हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के लिए केशिका बल लिथोग्राफी

Bioengineering

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Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

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Abstract

हृदय रोग दुनिया भर में मौत 1 का प्रमुख कारण बनी हुई है. हृदय ऊतक इंजीनियरिंग हृदय उत्थान के साथ ही इन विट्रो स्क्रीनिंग assays के लिए कार्यात्मक ऊतकों को विकसित करने के उद्देश्य के साथ groundbreaking चिकित्सा खोजों देने के लिए बहुत वादा है. हालांकि, हृदय के ऊतकों की उच्च निष्ठा मॉडल बनाने की क्षमता मुश्किल साबित हो गया है. दिल के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से नैनोमीटर स्तर 2 सूक्ष्म को लेकर दोनों जैव रासायनिक और biomechanical संकेतों से मिलकर एक जटिल संरचना है. यांत्रिक लदान की स्थिति और सेल ईसीएम बातचीत स्थानिय हाल ही में हृदय ऊतक इंजीनियरिंग 3-5 में महत्वपूर्ण घटक के रूप में मान्यता दी गई है.

हृदय ईसीएम के एक बड़े हिस्से में काफी ऊतक वास्तुकला और विद्युत युग्मन 2 को प्रभावित करती है कि नैनो पैमाने व्यास के साथ गठबंधन कोलेजन फाइबर से बना है. दुर्भाग्य से, कुछ तरीकों हवलदारई नैनोमीटर स्तर तक नीचे ईसीएम फाइबर के संगठन की नकल करने में सक्षम है. Nanofabrication तकनीक में हाल की प्रगति, तथापि, दिल 6-9 में ईसीएम के vivo संरचनात्मक और सब्सट्रेट कठोरता cues कि नकल स्केलेबल scaffolds के डिजाइन और निर्माण के लिए सक्षम है.

यहाँ हम का विकास उपस्थित दो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, लागत प्रभावी, और biocompatible बहुलक पाली (Lactide सह glycolide) (PLGA) 8 और एक polyurethane (पु) आधारित बहुलक का उपयोग कर हृदय कोशिकाओं के कार्यात्मक संरेखण के लिए स्केलेबल nanopatterning प्रक्रियाओं. ये anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) अच्छी तरह से संगठित, गठबंधन ऊतकों की अंतर्निहित ईसीएम नकल और सेल आकारिकी और समारोह 10-14 पर nanotopography की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एक टेम्पलेट के रूप में एक nanopatterned (एनपी) सिलिकॉन मास्टर का उपयोग करना, एक polyurethane acrylate (PUA) ढालना निर्मित है. इस PUA मोल्ड तो देहात के लिए प्रयोग किया जाता हैक्रमशः यूवी की मदद से या विलायक मध्यस्थता केशिका बल लिथोग्राफी (सीएफएल), 15,16 के माध्यम से पु या PLGA हाइड्रोजेल ttern. संक्षेप में, पु या PLGA पूर्व बहुलक एक गिलास coverslip और PUA ढालना शीर्ष पर रखा गया है पर तिरस्कृत ड्रॉप है. यूवी की मदद से सीएफएल के लिए पु तो इलाज के लिए पराबैंगनी विकिरण (λ = 250-400 एनएम) के संपर्क में है. विलायक मध्यस्थता सीएफएल के लिए, PLGA गर्मी (120 डिग्री सेल्सियस) और दबाव (100 किलो पास्कल) का उपयोग कर उभरा है. इलाज करने के बाद, PUA मोल्ड सेल संस्कृति के लिए एक ANFS छोड़ने के पीछे से खुली है. ऐसे नवजात चूहे निलय myocytes, साथ ही मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं, ANFS 2 पर बनाए रखा जा सकता है.

Introduction

हृदय रोग दुनिया में रुग्णता और मृत्यु का प्रमुख कारण है और एक पहले से ही तनावपूर्ण वैश्विक स्वास्थ्य प्रणाली 1,17 पर एक वजनदार सामाजिक - आर्थिक बोझ प्रस्तुत करते हैं. (1) इस्कीमिक रोग या कार्डियोमायोपैथी के बाद क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम पुनर्जीवित करने के लिए या (2) इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग या रोग मॉडलिंग के लिए दिल की एक उच्च निष्ठा मॉडल बनाने के लिए: हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के दो अलग लक्ष्य है.

दिल शरीर को रक्त की आपूर्ति करने के लिए लगातार काम करना चाहिए कि एक जटिल अंग है. Cardiomyocytes और सहायक ऊतकों की घनी पैक लामिना संरचनाओं दिल की दीवार 18,19 भर चक्करदार पैटर्न में व्यवस्थित कर रहे हैं. दिल भी Electromechanically कुशलता से शरीर से 21 रक्त बेदखल करने के लिए एक अत्यधिक समन्वित फैशन में 20 युग्मित है. प्रकृति के जटिल डिजाइन मज़बूती से इन विट्रो में recapitulated किया जा सकता से पहले कई प्रमुख बाधाओं, तथापि, को संबोधित किया जा रह है.मजबूत cardiomyocyte भेदभाव विधियों 22 विकसित किया जाना जारी है, हालांकि पहले, HPSC-मुख्यमंत्रियों अभी भी जगह अपरिपक्व phenotypes दिखा रहे हैं. उनके गुण विद्युत और आकारिकी सबसे निकट भ्रूण का स्तर 23 मैच. पारंपरिक संस्कृति की स्थिति में रखा दूसरा, जब स्टेम सेल व्युत्पन्न और प्राथमिक cardiomyocytes दोनों देशी, ऊतक संरचनाओं की तरह इकट्ठा करने में असफल. बल्कि, कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से उन्मुख हो जाते हैं और वयस्क मायोकार्डियम 24 से बंधी लोहे की छड़ के आकार का रूप का प्रदर्शन नहीं करते.

कोशिकाओं बातचीत के साथ जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पर्यावरण कई सेलुलर प्रक्रियाओं 11,13,25 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. ईसीएम काफी कोशिकाओं 6,26 की संरचना और समारोह को प्रभावित है कि जटिल, अच्छी तरह से परिभाषित आणविक और स्थलाकृतिक संकेत के होते हैं. दिल के भीतर, सेलुलर संरेखण बारीकी से अंतर्निहित नैनोमीटर पैमाने ईसीएम फाइबर 2 निम्नानुसार है. इन nanotopograph का प्रभावसेल और ऊतक समारोह पर राजनैतिक cues, हालांकि, अभी तक पूरी तरह समझ से है. नैनोमीटर पैमाने सेल biomaterial बातचीत का प्रारंभिक अध्ययन 27 सेल संकेतन, आसंजन 28-30, विकास 31, और भेदभाव 32,33 के लिए उप माइक्रोन स्थलाकृतिक संकेत के संभावित महत्व और प्रभाव का संकेत मिलता है. हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्केलेबल nanofabricated substrates विकसित करने में कठिनाई के लिए, इस तरह के अध्ययन विवो ईसीएम वातावरण में जटिल की बहु पैमाने सेलुलर प्रभाव पुन: पेश नहीं कर सका. इस प्रोटोकॉल में, देशी हृदय ईसीएम फाइबर संरेखण की नकल उतार सेल संस्कृति scaffolds के निर्माण करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी nanofabrication तकनीक cardiomyocyte-biomaterial बातचीत के उपन्यास जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है, वर्णित है. Cardiomyocytes के nanoscale ईसीएम पर्यावरण के साथ बातचीत समझौता कैसे और अधिक बारीकी से नकल देशी ऊतक समारोह के लिए सेलुलर व्यवहार को नियंत्रित करने की क्षमता के लिए अनुमति दे सकता हैtion. इसके अलावा, सेल monolayers 3 डी संरचनाओं की तुलना में एक सरलीकृत प्रयोगात्मक व्यवस्था कर रहे हैं लेकिन अभी भी व्यावहारिक जांच और कार्यात्मक स्क्रीनिंग 2,34-36 के लिए जटिल बहु सेलुलर व्यवहार दिखा रहे हैं. अंत में, इस तरह scaffolds पुनर्योजी उद्देश्यों 37 के लिए हृदय में प्रत्यारोपित जब सेलुलर भ्रष्टाचार समारोह में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

जब तक अन्यथा नोट सभी प्रक्रियाओं कमरे के तापमान (~ 23 डिग्री सेल्सियस) पर आयोजित की जाती हैं.

सिलिकॉन मास्टर के 1. निर्माण

  1. 2/2 एन गैस के तहत 100% इथेनॉल या xylene और सूखे के साथ स्वच्छ सिलिकॉन वेफर.
  2. एक 0.3-0.5 माइक्रोन मोटी फिल्म का निर्माण करने के लिए 2,000-4,000 आरपीएम की घूर्णन गति में स्पिन coater में सिलिकॉन वेफर रखें.
  3. एक फोटोलिथोग्राफी प्रणाली का उपयोग करके पैटर्न सही आयाम के साथ photoresist फिल्म
  4. पूरी तरह से photoresist विकासशील समाधान का एक उचित मात्रा में नमूनों photoresist लेपित सिलिकॉन वेफर्स विसर्जित कर दिया.
  5. विआयनीकृत पानी के साथ विकसित photoresist लेपित सिलिकॉन वेफर्स कुल्ला.
  6. पास खड़ी ओर दीवारों, गहरे प्रतिक्रियाशील आयन खोदना एक नक़्क़ाशी प्रणाली का उपयोग कर उजागर सिलिकॉन के साथ उप माइक्रोन पैमाने लकीरें की सरणियों के रूप में.
  7. एक प्लाज्मा आशेर प्रणाली में सिलिकॉन वेफर रखकर शेष photoresist निकालें.
  8. डब्ल्यू सिलिकॉन कटबाद में प्रतिकृति ढलाई के लिए उचित आकार सिलिकॉन मास्टर्स में एक हीरे की इत्तला दे दी कटर के साथ afers.

सिलिकॉन मास्टर से PUA मोल्ड के 2. निर्माण

नोट: nanofabrication के लिए सिलिकॉन मास्टर को जोड़े जाने के लिए वॉल्यूम polyurethane acrylate (PUA) समाधान का चिपचिपापन के रूप में भी दोहराया जा nanopatterned मास्टर के क्षेत्र के आधार पर अलग अलग होंगे.

  1. 100% इथेनॉल या ओ 2/2 एन गैस तहत xylene और सूखे के साथ स्वच्छ सिलिकॉन मास्टर सतह.
  2. एक पेट्री डिश में सिलिकॉन मास्टर पैटर्न पक्ष रखें.
  3. एक 2 सेमी x 2 सेमी सतह पैटर्न, पैटर्न सतह को PUA के पिपेट 40 μl के साथ एक सिलिकॉन मास्टर के लिए.
  4. 4 सेमी तिरस्कृत PUA से अधिक x 4 सेमी पारदर्शी पॉलिएस्टर (पीईटी) फिल्म के एक पत्रक रखें.
  5. नीचे पीईटी चादर पर प्रेस और इतना है कि (इस तरह के एक कार्ड के रूप में) एक रोलर या फ्लैट धार सतह का उपयोग पैटर्न चेहरे पर चादर के नीचे PUA फैल पूरेपैटर्न PUA prepolymer द्वारा कवर किया जाता है.
  6. 50 सेकंड के लिए लगभग 10 सेमी एक 20 वाट (115 वी) पराबैंगनी प्रकाश (λ = 365 एनएम) के नीचे सिलिकॉन मास्टर, prepolymer, और पीईटी रखें. प्रभावी हो, पराबैंगनी प्रकाश तरंगदैर्ध्य 310-400 एनएम के बीच कहीं भी हो सकता है. प्रकाश की तीव्रता सब्सट्रेट की सतह पर 10-15 मेगावाट / 2 सेमी है.
  7. इलाज करने के बाद, संदंश के साथ धीरे धीरे पीईटी फिल्म को हटा दें. PUA सिलिकॉन मास्टर nanopattern की एक नकारात्मक साथ पीईटी फिल्म को संलग्न करना चाहिए.
  8. उपयोग करने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए यूवी के तहत PUA / पीईटी nanopatterns इलाज. Overexposure एक मुद्दा नहीं है.
  9. सिलिकॉन स्वामी को साफ करने के लिए, PUA के अलावा बिना गुरु के शीर्ष पर पीईटी की एक और फिल्म के लिए जगह और 50 सेकंड के लिए पराबैंगनी प्रकाश (λ = 365 एनएम) को बेनकाब और पीईटी फिल्म को हटा दें. यह किसी भी unreacted monomers निकाल देंगे.
  10. 2/2 एन गैस के तहत 100% इथेनॉल या xylene और सूखे के साथ सिलिकॉन मास्टर कुल्ला.

3 ए. Nanopatterning Polyurethane पॉलिमर

  • 10 मिनट के लिए एक ओजोन उपचार कक्ष में रखकर 25 मिमी व्यास परिपत्र गिलास स्लाइड तैयार करें.
  • आसान से निपटने के लिए छोटे PDMS ब्लॉक पर ओजोन का इलाज गिलास स्लाइड रखें.
  • गिलास स्लाइड के लिए तूलिका के साथ सतह आसंजन प्रवर्तक की पतली परत लागू करें. 30 मिनट के लिए शुष्क हवा गिलास स्लाइड.
  • प्रिंटर कागज के एक टुकड़े पर कांच स्लाइड रखें.
  • गिलास स्लाइड के केंद्र के लिए पूर्व बहुलक (NOA 76) polyurethane से 10 μl (पु) बांटना गिरा. कोई बुलबुले के बाद इसके अलावा मौजूद हैं सुनिश्चित करें.
  • जगह PUA मिट्टी, पैटर्न गिलास स्लाइड पर, नीचे चेहरा. समान रूप से PUA ढालना साथ एक रबर सिलेंडर रोलर रोलिंग द्वारा कांच स्लाइड की सतह भर में पु फैलाने. कागज प्रिंटर बहुलक अतिप्रवाह अवशोषित करेंगे.
  • वाट यूवी लैम्प. पु के polymerization समय यूवी स्रोत की शक्ति पर निर्भर है.
  • यूवी प्रकाश स्रोत से नमूना निकालें और ध्यान पु लेपित गिलास स्लाइड से PUA ढालना छील. पु के polymerization सी माना जाता हैomplete सफाई से दूर नमूना से PUA ढालना छिलके और पु गिलास स्लाइड एक आनंददायक उपस्थिति है जब.
  • के रूप में लंबे समय से एक महीने के रूप में के लिए भंडारण के लिए desiccator में समाप्त नमूने रखें.
  • 3 बी. Nanopatterning पाली (Lactide सह Glycolide) Hydrogel

    1. सख्ती एक 10:1 अनुपात में सिलिकॉन elastomer आधार और सिलिकॉन elastomer इलाज के एजेंट के मिश्रण से एक फ्लैट PDMS ढालना बनाएँ.
    2. (PDMS 5 मिमी मोटी है कि इतनी आईई) PDMS अग्रदूत पकवान के किनारे 5 मिमी तक पहुंचता है तो यह है कि मिश्रित PDMS एक पेट्री डिश में समाधान अग्रदूत डालो.
    3. देगास के लिए 1 घंटे के लिए एक desiccator में पेट्री डिश और PDMS अग्रदूत रखें.
    4. इलाज करने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में पेट्री डिश और PDMS अग्रदूत ले जाएँ.
    5. PDMS ठीक हो जाने के बाद, 3 सेमी x 3 सेमी वर्ग वर्गों में फ्लैट PDMS कटौती करने के लिए एक रेजर का उपयोग करें. ये patterning प्रक्रिया में बाद में इस्तेमाल फ्लैट PDMS नए नए साँचे हो जाएगा.
    6. पी एल द्वारा क्लीन 25 मिमी व्यास परिपत्र गिलास स्लाइडएक पानी sonicator में 30 मिनट के लिए isopropyl शराब में acing.
    7. 2/2 एन गैस के नीचे सूखी साफ कांच स्लाइड.
    8. ड्रॉप PLGA समाधान के 100 μl बांटना गिलास स्लाइड पर (15% डब्ल्यू क्लोरोफॉर्म में PLGA वी /).
    9. विलायक अवशोषित और एक फ्लैट PLGA सतह प्राप्त तिरस्कृत PLGA के शीर्ष पर एक फ्लैट PDMS मोल्ड रखें. 5 मिनट के लिए PDMS के शीर्ष पर एक 200 ग्राम वजन रखकर एक प्रकाश दबाव (~ 10 kPa) लागू करें.
    10. धीरे धीरे दूर फ्लैट PDMS ढालना छील और अवशिष्ट विलायक हटाने और PLGA और कवर कांच के बीच आसंजन बढ़ाने के लिए 5 मिनट के लिए एक preheated प्लेट (120 डिग्री सेल्सियस) पर कांच कवर जगह है.
    11. फ्लैट PLGA के शीर्ष पर एनपी PUA मोल्ड प्लेस और PUA मोल्ड के शीर्ष पर एक 1 किलो वजन रखकर लगातार दबाव (~ 100 किलो पास्कल) और गर्मी (120 डिग्री सेल्सियस) लागू 15 मिनट के लिए गर्म थाली पर है.
    12. PLGA कवर स्लाइड से वजन निकालें और substrata कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. Substrata किया गया है जब तक PUA ढालना न निकालेंठंडा.
    13. Substrata पर्याप्त ठंडा है, ध्यान से एनपी PLGA बुनियाद खुलासा, एनपी PUA मोल्ड दूर छील. एनपी PLGA बुनियाद एक आनंददायक उपस्थिति होनी चाहिए.
    14. के रूप में लंबे समय से एक महीने के रूप में के लिए भंडारण के लिए desiccator में समाप्त नमूने रखें.

    4. सेल बोने और संस्कृति

    नोट: इस प्रोटोकॉल नवजात चूहे निलय myocytes (NRVMs) और H7 मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hESC-सीएमएस) लेकिन अन्य सेल के सूत्रों की संस्कृति का वर्णन किया जा सकता है.

    1. एक 35 मिमी टिशू कल्चर polystyrene पकवान ANFS coverslips (पु या PLGA) संलग्न करें. पकवान के नीचे करने के लिए और धीरे Norland ऑप्टिकल चिपकने वाला (NOA83H) की पिपेट 20 μl NOA के शीर्ष पर ANFS coverslip जगह. गोंद बाहर फैल गया है और पूरे coverslip नीचे कवर करने की अनुमति. 10 मिनट के लिए यूवी के लिए पकवान उजागर करके NOA इलाज.
    2. दो बार, 5 मिनट के लिए 70% जलीय इथेनॉल समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ rinsing द्वारा ANFS जीवाणुरहित. ई निकालेंआकांक्षा से thanol. अनुमति दें ANFS जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी नसबंदी दीपक (λ = 200-290 एनएम) के तहत ~ 1 घंटे के लिए पूरी तरह से सूखी हवा.
    3. सेलुलर आसंजन रातोंरात फ़ाइब्रोनेक्टिन में ANFS कोटिंग से बढ़ाया है. 5 ग्राम / मिलीलीटर के लिए डि पानी में फ़ाइब्रोनेक्टिन पतला. डिश में fibronectin समाधान के पिपेट 2 मिलीलीटर. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेस और 5% सीओ 2 रातोंरात (कम से कम 6 घंटे).
    4. पिछले प्रोटोकॉल 22 के अनुसार NRVMs, hESC-सीएमएस, या हित के अन्य हृदय कोशिकाओं को प्राप्त करने.
    5. गोली कोशिकाओं के लिए 3 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र सेल नमूना.
    6. ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटायें. गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करें.
    7. 4.6 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
    8. ध्यान से निष्फल ANFS पर सेल निलंबन के 200 μl विंदुक. यकीन है कि सेल निलंबन coverslip पर बना हुआ है.
    9. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% से कम इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की जगहसीओ कोशिकाओं ANFS को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए 2.
    10. एक ही परिस्थितियों में इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के पकवान और बदलने के लिए गर्म संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    11. 24 घंटे के बाद, मीडिया को दूर करने और अतिरिक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए दो बार DPBS के 2 मिलीलीटर से धो लें.
    12. एक ही परिस्थितियों में इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के पकवान और बदलने के लिए गर्म संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें. संस्कृति कोशिकाओं संगम. हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें.

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    Representative Results

    चित्रा 1 दो निर्माण विधियों के लिए उत्पादन की प्रक्रिया के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन है. कारण है nanoscale स्थलाकृति की वजह से प्रकाश के विवर्तन के लिए, nanopatterning ANFS को एक आनंददायक सतह में परिणाम चाहिए. 2 800 एनएम रिज और नाली के साथ एक अच्छी तरह से नमूनों 25 मिमी एनपी पु coverslip (2A चित्रा) पर यह इंद्रधनुषी सतह दर्शाया गया चित्र चौड़ाई (चित्रा 2 बी). ANFS की इंद्रधनुषी उपस्थिति रिज और नाली चौड़ाई पर निर्भर करता है थोड़ा भिन्न हो जाएगा.

    ANFS पर कोशिकाओं बोने के बाद, कोशिकाओं सब्सट्रेट की लकीरें साथ समानांतर दिशा में संरेखित करने के लिए शुरू करना चाहिए. संरेखण बोने के बाद पहले 24 घंटे के भीतर स्पष्ट हो जाना चाहिए और. 3 संस्कृति के 48 घंटे के बाद संस्कृति और hESC-मुख्यमंत्रियों के 7 दिनों के बाद NRVMs के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से पता चलता है संवर्धन अवधि की सम्पूर्णता के लिए रहना चाहिए. NRVMs एकunpatterned सतहों पर cardiomyocytes बेतरतीब ढंग से (आंकड़े 3 ए और 3 सी) उन्मुख होते हैं जबकि एन डी hESC-मुख्यमंत्रियों एनपी सतहों पर स्पष्ट संरचनात्मक anisotropy और संरेखण (आंकड़े 3B और 3 डी) दिखा. Immunohistochemical विश्लेषण सेल cytoskeletal संरेखण पर nanotopography के प्रभाव पर प्रकाश डाला गया. Actin microfilaments (एफ actin) और नैनो लकीरें साथ गठबंधन किया लेकिन बेतरतीब ढंग से unpatterned substrata पर कोशिकाओं (चित्रा 4) में वितरित रहते बन ANFS पर संवर्धित कोशिकाओं में α-sarcomeric actinin. हृदय कोशिकाओं संस्कृति की 24-48 घंटे के बाद सहज पिटाई दिखा रहे हैं.

    चित्रा 1
    चित्रा 1.   Nanofabrication योजनाबद्ध - दो nanofabrication proc के चित्रesses. विलायक मध्यस्थता सीएफएल को दर्शाती (बी - - डी) (एच ई), जबकि चित्रित, केशिका बल लिथोग्राफी (सीएफएल) यूवी सहायता प्रदान की. (ए) PUA नकारात्मक एक सिलिकॉन मास्टर से बनाया गया है. (बी) पु पूर्व बहुलक ड्रॉप तिरस्कृत एक गिलास स्लाइड और PUA मोल्ड पर शीर्ष पर रखा गया है. (सी) एक PUA मोल्ड और पु coverslip तो पु इलाज करने के लिए पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में हैं. (ई) PLGA बहुलक समाधान ड्रॉप तिरस्कृत एक गिलास स्लाइड पर है और एक फ्लैट PDMS ढालना एक फ्लैट PLGA सतह बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. (एफ) एक PUA ढालना फ्लैट PLGA के शीर्ष पर रखा गया है और (छ) लगातार गर्मी और दबाव PLGA में गर्म एम्बॉसफ़िल्टर एनपी को लागू कर रहे हैं. (डी, एच) PUA मोल्ड दूर छीलने के बाद, एक एनपी पु या PLGA सब्सट्रेट पीछे छोड़ दिया है. हृदय कोशिकाओं तो कोशिकाओं की निरपेक्ष सरणियों बनाने के लिए इस एनपी सतह पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है.


    चित्रा 2. एनपी पु सब्सट्रेट. (ए) बड़े क्षेत्र एनपी सतह की तस्वीर. coverslip के इंद्रधनुषी उपस्थिति nanotopography के कारण होता है. अंतर्निहित nanotopography के पार अनुभाग (बी) SEM छवि.

    चित्रा 3
    NRVMs की चित्रा 3. गठबंधन cardiomyocytes. 10X उज्ज्वल क्षेत्र छवियों संस्कृति के 7 दिनों के बाद (ए, बी) और hESC-मुख्यमंत्रियों संस्कृति के 2 दिन (सी, डी) के बाद. NRVMs फ्लैट पु substrates (ए) पर NRVMs बेतरतीब ढंग से गठबंधन कर रहे हैं जबकि (बी) स्पष्ट संरचनात्मक संरेखण प्रदर्शन एनपी पु substrates पर सुसंस्कृत. (बी) और (डी) में तीर एनपी anisotropy की दिशा इंगित करता है. = 100 माइक्रोन स्केल बार.

    चित्रा 4
    .. चित्रा 4 Immunofluorescent confocal इमेजिंग सेल cytoskeletal संरेखण और स्त्रिअतिओन्स; α-sarcomeric actinin (लाल), सेल नाभिक (नीला), और एफ actin (हरा). फ्लैट substrata पर संवर्धित कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से फाइबर उन्मुख है, जबकि एनपी substrates पर संवर्धित कोशिकाओं α-sarcomeric actinin और एफ actin फाइबर गठबंधन किया है. लाल α-sarcomeric actinin चैनल पर बैठाना स्पष्ट रूप से धारीदार sarcomeres दिखा.

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    Discussion

    कार्यात्मक परिपक्व हृदय के ऊतकों में vivo और हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के इन विट्रो अनुप्रयोगों में दोनों के लिए कमी कर रहे हैं. यहाँ वर्णित सीएफएल nanofabrication तरीकों सेलुलर संरेखण को प्राप्त करने और कारण प्रणाली के scalability के लिए macroscopic ऊतक समारोह को प्रभावित करने के लिए मजबूत तकनीक है. बड़े क्षेत्रों को आसानी से नमूनों और सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Macroscopic सेलुलर संरेखण biomimetic, यह मायोकार्डियम 38 के यांत्रिक और बिजली दोनों गुणों को प्रभावित करती है के रूप में कार्य ऊतक बनाने के क्रम में हृदय ऊतक इंजीनियरिंग में आवश्यक है.

    यहाँ तरीकों हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के भीतर आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. यह पहले के nanoscale cues एक कार्डियक स्टेम सेल आला बनाने और उत्थान 14 को बढ़ावा देने में मदद करते हैं प्रदर्शन किया गया है. इस प्रकार ऐसे PLGA रूप से biodegradable पॉलिमर का उपयोग करके, nanopatterned "पैच" को बढ़ावा देने के लिए किया जा सकता हैहृदय अपमान के बाद चिकित्सा. वैकल्पिक रूप से, देशी दिल के रूप में इसी तरह लोचदार moduli साथ हाइड्रोजेल का उपयोग करके, cardiomyocyte-ईसीएम बातचीत एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है.

    ऐसे microcontact मुद्रण, electrospinning, और microtopography रूप में विभिन्न अन्य तरीकों,, पहले से microscale 39-41 पर इंजीनियर हृदय के ऊतकों की संरचना को नियंत्रित करने के लिए नियोजित किया गया है. इन तकनीकों सेलुलर संरेखण पाने में सफल साबित किया है, यह vivo में हृदय के ऊतकों की संरचना और समारोह ईसीएम के बहुत छोटे, nanotopographical cues के द्वारा नियंत्रित होता है और इस प्रकार हमारे एनपी सब्सट्रेट फायदेमंद साबित करना चाहिए कि संभावना है. इसके अतिरिक्त, इन microscale patterning तकनीक हमारे anisotropically nanofabricated substrates की तुलना में निहित नुकसान है. उदाहरण के लिए, हमारे nanopatterning विधि अधिक लागत प्रभावी और electrospinning से चलाया हुआ है. Microcontact मुद्रण, दूसरी ओर, रिलायंस एनर्जीसंरचनात्मक anisotropy हासिल करने के लिए विशिष्ट गलियों का पालन करने की कोशिकाओं पर एँ. एक कार्यात्मक monolayer बनाने के लिए, कोशिकाओं को फिर से पैदा करना चाहिए या तंग जंक्शनों के लिए फार्म का इन गलियों से बाहर चले जाते हैं. यह बहुत अधिक मुश्किल ऐसे नवजात cardiomyocytes रूप में कोई proliferative क्षमता के लिए थोड़ा के साथ कोशिकाओं के लिए है. Microtopography भी कसकर युग्मित सेल monolayers बनाने के लिए असमर्थता द्वारा सीमित है. कारण microtopography की तुलना में कोशिकाओं के पैमाने पर करने के लिए, कोशिकाओं के शीर्ष पर या microridges के अंदर रहते हैं. यह सेल सेल बातचीत की राशि की सीमा और सेल सेल युग्मन कम हो जाती है. हमारे विधि के साथ, कोशिकाओं bioinspired नैनो पैमाने स्थलाकृति के माध्यम से गठबंधन हो गया है और इस सुविधा का आकार कम से कम खुद कोशिकाओं की तुलना में छोटे परिमाण के एक आदेश के रूप में स्वतंत्र रूप से पड़ोसी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं. इस कसकर युग्मित कोशिकाओं monolayers पैदा किए जाने, अधिक biomimetic के लिए अनुमति देता है.

    एनपी पु साथ इष्टतम परिणामों के लिए हम दृढ़ता से छ निम्नलिखित सुझावलड़की coverslip पूर्व उपचार कदम. ये कदम कांच की सतह के लिए बहुलक आसंजन में वृद्धि होगी. यह न केवल निर्माण के दौरान PUA मास्टर की साफ हटाने में सहायता भी है लेकिन प्रयोगों के दौरान कांच से detaching से नमूनों बहुलक रोका जा सके. पूर्व उपचार के कदमों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, पानी में एक एनपी पु सब्सट्रेट जगह और बहुलक कांच का पालन रहता है अगर निरीक्षण करते हैं.

    PLGA एसिड और युक्ति और इन विवो में दवा वितरण दोनों के लिए विकसित किया गया था कि लैक्टिक एसिड के एक सह बहुलक है. इस प्रकार, इस बुनियाद कोशिकाओं के लिए एक अच्छा biocompatible, ईसीएम प्रदान करता है. PLGA की कठोरता लैक्टिक एसिड को एसिड का अनुपात ट्यूनिंग या तो द्वारा या क्लोरोफॉर्म में PLGA का संकुचन बदलकर संग्राहक जा सकता है.

    विभिन्न मापदंडों आसानी से अनुकूलन या अनुसंधानात्मक प्रयोजनों के लिए इस प्रणाली में विविध और समायोजित किया जा सकता है. विभिन्न पु पॉलिमर आधारित एक विस्तृत श्रृंखला के साथ उपलब्ध हैंयांत्रिक गुणों. इस प्रकार विभिन्न पु पूर्व पॉलिमर का उपयोग करके, विभिन्न सब्सट्रेट कठोर ही प्रोटोकॉल द्वारा निर्मित किया जा सकता है. उपयोगकर्ता भी सब्सट्रेट स्थलाकृति बदल सकते हैं. सब्सट्रेट के nanotopography सिलिकॉन मास्टर की डिजाइन पर निर्भर है. इसलिए, रिज और नाली चौड़ाई, साथ ही विभिन्न geometries की एक किस्म, विनिर्देशों को पूरा करने के लिए सिलिकॉन मास्टर डिजाइन बदलकर नमूनों जा सकता है.

    नैनो लकीरें का आकार भी सेल और ऊतक व्यवहार को प्रभावित करती है. छोटे नाली widths के खांचे में कम सेल पैठ के लिए अनुमति देते हैं और इंजीनियरिंग nanotopography 2 के साथ सेल की बातचीत की सीमा. यह बदले में हृदय सेल monolayer के anisotropic व्यवहार की हद तक बदल जाएगा. इसके अतिरिक्त, प्रस्तुत प्रोटोकॉल दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति और संरेखण तक सीमित है. जाहिर है, सही मायने में biomimetic होने के लिए, इंजीनियरिंग हृदय ऊतक 3D होने की आवश्यकता होगी. भविष्य के काम designin के लिए आवश्यक हैजी घने और गठबंधन हृदय ऊतक functional3D. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल, तथापि, हृदय सेल आकारिकी का बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है और नैनो पैमाने cues पर आधारित macroscopic हृदय ऊतक समारोह के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

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    References

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