Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hart-en vaatziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd 1. Cardiale tissue engineering houdt veel belofte om baanbrekende medische ontdekkingen te leveren aan de doelstellingen van het ontwikkelen van functionele weefsels voor cardiale regeneratie evenals in vitro screeningstesten. Toch heeft de mogelijkheid om high-fidelity modellen van hartweefsel te creëren moeilijk gebleken. Het hart van extracellulaire matrix (ECM) is een complexe structuur die bestaat uit zowel biochemische en biomechanische signalen variërend van de micro-tot op de nanometer schaal 2. Lokale mechanische belasting voorwaarden en cel-ECM interacties zijn onlangs erkend als vitale onderdelen van de cardiale tissue engineering 3-5.

Een groot deel van het cardiale ECM bestaat uitgelijnde collageenvezels met nano-schaal diameter die aanzienlijk beïnvloedt weefselarchitectuur en elektromechanische koppeling 2. Helaas, weinig methoden have in staat geweest om de organisatie van ECM vezels na te bootsen naar beneden tot op de nanometer schaal. Recente ontwikkelingen in nanofabricage technieken, echter, hebben het ontwerp en de fabricage van schaalbare steigers die de in vivo structurele en substraat stijfheid signalen van de ECM in het hart 6-9 nabootsen ingeschakeld.

Hier presenteren we de ontwikkeling van twee reproduceerbare, kosteneffectieve en schaalbare nanopatronen werkwijzen voor de functionele aanpassing van hartcellen met het biocompatibele polymeer poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 en een polyurethaan (PU) gebaseerd polymeer. Deze anisotroop nanofabricated substraat (ANF) bootsen de onderliggende ECM goed-georganiseerde, uitgelijnd weefsels en kan worden gebruikt om de rol van nanotopography op celmorfologie en functie 10-14 onderzoeken.

Met behulp van een nanopatterned (NP) silicium meester als een sjabloon, wordt een polyurethaan acrylaat (PUA) mal gefabriceerd. Deze PUA mal wordt vervolgens gebruikt om pattern de PU of PLGA hydrogel via UV-ondersteunde of-oplosmiddel gemedieerde capillaire kracht lithografie (CFL), respectievelijk 15,16. In het kort, PU of PLGA pre-polymeer druppel aangebracht op een glazen dekglaasje en de PUA mal is bovenaan geplaatst. Voor UV-geassisteerde CFL, wordt de PU vervolgens blootgesteld aan UV-straling (λ = 250-400 nm) voor de genezing. Voor oplosmiddel gemedieerde CFL, wordt de PLGA reliëf met warmte (120 ° C) en druk (100 kPa). Na uitharding wordt de PUA mal afgepeld, met achterlating van een ANF's voor celkweek. Primaire cellen, zoals neonatale rat ventriculaire myocyten, alsook menselijke pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten, kan worden gehandhaafd op de ANF 2.

Introduction

Hart-en vaatziekten is de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld en vormen een zware socio-economische last op een reeds gespannen globale gezondheidssysteem 1,17. Cardiale tissue engineering heeft twee verschillende doelen: (1) om beschadigde hartspier te regenereren na ischemische ziekte of cardiomyopathie of (2) een high fidelity model van het hart voor in vitro screening van geneesmiddelen of ziekte modellering creëren.

Het hart is een complex orgaan die voortdurend moeten werken om bloed naar het lichaam. Dicht op elkaar gepakte laminaire structuren van hartspiercellen en ondersteunende weefsels zijn gerangschikt in spiraalvormige patronen in de hartwand 18,19. Het hart is ook elektromechanisch gekoppeld 20 in een sterk gecoördineerde manier om het bloed efficiënt te werpen op het lichaam 21. Verschillende grote hindernissen die moeten worden aangepakt, maar voordat de natuur ingewikkelde ontwerp betrouwbaar kan worden samengevat in vitro.Eerste, hoewel robuuste hartspierceldifferentiatie methoden verder worden ontwikkeld 22 HPSC-CMs vertonen nog vrij onvolwassen fenotypes. Hun elektromechanische eigenschappen en morfologie meest overeenkomen met foetale niveaus 23. Ten tweede, wanneer bewaard in de traditionele cultuur omstandigheden, zowel stamcellen afgeleide en primaire cardiomyocyten niet samenvoegen tot inheemse, weefsel-achtige structuren. Integendeel, cellen willekeurig georiënteerd en niet vertonen de gestreepte staafvormige uiterlijk van volwassen myocard 24.

De extracellulaire matrix (ECM) omgeving waarmee cellen interageren speelt een belangrijke rol in talrijke cellulaire processen 11,13,25. De ECM bestaat uit complexe, goed gedefinieerde moleculaire en topografische signalen die aanzienlijk beïnvloeden de structuur en functie van cellen 6,26. In het hart, cellulaire uitlijning volgt de onderliggende nanometerschaal ECM vezels 2. De impact van deze nanotopographsche signalen op cellen en weefsels functie echter verre van volledig begrepen. Voorstudies van nanometerschaal cel-biomateriaal interactie geven het potentiële belang en de impact van sub-micron topografische aanwijzingen voor celsignalerende 27, adhesie 28-30, groei 31, en ​​differentiatie 32,33. Vanwege de moeilijkheden bij het ​​ontwikkelen reproduceerbare en schaalbare nanofabricated substraten, deze studies konden de meerschalige cellulaire effecten van de in vivo omgeving ECM reproduceren. In dit protocol wordt een eenvoudige en kosteneffectieve nanofabricage techniek om celkweek steigers nabootsen inheemse cardiale ECM vezeluitlijnblok produceren beschreven, waardoor een breed scala van nieuwe onderzoeken van cardiomyocyte-biomateriaal interacties. Begrijpen hoe hartspiercellen interactie met de nanoschaal ECM-omgeving kan zorgen voor de mogelijkheid om cellulaire gedrag te controleren nauwer mimic inheemse weefsel functie. Bovendien celmonolagen zijn een vereenvoudigde experimenteel systeem in vergelijking met 3D-structuren, maar toch vertonen complexe multi-cellulaire gedrag voor inzichtelijke onderzoeken en functionele screening 2,34-36. Tenslotte kunnen dergelijke steigers worden gebruikt om cellulaire transplantaatfunctie verbeteren wanneer geïmplanteerd in het hart voor regeneratieve doeleinden 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 23 ° C), tenzij anders vermeld.

1. Fabricage van Silicon Master

  1. Schoon silicium wafer met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas.
  2. Plaats silicium wafer in spin-coater bij rotatiesnelheden van 2.000-4.000 tpm tot een 0,3-0,5 um dikke film te produceren.
  3. Patroon de fotolaklaag met de juiste afmetingen met behulp van een fotolithografie-systeem
  4. Volledig onderdompelen de gestructureerde fotolak beklede silicium wafers in een geschikt volume van fotoresist ontwikkeloplossing.
  5. Spoel de ontwikkelde-lichtgevoelige laag silicium wafers met gedemineraliseerd water.
  6. Arrays van sub-micron schaal ruggen met bijna verticale zijwanden, diepe reactief ion etsen de blootgestelde silicium met behulp van een ets-systeem vormen.
  7. Verwijder het resterende fotoresist door het plaatsen van de siliciumwafel in een plasma Asher systeem.
  8. Snijd het silicium wafers met een gediamanteerde snijder in de juiste maat siliconen matrijzen voor latere replica gieten.

2. Fabricage van PUA Mold van Silicon Master

OPMERKING: Volume silicium meester worden toegevoegd nanofabricage zal variëren afhankelijk van het gebied van de nanopatterned kapitein ook worden gerepliceerd als de viscositeit van het polyurethaan acrylaat (PUA) oplossing.

  1. Schoon silicium meester oppervlak met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas.
  2. Plaats silicium meester patroon naar boven in een petrischaal.
  3. Voor een silicium master met een 2 cm x 2 cm oppervlak patroon, pipet 40 ul van PUA om het patroon oppervlak.
  4. Leg een vel van 4 cm x 4 cm transparant polyester (PET) folie over de afgegeven PUA.
  5. Druk op de PET-blad en verspreid het PUA onder het vel over de patroon gezicht met behulp van een roller of platte randen oppervlak (zoals een kaart), zodat de helepatroon wordt gedekt door de PUA prepolymeer.
  6. Plaats silicium meester, prepolymeer, en PET ongeveer 10 cm onder een 20 Watt (115 V) UV-licht (λ = 365 nm) gedurende 50 sec. Om effectief te zijn, kan het UV-licht golflengte ergens tussen 310-400 nm. De intensiteit van het licht is 10-15 mW / cm 2 aan het oppervlak van het substraat.
  7. Na uitharding verwijderen PET-folie langzaam met een pincet. PUA moeten hechten aan de PET-film met een negatief van het silicium meester nanopattern.
  8. Cure PUA / PET nanopatronen onder UV gedurende ten minste 12 uur vóór gebruik. Overbelichting is geen probleem.
  9. Om silicium meesters reinigen, plaatst u een andere film van PET op de top van de master zonder de toevoeging van PUA en bloot te stellen aan UV-licht (λ = 365 nm) voor 50 seconden en verwijder PET-folie. Dit zal alle niet-gereageerde monomeren te verwijderen.
  10. Spoel silicium master met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas.

3a. Nanopatronen polyurethaanpolymeer

  • Bereid 25 mm ronde glazen objectglaasjes door in een ozonbehandeling kamer gedurende 10 minuten.
  • Plaats-ozon behandelde glasplaatjes op kleine PDMS blok voor eenvoudig gebruik.
  • Breng dunne laag van het oppervlak adhesiepromotor met penseel te glasplaatjes. Droging glasplaatjes gedurende 30 minuten.
  • Plaats het glaasje op een stuk printerpapier.
  • Drop afzien 10 ul van polyurethaan (PU) pre-polymeer (NOA 76) naar het centrum van glasplaatje. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn na toevoeging.
  • Plaats PUA mal, patroon gezicht naar beneden, op het glaasje. De verspreiding van de PU gelijkmatig over het oppervlak van het glaasje door het werpen van een rubberen cilinder roller langs de PUA mal. Printerpapier zal polymeer overflow absorberen.
  • Watt UV-lamp. Polymerisatietijd van de PU is afhankelijk kracht van UV-bron.
  • Neem het monster uit UV-lichtbron en zorgvuldig verwijderen van de PUA mal van PU gecoat glasplaatje. Polymerisatie van de PU wordt beschouwd complete wanneer de PUA mal schillen netjes weg van het monster en de PU glaasje heeft een iriserende uitstraling.
  • Plaats afgewerkt monsters exsiccator opslag zolang een maand.
  • 3b. Nanopatronen Poly (lactide-co-Glycolide) Hydrogel

    1. Maak een platte PDMS mal door krachtig mengen siliconen elastomeer basis en siliconen elastomeer verharder in een 10:01 verhouding.
    2. Giet gemengde PDMS precursor oplossing in een petrischaal, zodat de PDMS precursor bereikt 5 mm tot de rand van de schaal (dat wil zeggen zodat het PDMS is 5 mm dik).
    3. Plaats petrischaal en PDMS voorloper in een exsiccator gedurende 1 uur te ontgassen.
    4. Beweeg petrischaaltje PDMS precursor in een 65 ° C oven gedurende ten minste 2 uur uitharden.
    5. Na PDMS is uitgehard, gebruik dan een scheermes aan de platte PDMS gesneden in 3 cm x 3 cm vierkante secties. Dit zullen de vlakke PDMS mallen later in de patroonvorming proces gebruikt.
    6. Clean diameter 25 mm ronde glazen dia's door placing in isopropylalcohol gedurende 30 minuten in een water sonicator.
    7. Droog gereinigd glasplaatjes onder O 2 / N 2 gas.
    8. Drop afzien 100 pl PLGA-oplossing (15% w / v PLGA in chloroform) op glasplaatje.
    9. Plaats een plat PDMS mal bovenop de gedoseerde PLGA het oplosmiddel absorberen en een met PLGA vlakke ondergrond. Breng een lichte druk (-10 kPa) door een 200 g gewicht bovenop de PDMS gedurende 5 minuten.
    10. Langzaam afpellen plat PDMS mal en plaats de deksel glas op een voorverwarmde plaat (120 ° C) gedurende 5 minuten om de resterende oplosmiddel te verwijderen en verhogen hechting tussen de PLGA en het dekglas.
    11. Plaats de NP PUA mal bovenop de vlakke PLGA en constante druk (~ 100 kPa) en warmte (120 ° C) toegepast door een 1 kg gewicht bovenop de PUA mal terwijl de verwarmingsplaat gedurende 15 minuten.
    12. Verwijder het gewicht van PLGA dekglaasje en laat het substraat afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder geen PUA schimmel totdat de ondergrond zijn geweestafgekoeld.
    13. Zodra de ondergrond voldoende zijn afgekoeld, voorzichtig afpellen de NP PUA mal, het openbaren van de NP PLGA ondergrond. De NP PLGA ondergrond dient een iriserende uitzien.
    14. Plaats afgewerkt monsters exsiccator opslag zolang een maand.

    4. Cel zaaien en cultuur

    OPMERKING: Dit protocol beschrijft de cultuur van de neonatale rat hartspiercellen (NRVMs) en H7 menselijke embryonale stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hESC-CMS), maar andere mobiele bronnen kunnen worden gebruikt.

    1. Bevestig de ANF's dekglaasjes (PU of PLGA) een 35 mm weefselkweek polystyreen schotel. Pipetteer 20 ul van Norland Optical Adhesive (NOA83H) naar de bodem van de schaal en plaats voorzichtig het ANF dekglaasje bovenop de NOA. Laat de lijm verspreid en bedek hele dekglaasje bodem. Cure NOA door blootstelling aan UV-schotel gedurende 10 minuten.
    2. Steriliseer ANF door spoelen met 2 ml 70% waterige ethanol oplossing gedurende 5 min, tweemaal. Verwijder eThanol door aspiratie. Laat ANF's volledig de lucht drogen voor ~ 1 uur onder de UV-lamp sterilisatie (λ = 200-290 nm) in de biologische veiligheid kabinet.
    3. Cellulaire adhesie wordt versterkt door het bekleden van de ANF's in fibronectine overnachten. Verdunnen fibronectine in DI water tot 5 ug / ml. Pipetteer 2 ml van fibronectine oplossing in de schotel. Plaats in incubator bij 37 ° C en 5% CO2 overnacht (ten minste 6 uur).
    4. Verkrijgen NRVMs, hESC-CMS, of andere cardiale cellen van belang volgens eerdere protocollen 22.
    5. Centrifugeer celmonster bij 1000 rpm gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren.
    6. De bovenstaande vloeistof voorzichtig door aspiratie. Controleer de pellet te verstoren.
    7. Resuspendeer cellen in geschikte kweekmedia tot een concentratie van 4,6 x 10 6 cellen / ml.
    8. Pipet zorgvuldig 200 ul van celsuspensie op gesteriliseerd ANF's. Zorg ervoor celsuspensie blijft op het dekglaasje.
    9. Plaats cellen in de broedstoof bij 37 ° C en 5%CO2 gedurende 4 uur om cellen te hechten aan ANF.
    10. Voeg 2 ml warm voedingsbodems voor te schotelen en te vervangen cellen in incubator onder dezelfde omstandigheden.
    11. Na 24 uur, verwijder media en wassen met 2 ml DPBS tweemaal om overtollige cellen te verwijderen.
    12. Voeg 2 ml warm voedingsbodems voor te schotelen en te vervangen cellen in incubator onder dezelfde omstandigheden. Kweek van de cellen tot confluentie. Vervang de media om de andere dag.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Figuur 1 is een schematisch overzicht van het productieproces voor de twee fabricagemethoden. Door de diffractie van licht door nanoschaal topografie, moet nanopatronen resulteren in een iriserende oppervlak om de ANF. Figuur 2 toont deze iriserende oppervlak een goed gevormde 25 mm NP-PU dekglaasje (Figuur 2A) met 800 nm nok en groef breedte (Figuur 2B). De iriserende uiterlijk van de ANF's zal enigszins variëren, afhankelijk van de nok en groef breedtes.

    Na uitzetten van de cellen op de ANF moeten de cellen beginnen te sluiten in de richting parallel aan de randen van het substraat. Uitlijning moet duidelijk worden binnen de eerste 24 uur na het zaaien en moet voor het geheel van de kweekperiode blijven. Figuur 3 toont vertegenwoordiger helderveld beelden van NRVMs na 7 dagen van cultuur en hESC-CMs na 48 uur van de cultuur. NRVMs eennd hESC-CM's op de NP oppervlakken vertonen duidelijk structurele anisotropie en de uitlijning (figuren 3B en 3D), terwijl hartspiercellen op effen vlakken willekeurig georiënteerd zijn (Figuren 3A en 3C). Immunohistochemische analyse wijst op de impact van de nanotopography op mobiele cytoskelet uitlijning. Actine microvezels (F-actine) en α-actinine sarcomere in cellen gekweekt op de ANF worden uitgelijnd langs de nano-ruggen blijven maar willekeurig verdeeld in cellen op unpatterned substraten (figuur 4). Hartcellen vertonen spontaan kloppende na 24-48 uur van de cultuur.

    Figuur 1
    Figuur 1.   Nanofabricage schematische - diagram van de twee nanofabricage processes. (B - D) Depict UV-geassisteerde capillaire kracht lithografie (CFL), terwijl (E - H) verbeelden-solvent gemedieerde CFL. (A) PUA negatief is gemaakt van een silicium meester. (B) PU pre-polymeer-drop aangebracht op een glasplaatje en de PUA mal is bovenaan geplaatst. (C) A PUA schimmels en PU dekglaasje worden dan blootgesteld aan UV-licht op de PU genezen. (E) PLGA polymeeroplossing neerzetten aangebracht op een glasplaatje en een vlakke PDMS mal wordt gebruikt om een vlak oppervlak te creëren PLGA. (F) Een PUA mal bovenop de platte PLGA wordt gebracht en (G) constante warmte en druk worden toegevoerd aan hot-emboss de NP in de PLGA. (D, H) Na het afpellen van de PUA mal, is een NP-PU of PLGA substraat achtergelaten. Cardiale cellen kunnen vervolgens worden gezaaid op deze NP oppervlak uitgelijnd arrays cellen te creëren.


    Figuur 2. NP-PU substraat. (A) Foto van groot gebied NP oppervlak. De iriserende uiterlijk van het dekglaasje wordt veroorzaakt door de nanotopography. (B) SEM beeld van de dwarsdoorsnede van de onderliggende nanotopography.

    Figuur 3
    Figuur 3. Uitgelijnd hartspiercellen. 10X helderveld beelden van NRVMs na 7 dagen van de cultuur (A, B) en hESC-CMs na 2 dagen van de cultuur (C, D). NRVMs gekweekt op NP-PU substraten (B) vertonen duidelijk structurele afstemming terwijl NRVMs op vlakke PU substraten (A) zijn willekeurig uitgelijnd. Pijlen in (B) en (D) geeft richting NP anisotropie. Schaal bar = 100 micrometer.

    Figuur 4
    .. Figuur 4 Immunofluorescente confocale beeldvorming Cell cytoskelet uitlijning en strepen; α-sarcomerische actinine (rood), celkernen (blauw), en F-actine (groen). Cellen gekweekt op substraten NP hebben α-sarcomerische actinin en F-actine vezels uitgelijnd terwijl cellen gekweekt op een vlakke ondergrond willekeurig hebben georiënteerde vezels. Inzet op rood α-sarcomerische actinine kanaal duidelijk gegroefde sarcomeres.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Functioneel volwassen hartweefsel ontbreken zowel in vivo als in vitro toepassingen van cardiale tissue engineering. De CFL nanofabricage hier beschreven methoden zijn robuust technieken voor het bereiken van cellulaire aanpassing en beïnvloeding macroscopische weefselfunctie vanwege de schaalbaarheid van het systeem. Grote gebieden kunnen gemakkelijk worden gevormd en gebruikt voor celkweek. Macroscopische cellulaire uitlijning is belangrijk in hartweefsel techniek om biomimetische, functionele weefsel beïnvloedt de mechanische en elektrische eigenschappen van het myocardium 38 te creëren.

    Hier De werkwijzen kunnen worden toegepast op een breed scala van toepassingen in hartweefsel engineering. Eerder is aangetoond dat nanoschaal signalen helpen om een cardiale stamcelniche en het bevorderen regeneratie 14. Dus door gebruik van biologisch afbreekbare polymeren zoals PLGA, nanopatterned "pleisters" kan worden voor het bevorderengenezing na cardiale belediging. Als alternatief, door het gebruik van hydrogelen met gelijkaardige elasticiteitsmoduli als de inheemse hart, cardiomyocyte-ECM interacties kan worden bestudeerd in een vereenvoudigde, reproduceerbaar systeem.

    Verschillende andere werkwijzen, zoals microcontact afdrukken electrospinning en microtopografie, zijn eerder gebruikt om de structuur van gemanipuleerde hartweefsel op microschaal 39-41 besturen. Hoewel deze technieken succesvol in het verkrijgen van cellulaire aanpassing bewezen, is het waarschijnlijk dat de structuur en functie van in vivo hartweefsel wordt bepaald door de veel kleinere, nanotopographical signalen van de ECM en aldus onze NP ondergrond moet voordelig blijken. Bovendien, deze microscopische patronen technieken inherente nadelen in vergelijking met onze anisotropisch nanofabricated substraten. Bijvoorbeeld, onze nanopatronen methode is meer kosteneffectief en beheersbaar dan elektrospinproces. Microcontact afdrukken, anderzijds, relies op cellen vast te houden aan speciale doorgangen voor structurele anisotropie krijgen. Om een ​​functionele monolaag maken dient cellen vervolgens prolifereren en migreren deze rijstroken tight junctions vormen. Dit is veel moeilijker voor cellen met weinig tot geen proliferatieve capaciteit zoals neonatale cardiomyocyten. Microtopografie wordt ook beperkt door het onvermogen strak gekoppelde cel monolagen maken. Vanwege de omvang van de cellen in vergelijking met de microtopografie, cellen verblijven op of in de microridges. Dit beperkt de hoeveelheid cel-cel interacties en cel-cel verlaagt koppeling. Bij onze werkwijze cellen uitgelijnd via de bioinspired nanoschaal topografie en kan vrij communiceren met naburige cellen als functie maten zijn ten minste een orde van grootte kleiner dan de cellen zelf. Dit zorgt voor meer biomimetic, nauw verbonden cellen monolagen worden gecreëerd.

    Voor optimale resultaten met de NP-PU raden we na de glass dekglaasje voorbehandelingsstappen. Deze stappen zullen polymeer hechting verhogen het glasoppervlak. Dit zal niet alleen steun in de schone verwijdering van de PUA meester tijdens de fabricage maar ook voorkomen dat het gevormde polymeer uit los uit het glas tijdens de experimenten. Om de effectiviteit van de voorbehandelingsstappen testen plaats een NP-PU substraat in water en kijk of het polymeer blijft gehecht aan het glas.

    PLGA is een co-polymeer van glycolzuur en melkzuur, dat is ontwikkeld voor zowel de inrichting en drug delivery in vivo. Dus dit substraat een goede, biocompatibel ECM voor de cellen. De stijfheid van PLGA kan worden gemoduleerd door ofwel afstemmen van de verhouding van glycolzuur tot melkzuur of door het veranderen van de samentrekking van PLGA in chloroform.

    Verschillende parameters kunnen gemakkelijk worden gevarieerd en aangepast dit systeem te optimaliseren of onderzoeksdoeleinden. Verschillende PU-gebaseerde polymeren zijn verkrijgbaar met een breed scala aanmechanische eigenschappen. Aldus door verschillende PU prepolymeren kunnen verschillende rigide substraat worden vervaardigd door hetzelfde protocol. De gebruiker kan ook veranderen het substraat topografie. De nanotopography van het substraat afhankelijk van de uitvoering van het silicium meester. Daarom diverse nok en groef breedtes, evenals verschillende geometrieën, kunnen worden gevormd door het veranderen van het silicium meester ontwerp specificaties.

    De grootte van de nano-ruggen beïnvloedt ook de cellen en weefsels gedrag. Kleinere groefbreedtes zorgen voor minder mobiele penetratie in de groeven en beperken de interactie van de cel met de techniek nanotopography 2. Dit op zijn beurt verandert de mate van anisotropie van de cardiale cel monolaag. Bovendien is de voorgestelde protocol beperkt tot tweedimensionale (2D) celkweek en uitlijning. Uiteraard echt biomimetische, zou techniek hartweefsel moeten 3D zijn. Toekomstige werkzaamheden is nodig voor designing dichte en uitgelijnd functional3D hartweefsel. De hier gepresenteerde protocol biedt echter superieure controle van cardiale celmorfologie en maakt de besturing van macroscopische hartweefsel functie gebaseerd op nanoschaal signalen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics