペーパーや転送に戻っマウスを置きます。オートクレーブテープを使用して所定の場所に足と頭を修正しました。
  8. あごから胸骨(胸の骨)への皮膚の切開を加えます。
  9. 慎重に右頸静脈を露出させるために下顎骨に向かって甲状腺壮大上向きに解剖するND気管。
  10. 約0.8倍の倍率(総合倍率[レンズXアイピース]で行われ、レンズにすでに焦点面で解剖顕微鏡下でマウスを保持する場所発泡スチロールのボードは、約8倍速です。
  11. 慎重に手術鉗子で周囲の結合組織を除去することによって右頸静脈を顕微解剖。
  12. 右頸静脈の上に縫合糸の2つのピースを置きます。小さな細流に静脈の血流を遮断するために顎骨に最も近い糸を結び、静脈の周りに緩い結び目で胸骨/胸の骨に最も近い糸を配置します。一つは、後で静脈に穴を見つけるために、血液の小さなしずくを使用することができ、これが必要になった。
  13. 呼吸をして、リラックス(首と顎の筋肉を緩める)接眼レンズを通して静脈にあなたの目を維持する。これは、あなたの手や指がスムーズに、リラックスした、安全に移動するようになります。に最も近い側の鉗子で静脈を押さえながら下顎骨は、他の一方が運営するマイクロ剪刀を用いて2つの縫合の間に静脈に穴をあけます。マイクロはさみを置いて、その手に力を入れ、カテーテルのために感じる。優しく親指と人さし指( 図3)との間でそれを保持し、カテーテルを取り出す。静脈の穴にカテーテルを挿入します。
  14. 優しく右心( 図3)にカテーテルを進める。カテーテルを挿入する必要があるどのくらいの近似インデックスを与えるとモニターを観察するカテーテルでマークを観察する。圧力曲線が表示されると、そっとカテーテルの周りに下糸を締​​めます。カテーテルはそれにコイルを与える引張強度を有しているので、マウスの呼吸と心臓の鼓動は、接辞付加的に、テープを使用してカテーテルをモーションを追加するためです。
  15. 後で分析するために、2分間録音圧力測定( 図4)。
  16. カテーテルを保持している縫合糸を開き、そっとretrieカテーテルをVEの。圧力変換器の背後にある部分を拭き、水をビーカーに戻してください。圧力変換器には手を触れないでください。
  17. 安楽死のための領域、血液および脾臓組織のコレクションにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。
  18. 次の動物を使ってプロシージャを起動します。圧力曲線(2.15)を記録するために待機している間にタイミングが許せば、麻酔薬を注入します。

3。血液および脾臓のサンプルの収集

  1. 、ソリューションをバルビツレートマウス当たり400μlを注入し、1〜2分待つ。これは、日常的に出血している間マウスが不注意にAVERTIN麻酔から回復する可能性を避けるために、我々の研究室で行われます。実験の適切な標準化がマウス当たりバルビツール酸塩の溶液と同じ用量を注入し、血液の収穫前に、同じだけの時間が待っていることによって達成されます。インスティテューショナル·動物実験委員会が許可されている場合と限り動物が前に慎重瀉血に麻酔の深さのために監視されているように、この工程を省略することができる。
  2. 腹部に切開を加えます。尾静脈(下大静脈)を開き、ホールピペットを用いて血液を収集します。
  3. 脾臓を削除するか、またはエッペンドルフチュー​​ブと液体窒素中でスナップ凍結に脾臓の一部、または単一細胞の後の準備のためのよく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに。
  4. BALのコレクション、肺所属リンパ節、肺、心臓組織のためのワークエリアCにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。

4。肺や心臓のサンプルの収集

  1. 筋肉や結合組織の気管自由を解剖。気管下に置く鉗子は、を通して縫合糸を引き出します。そっと穴をカットするのに十分なストレッチを生成します。穏やかな伸びを維持することは、わずかに回転運動を用いて気管カニューレを挿入し、縫合カニューレint型場所はO。ハンクス溶液の液滴を追加し、必要に応じて気管カニューレを挿入するために、気管が湿っていることを確認してください。手順では、手の動きが安全かつ円滑に保つために、首と顎の筋肉をリラックスして、呼吸する。
  2. 慎重に腹部の端から始まる胸の骨を除去することによって胸郭を開いて解剖する。これは、それが非常に難しいリンパ節を見つけることになるため、胸部の内容を邪魔しないでください。
  3. 優しくハンクス緩衝液1mlを挿入することによって、気管支肺胞洗浄(BAL)を行い、静かに注射器を回し、BAL液を取り出す。氷の上で3回、近くにチューブと場所を繰り返します。手順では、シリンジに接続し気管カニューレの端に目を保つ。肺の膨張と収縮を観察するために胸部に視線。
  4. 別のピンセットでリンパ節を見つけて、検索、鉗子の1セットで胸郭壁を保持することによって、収穫肺リンパ節。 24ウェルプレートにリンパ節を置きます。これは、kに重要である今検索する場所:首から始めて、マウスの右側から胸郭の入り口を見つけると脊椎( 図5)の上に見える。
  5. ティッシュペーパーで収穫心臓と場所。慎重にセプタム並ん解剖によって右心を分離します。 、重さ、液体窒素中で凍結をスナップするエッペンドルフチュー​​ブに重量と場所を記録するための作業領域に転送する。
  6. 主気管支を閉じるには、左肺の葉の周りに糸を置きます。エッペンドルフチュー​​ブおよび単一細胞懸濁液の後の単離のためにハンクス液を含む24ウェルプレートの各ウェルに液体窒素、または所定の位置にスナップ凍結に左肺葉無料、場所を解剖。
  7. 約を挿入します。 0.5ミリリットル、残りの肺葉に気管カニューレを介してホルムアルデヒド緩衝溶液。膨張後、ホルムアルデヒド溶液を含む50 mlチューブに胸部と場所の肺葉を解剖する。代替研究デザインについては、肺が最適で膨らませることができるMALは、メディアをカットする(10月、PBSで1:4に希釈)、凍結切片の後の準備のために希釈されていない10月を含む金型内で凍結した。別の研究デザインは、スナップ凍結肺組織および肺からの単細胞懸濁液を得る必要とするかもしれない。その場合、どんなインフレは必要ありません:残り肺葉を解剖、よく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに胸部と場所からそれらを取得します。
  8. ハンクス緩衝液を用いて洗浄することにより、クリーン気管カニューレを取り外し、手術器具を清掃してください。

5。右心カテーテルから発生する圧力曲線の解析

記録された右心室圧データは、各記録のグループのアイデンティティを知らない状態でLabChart 7ソフトウェアを用いて分析する。 20以上の曲線をランダムに選択し、各曲線の最大値と最小値の心室圧力差(ΔP)を測定する。平均ΔPを右vを与えるために計算されますentricular収縮期圧。

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Representative Results

右心圧カーブを得るための主要転帰は、右心カテーテルの正しい位置にすることによって達成される。右心室のカテーテル内部の正しい配置は圧力プラトー( 図4)になりますので、圧力時間曲線の形状は非常に重要です。先端のとがった曲線は、代わりに、右心室の壁に呼吸や心臓の拍動によって移動されるカテーテルを示す。動物の生存の段階で潜在的な問題を検出するには、ΔPの標準偏差、および心拍数は計算する必要があります。両方の値は治療群間で有意差はないことが予想されます。また、期待は、ΔPの値と心拍数が記録時間にわたるドリフトを示していないということです。たとえば、ゆっくりとΔPの値を大きくすると、低酸素性肺血管収縮18から20を示すでしょう。心拍数を下げるとindicatう麻酔のレベルは動物の死につながる高すぎることを電子。当研究室では別の人が手順を実行します。マウスの全グループにわたって、我々は日常的に右心室の圧力データを取得することに90〜95%の成功率を達成しています。

手順を学びながら、それは大きな頸静脈を持ち、雄マウスよりも少ない皮下脂肪預金を持っている傾向がある高齢雌マウス(25〜30 g、より)で開始するのが最善です。カテーテルの配置を確認するための最善の方法は、できるだけ早く、カテーテルが静脈の内側に固定されているような動物を安楽死させることです。直接カテーテルの配置を視覚化するために心臓から始まる動物を解剖。これは非常に問題解決を容易にするでしょう。

BAL液を得るための最初の成果は、気管カニューレの適切な配置である。これは、ハンクス緩衝液を注入されている肺の膨張、肺のデフレバフによって示されERは削除されます。予想される回復は肺の炎症を有する動物で対照動物に注入体積の70〜80%未満(ダウン50%)です。回収されたBAL液の上に泡は、界面活性剤の存在を示している。回収されたBAL液の血液汚染は、いずれかのために重要な肺の炎症の存在が原因で発生し、または洗浄液の注入と回復が早すぎたので。これは、肺内の損傷のいくつかの急性措置はBALの手順によって誘導されることが注目される。実験的なデザインがこれらの急性損傷パラメータとBALの検査も重要であるを理解することである場合は、1肺葉はオフに縛られ、BALを実施する前に削除する必要があります。

ここに示されている手順では、肺の標準化されたインフレと灌流せずに組織学のための肺組織を採取する。正確な組織学的形態計測は読み出し主要となっている場合、肺、気管、およびPEを介して膨張されるべきであるrfusionはすべて標準化された圧力の下で、肺動脈を経由して行われるべきである。

示されたプロトコルでは、心臓は、右心肥大(左心室と右心室中隔の重量/重量)の尺度としてフルトンインデックスを提供するために解剖されています。加えて、新しいメソッドが右心の組織学的評価に基づいている開発されている。右心肥大の新興組織学的措置がランダムに選択された右心の定義された領域内)の核の数であり、b)の血管、心臓の線維化面積あたりのインデックスのカウント。

これらの組織は、対照マウスでは非常に小さいので、私たちの研究室では、縦隔および気管気管支リンパ節( 図5)排水肺の正しい回復が日常的にフローサイトメトリーによって検証されます。しかし、unchallenのリンパ節の大きさは、住宅施設内microbiomeや動物の年齢に応じてGED、対照マウスは唯一の視覚的な確認のために十分に大きいかもしれません。フローサイトメトリーにより検証するときに、リンパ節細胞は、胸腺細胞と区別する必要がある。胸腺とリンパ節が互いに近接して配置され、胸郭内に含まれているため、事故によって、胸腺は簡単にリンパ節と一緒にサンプリングすることができます。区別は、胸腺が近い胸の骨と背骨の近くのリンパ節に配置されているということです。さらなる挑戦小さなリンパ節よりも多くの細胞を含む、胸腺が非常に大きいということです。胸腺細胞は容易にフローサイトメトリーおよびCD3、CD4とCD8マーカーを使用してリンパ節細胞と区別することができる。リンパ節は、特徴的に、CD3 +細胞、CD4またはCD8のいずれか陽性であるそのうちの過半数を持っています。これとは対照的に、胸腺細胞の大部分は、3つすべてのマーカーが陽性である(CD3 +、CD4 +、CD8 +)。マウスのリンパ節の局在に関する詳細な情報の更により原稿に記載されていますヴァンデンブルック 21。

各メイン手続きステップ(心臓カテーテル検査、血液および脾臓の回復は、BAL、肺や心臓の組織の収穫)の一貫したタイミングは、治療群間の比較を可能にする堅牢なデータを生成するために重要です。したがって、少なくとも2つ、ベスト3は、捜査官は、実験を遂行するために協力することをお勧めします。さらに、研究者は、動物のグループのアイデンティティの知識がなくて手順を実行することが重要です。したがって、データの識別は、グループのアイデンティティをあいまいな方法でなされなければならない。最後に、それは動物が分析されている順序がランダムであることも重要である。たとえば、単純な識別子は、実験や動物の番号の連続した​​日である。動物の4つのグループ(A〜D)は、例えば存在する場合は、身分証明書を割り当て、次の順序で動物を研究する:DATE_1:AA、日付2:BA、date_3:CA、date_4:ダ、date_5:AB、date_6:BB、date_7:CB、などなど。

この実験的な流れは、肺の炎症と右心機能を制御することを分子メカニズムの深い、同時試験が可能になります。同時データとサンプル収集は、より良い分子ネットワークの洞察、および新規な生物学的知識を得るために必要な動物の数の削減を実現しています。

チューブ/ビーカーのタイプ 溶液(体積) 利用
血液の処理
エッペンドルフ、1.5ミリリットル血清の血液
EDTAコーティングされた2.0ミリリットルプラズマのための血液
エッペンドルフ、0.5ミリリットル血清または血漿を凍結 BALの処理
ポリプロピレン、丸底、4.5ミリリットル気管支肺胞洗浄を集める
ポリプロピレン、丸底、4.5ミリリットル BAL上清を凍結
96ウェルプレート、スカート BAL細胞
組織の処理
ポリプロピレン、50ミリリットルホルムアルデヒド、7.5ミリリットル肺組織を修正
エッペンドルフ、1.5ミリリットル凍結肺葉スナップ
エッペンドルフ、1.5ミリリットル右心を凍結スナップ
エッペンドルフ、1.5ミリリットル左心を凍結スナップ
24ウェルプレートハンクス緩衝液、0.5〜1ミリリットル後でiに対する肺葉のクイックストレージ単一細胞のゾル化
24ウェルプレートハンクス緩衝液、0.5〜1ミリリットル単一細胞の後の単離のための脾臓のクイックストレージ
24ウェルプレートハンクス緩衝液、0.5〜1ミリリットル単一細胞の後の単離のためのリンパ節の迅速なストレージ
手順については、
ガラスビーカー、300ミリリットルオートクレーブ処理水カテーテルを保湿とクリーニング
ポリプロピレンチューブ、50ミリリットルハンクス緩衝液、50ミリリットル BALを行う
ポリプロピレンチューブ、50ミリリットルハンクス緩衝液、50ミリリットル気管カニューレを洗う
ポリプロピレンチューブ、50ミリリットル消毒剤溶液楽器のお手入れ
ポリプロピレンチューブ、50ミリリットル 70%エタノール CLeaning楽器
ポリプロピレンチューブ、50ミリリットル水道水楽器のお手入れ

表1準備とチューブとソリューションの組織。

楽器 説明 使用
はさみ丸みを帯びたまたはストレート5.5インチ、円形または鋭い端エリア
はさみ 4.0インチ、鋭い端を丸く
鉗子フラット、把持端部を備えた4.5インチ、曲がった、
鉗子フラット、把持端部を備えた4.0インチの、曲がった、
はさみスリムBlades/Angled- 9センチメートルエリアB
マイクロ剪刀ヴァンNAS春はさみ - 2ミリメートルブレード
鉗子鉗子(デュモン5位ファイン)
鉗子フラット、把持端部を備えた4.0インチの、曲がった、
鉗子 4.0インチ、ストレート、フラット、把持端
縫合編んだシルク縫合糸6から0
カテーテル圧力カテーテル
はさみ丸みを帯びたまたはストレート5.5インチ、円形または鋭い端エリアC
はさみ 4.0インチ、鋭い端を丸く
鉗子フラット、把持端部を備えた4.5インチ、曲がった、
鉗子フラット、把持端部を備えた4.0インチの、曲がった、
カニューレ気管カニューレ
縫合編んだ絹縫合4から0

楽器の表2組織、縫合糸、カテーテル、気管カニューレ。

図1
図1作業領域の概略図。)ワーク·エリア録音用、計量、血液および脾臓組織や動物のための一時的な保持空間のコレクション。右心カテーテル検査のためのB)ワーク·エリアのB、C)、BAL、肺、肺、リンパ節、心臓組織の収穫のためのワーク·エリアC。

図2
図2の手順に用いられる楽器)楽器ワークエリア用;。B)は右心カテーテル検査のための機器(ワークエリアB)、C)のイン作業領域C Dのtruments)気管カニューレ。定規は楽器の大きさを示しています。

図3
図3右心カテーテル。右心カテーテルでは、マークやテープ()で示したように、または手(B)で開催しました。カテーテル()で行われたマークに鉛筆を指しています。カテーテルの挿入(CE):右頸静脈(C)の洗浄、鉗子で開催された縫合静脈カテーテルは、以前静脈(D)に作られた穴に向かって進められている、次の挿入カテーテルを静脈内に(E)である。矢印は、カテーテル(D、E)を指す。

図4 "/ files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
図4:右心内の圧力変化のサンプルトレース。トレースは時間(分:秒)以上の圧力変化(mmHg)を示し、ソフトウェアは2つの異なる速度で曲線のそれぞれが表示されます。コントロールマウス(A)のトレース;および炎症誘発される肺動脈性肺高血圧症のリモデリングと(B)とマウスが表示されます。右心室収縮期圧を測定するために使用される曲線が強調されています。強調曲線に明確な圧力プラトーを注意してください。矢印は、技術的なエラーを示すスパイクを持つ曲線を指しています。カーブのこれらの先端のとがったタイプは右心室収縮期圧の測定に使用することはできません。 拡大図を表示するにはここをクリック

0023fig5.jpgの "alt ="図5 "/>
図5胸郭と脊椎に相対気管/縦隔リンパ節の場所。矢印はリンパ節を指しています。

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Discussion

ここで概説した実験フローは肺、心臓およびマウスにおける免疫系の応答の分析のために右心室収縮期圧およびサンプルの収穫の迅速かつ同時測定を可能にします。手順は、心臓生理学測定、顕微解剖と生細胞研究、組織学的分析、または組織のオミクス解析のためのその後の組織の収穫を兼ね備えています。完全な手順については、マウス当たり未満20分かかります。仕事がないためにエリア編成ワークフローから、2月3日、動物を同時に検討することができる。したがって、プロシージャは、小さな研究室から大手製薬研究に、設定の広い範囲で行われ、小さなターゲットを絞った実験12と大型画面に適しています。

心臓生理学の測定と組織の収穫の組み合わせは、心を制御したり、同期することを生物学的ネットワークを検出するように設計された分析を実行するための可能性を開き、肺トランスジェニックおよびノックアウトマウスの資源を活用したND免疫機能、。同時手続きの流れの重要な利点は、研究ごとに必要な動物の数の減少である。この手続きのワークフローの別のアプリケーションが必要に応じて同じ動物から他のまたは追加の臓器を研究する可能性である。

ここに示す手順は、麻酔導入の5-10分以内に、非常に急速に右心圧データを生成する。これは、彼らが自発的に部屋の空気を呼吸している間にそれが可能な動物を勉強することができます。アプローチの限界は、それが侵襲的であることである:動物は麻酔し、彼らは彼らの背中の上に配置され、カテーテルが右心室に心房を通じて頸静脈を介して渡されます。データは右心室の経時圧力変化の直接測定を表すため、制限は、この手順の利点である。さらに技術的な改善は、特にPRを微細化に頼るessureカテーテルは、ラットの22から24と、他の大型動物で行われているように、数週間の時間をかけて肺動脈圧のダイレクト録音を可能にするマウスでは、恒久的な、留置カテーテルを配置することを可能にし得る。近い胸の内頚静脈を通って心臓カテーテルの挿入は、自発的に動物が呼吸することが不可能である場合は、右室収縮期圧の変化の代替記録が胸部の開口部とを介して圧力カテーテルを留置することにより換気動物で行うことができます直接右心室25切開。右心機能の非侵襲的測定は、心エコー検査を使用して作ることができる。この手順は、右心カテーテル検査の前に行うことができ、またはマウスは事前侵襲計測5,14-17に病気の進行を勉強するために、複数回の心エコー検査で調べることができる。

この手順の別のアプリケーションがadditionaを得ることであるlのデータ。例として、流れと圧力を測定することができるカテーテルを使用して、右心出力が同時に右心圧の変化と一緒に記録することができた。ここに概説された手順は、さらに例えば、遺伝子変異8,10、たばこの煙への曝露26、または微生物感染27-29、免疫反応以外の肺高血圧症のトリガーである、生理的な細胞および分子の変化を理解するために使用することができ。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgements

この作品は、米国国立衛生研究所1R21HL092370-01(GG)、1R01 HL095764-01(GG)によって賄われていた。R01HL082694(JW)を、米国心臓協会、ファウンダーズ·アフィリエイト(0855943D、GG)、ストーニーウォルド - ハーバート基金、ニューヨーク(SHP)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

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References

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