Super-oppløsning Imaging av Bakteriell divisjon Machinery

Published 1/21/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver en super-oppløsning avbildningsmetode å sondere strukturelle organisering av den bakterielle FtsZ-ringen, en essensiell apparat for celledeling. Denne metoden er basert på kvantitative analyser av photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) bilder og kan brukes til andre bakterielle cytoskeletal proteiner.

Cite this Article

Copy Citation

Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriell celledeling krever koordinert montering av mer enn ti viktige proteiner på midcell 1,2. Sentralt i denne prosessen er dannelsen av en ring-lignende suprastructure (Z-ringen) av FtsZ protein ved divisjonen planen 3,4. Z-ringen består av flere enkelt-trådede FtsZ protofilamenter, og forstå arrangementet av protofilamenter inni Z-ringen vil gi innsikt i mekanismen av Z-ringen montering og dets funksjon som en kraft generator 5,6. Denne informasjonen har vært unnvikende på grunn av gjeldende begrensninger i konvensjonell fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konvensjonell fluorescensmikroskopi er stand til å gi et bilde med høy oppløsning av Z-ringen på grunn av diffraksjon grensen av lys (~ 200 nm). Elektron cryotomographic bildebehandling har oppdaget spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler 7, men er vanskelig å anvende på større celler somE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelse av en super-oppløsning fluorescensmikroskopi metoden, Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) kvantitativt karakterisere strukturelle organisering av E. coli Z-ring 8.

PALM bildebehandling tilbyr både høy romlig oppløsning (~ 35 nm) og spesifikk merking for å aktivere entydig identifisering av mål proteiner. Vi merket FtsZ med photoactivatable fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grønt fluorescens (eksitasjon = 488 nm) til rødt fluorescens (eksitasjon = 561 nm) ved aktivering ved 405 nm 9. Under en PALM eksperiment, er enkle FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktivert og de tilsvarende Tyngdepunktet posisjonene til de enkle molekyler er bestemt med <20 nm presisjon. En super-oppløsning av Z-ringen blir deretter rekonstruert av superimposing sentroiden posisjonene alle oppdagede FtsZ-mEos2 molekyler.

<p class = "jove_content"> Ved hjelp av denne metoden, har vi funnet at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm, og er sammensatt av en løs samling av FtsZ protofilamenter som overlapper med hverandre i tre dimensjoner. Disse dataene gir et utgangspunkt for videre undersøkelser av cellesyklusen avhengige endringer av Z-ringen 10 og kan anvendes for andre proteiner av interesse.

Protocol

1. Prøvepreparering

  1. Inokuler LB media med en enkelt koloni av stamme JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Vokse over natten i en shaker ved 37 ° C.
  2. Fortynne kulturen 1:1.000 inn M9 + minimal media [M9 salter, 0,4% glukose, 2 mM MgSo4, 0,1 mm 2 CaCl, MEM aminosyrer og vitaminer] og vokse til midten log fase (OD 600 = 0,2 til 0,3) i nærvær av kloramfenikol (150 ug / ml) ved romtemperatur (RT).
  3. Fremkall kultur med 20 mikrometer IPTG i 2 timer (se note 1).
  4. Pellet kultur i mikrosentrifuge (8000 rpm, 1 min) og resuspender i et likt volum av M9 +; gjenta. Etter den andre resuspensjon, fortsette veksten ved RT i 2 timer.
  5. Fix indusert kultur med 4% paraformaldehyd i PBS (pH = 7,4) ved RT i 40 min. Pellet kultur og resuspender i et like stort volum PBS; gjenta. Hvis bildebehandling levende celler, hopper fiksering, pellet kultur, og resuspender med tilsvarende volumav M9 - [M9 salter, 0,4% glukose, 2 mm 4 MgSO, 0,1 mM CaCl 2, MEM aminosyrer], gjenta.
  6. Fortynne gull perler 01:10 med resuspenderte kultur. Påfør prøven til forberedt bildebehandling kammer (se trinn 2.4).

[1] Merk: Ovennevnte induksjon protokollen (trinn 1.1 til 1.3) har blitt optimalisert for uttrykket system av belastning JB281. Detaljerte induksjon forholdene kan variere for andre ekspresjonssystemer eller proteiner av interesse.

2. Montering av Imaging Chamber

  1. Lage en 3% (w / v) agarose-løsning i M9 -. Smelt agarose ved 70 ° C i en benk-top varme blokk for 40 min. Butikk smeltet agarose ved 50 ° C i opp til 5 timer.
  2. Plasser en ren microaqueduct lysbilde i øvre halvdel av bildebehandling kammer med elektroder vendt nedover. Juster den nedre pakning på microaqueduct lysbilde slik som å dekke perfusjon kanaler.
  3. Påfør ~ 50 pl av den smeltede agarose til midten av glassetlysbilde. Umiddelbart topper agarose gel dråpene med en ren, tørr dekkglass. La gelen stivne ved RT i 30 min.
    1. Slik rengjør du dekkglass: arrangere dekkglass i et keramisk holder og sonicate for 20 min i roterende bad av aceton, etanol og 1M KOH i glasskrukker. Gjentagelsessyklus tre ganger, for totalt 9 sonications, etterfulgt av en enkelt sonikering i dH 2 O. Oppbevar de rensede dekkglass i frisk dH 2 O. Før bruk, blåse tørr dekkglass med filtrert luft.
  4. Fjern forsiktig dekkglass, forlater gel pad på microaqueduct lysbildet. Umiddelbart tilsett 1 pl cellekultur prøve (se trinn 1.6) til toppen av gelen puten. Vent på ~ 2 min, slik løsning som skal absorberes av gel pad. Top gel pad med en ny ren og tørr dekkglass. Samle hele bildebehandling kammeret i henhold til produsentens instruksjoner.

3. Image Acquisition

  1. Slå på mikroskopet, kamera og lasere. Åpne MetaMorph mykware (Molecular Devices).
  2. Plasser egnede eksitasjon / utslipp filtre i bildebehandling banen (figur 1).
  3. Still laser krefter og oppkjøp innstillingene deretter.
    1. 488-nm laser = 15 mW (se Note # 2)
    2. 561-nm laser = 75 mW
    3. 405-nm laser = 2 mW ± nøytral tetthet filter (Se note 3)
  4. Lås bildebehandling kammer i scenen via utfyllende scenen adapter.
  5. Utpeke et egnet bildediagnostikk region (100x100 piksler) som er homogent opplyst av alle tre lasere.
  6. Identifisere en prøve område som inneholder både celler og fiducial markører (gull perler) i umiddelbar nærhet, men ikke overlappende.
  7. Fokus på overflaten av cellene nærmest dekkglasset. Kjøpe en lysfelt bilde med 50 ms integrasjon tid og flytte fokus 0,5 mikrometer i prøven (figur 3Ai).
  8. Erverve ensemble grønn fluorescens bilde med eksitasjon fra 488-n m laser bruker en 50 ms integrasjon tid (figur 3Aii).
  9. Erverve streaming video i rødt kanal med kontinuerlig belysning fra 405-nm og 561 nm-lasere. For faste celler, er en 50 ms bildefrekvens brukes for totalt 20.000 rammer (~ 17 min totalt) med den 405-nm laser makt ramped etter ~ 10% av 1000 rammer (se Note # 4). For levende celler, er en 10 ms bildefrekvens brukes for totalt 3000 rammer (~ 30 s totalt) ved konstant 405-nm laser makt.
  10. Flytt fokuset tilbake til den nedre overflaten av cellene og tilegne annen lysfelt bilde som i trinn 3.7.

[2] Merk: Den integrerte intensiteten av den grønne fluorescensen av en celle er direkte proporsjonal med det totale antall FtsZ-mEos2 molekyler uttrykt i cellen. Den 488-nm magnetiseringseffekten og ensemble fluorescens kjøp innstillinger bør holdes konstant for alle cellene slik at den relative FtsZ-mEos2 uttrykk nivåer i ulike celler kan sammenlignes.

ontent "> [3] Merk:. Faste celler avbildet med Nøytralfilter (ND) filter (Figur 1, optisk komponent nr. ​​5) på plass for å oppnå en langsom aktivering hastighet slik at hver enkelt molekyl kan nøyaktig identifisert The ND filteret fjernes når imaging leve celler for å øke aktiveringen rate, og samtidig opprettholde en lav sannsynlighet for to molekyler blir aktivert samtidig i en diffraksjon-avgrenset område. Jo raskere satsen å leve-celle bildebehandling trengs for å redusere den totale registreringstid, derved "frysing" Z-ringen i tid og begrense virkningen av photodamage til cellen.

[4] Merk: Tallene rammer anskaffet ble optimalisert for vårt system og er avhengig av den spesielle cellestruktur, merking tetthet, aktivisering rate og hvorvidt utmattende hele pool av fluoroforer er viktig for analyse. I levende celler, er det viktig å få et tilstrekkelig antall lokaliseringene i så kort periode TImeg som mulig å unngå de uskarphet i bildet på grunn av bevegelse av den cellulære struktur.

4. PALM Bilde Anlegg

  1. Bestem centroid posisjonen for hver detektert spot.
    1. Laste bildestakk inn Matlab (MathWorks, Inc).
    2. Beskjære bildet stabelen i en region rundt en celle som utelukker alle fiducial perler.
    3. Velg en intensitet terskelen for spot deteksjon som er over bakgrunnsnivået, men under gjennomsnittlig spotpris intensitet. Vi står for variasjonen i bakgrunnen nivået gjennom et eksperiment ved å beregne løpende gjennomsnitt av maksimal intensitet ved hjelp av en 150 ramme vinduet. Intensiteten terskelen for hver ramme blir deretter interpolert fra de løpende gjennomsnittsverdiene.
    4. Subtrahere de respektive terskelen fra hver ramme. Potensielle flekker er identifisert som tre tilstøtende piksler med intensitet over terskel.
    5. Monter fluorescensintensiteten av hver potensielle sted til en todimensjonal Gaussian-funksjonen [Formel # 1] med en ikke-lineær minste kvadraters algoritme (figur 2). Lokaliseringen presisjon av hver flekk blir beregnet med det totale antallet detekterte fotoner [Formel # 2]. Enhver dårlig passform spot med en lokalisering presisjon større enn 20 nm (faste celler) eller 45 nm (levende celler) er forkastet (se Note # 5). Hvilkensomhelst flekk med en intensitet større enn to ganger av den midlere intensitet, muligens på grunn av overlappende emittere, er også kastes.
    6. For faste celler, fjerne gjentatte observasjoner av samme molekyl disregarding enhver flekk hvis sentroide posisjon er innenfor 45 nm av noe annet sted som gikk forut for den med 6 rammer eller mindre. For levende celler, alle flekker beholdt.
  2. Kalibrere prøven drift ved hjelp fiducial markør bevegelse.
    1. Beskjære ut et 10x10 pixel regionen rundt en fiducial markør.
    2. Trekk fra de respektive terskelen fastsatt i 4.1.3 fra hver ramme.
    3. Monter intensitet profilen i hverrammen via minst firkantfeste algoritme forutsatt en todimensjonal Gaussisk form.
    4. Beregn forskyvning mellom Tyngdepunktet posisjoner i forhold til rammen 1.
  3. Korriger sentroiden posisjonen hvert unike molekyl identifisert i 4,1 med riktig prøven drift beregnet i 4.2. Sammenligne lysfeltobjektiver bildene som ble kjøpt i 3,7 og 3,10. Hvis celler er observert å bevege seg i forhold til de fiducial markører, blir dataene kastet ut.
  4. Overlagre alle korrigerte Tyngdepunktet posisjoner på et enkelt bilde sammensatt av 15x15 nm piksler. Plott hvert unike molekyl som en enhet-område, todimensjonal Gaussisk profil sentrert ved sentroiden posisjon med et standardavvik lik lokalisering presisjon [Formel # 2]. Dette resulterer i en sannsynlighetstetthet kart, hvor en piksel intensitet er proporsjonal med sannsynligheten for å finne et molekyl i at pixel (figur 3Aiv).
  5. Sammenligning PALM bilder til ensemble bilder.
    1. Replot centroid posisjoner som i 4.4, men på et fly med 150x150 nm piksler og et standardavvik lik 250 nm. Dette genererer en PALM bilde som etterligner en diffraksjon-begrenset bilde, som kan brukes til å sammenligne med diffraksjon-begrenset, ensemble bilde kjøpt i 3,8 (figur 3Aiii).
    2. For å bekrefte at de oppdaget molekyler er representative for hele befolkningen, sammenligne den rekonstruerte ensemble bilde (Figur 3Aiii, trinn 4.5.1) med den eksperimentelle ensemble fluorescens bilde (Figur 3Aii, trinn 3.8) for å bekrefte at begge bildene viser strukturer av lignende form , orientering og relativ intensitet.

[5] Merk: minstekravet lokalisering presisjon ble bestemt empirisk for hver avbildningsmetode ved å plotte presiseringer av alle molekyler for en gitt prøve, og å velge en passende cutoff.

5. PALM Bildeanalyse

  1. Måling Z-Ring Width og diameter.
    1. Roter PALM bildet slik vertikalt orientere den lange aksen av cellen (figur 4A).
    2. Beskjære ut cellenivå regionen inneholdende Z-ringen.
    3. Beregne den kumulative intensitet ved å projisere en intensitet profil langs cellens lengdeakse.
    4. Monter intensitet profilen til en Gaussian distribusjon. Ringen Bredden defineres som den fulle bredde halv maksimum (FWHM) på det monterte gaussisk fordeling (fig. 4B).
    5. Projisere kumulative intensitet profilen 5.1.2 langs cellens kort akse. Ringen diameteren er definert som hele lengden av intensiteten profilen (figur 4C).
  2. Plotte FtsZ Tetthet (se note 6).
    1. Replot sentroiden posisjonene som i (4.4), men uten et gauss profilen slik at hver unike molekyl er gitt en verdi på 1 og tilordnet en enkelt piksel tilsvarer sin Tyngdepunktet posisjon. På denne måten, intensiteten av hverpiksel representerer det totale antall molekyler som oppdages i den piksel. Tettheten PALM bildet kan også visualiseres som en kontur plott (figur 5E).
  3. Bestemme romlig oppløsning.
    1. Teoretisk-oppnåelig romlig oppløsning: opprette en representant PSF for hele utvalget med gjennomsnittlig bestemt lokalisering presisjon av alle etterforskede molekyler og beregne FWHM (Equation # 3).
    2. Eksperimentelt oppnådd romlig oppløsning: beregne gjennomsnittlig forskyvning mellom gjentatte observasjoner av det samme molekylet.

[6] Merk: Vi brukte total innvendig refleksjon PALM (TIR-PALM, figur 1 og 5) for å begrense aktiveringen og eksitasjon til et tynt lag (~ 200 nm) over cellen / glass-grensesnittet. slik at bare FtsZ molekyler forbundet med membranen nærmest dekkglasset vil bli oppdaget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Illustrert i fig 3Aiv er en to-dimensjonal, super-oppløsning gjengivelse av Z-ringen som genereres fra PALM avbildningsmetode beskrevet ovenfor. Nedenfor oppsummerer vi kvalitativ og kvantitativ informasjon som kan hentes fra dem.

Kvalitativt, observerte vi at Z-ringen er en uregelmessig struktur som vedtar flere konfigurasjoner (enkelt band eller spiralformede bue) som ikke kan skilles i konvensjonelle fluorescens bilder (sammenlign figur 3A-Dii og iv). Observasjoner som disse kan brukes til å bestemme den prosent av cellepopulasjonen som viser en spesiell strukturell konfigurasjon.

Vi kan også kvantitativt måle dimensjonene Z-ringen. Vår tilnærming for å bestemme ringbredde og diameter er beskrevet i trinn 5.1 og illustrert i figur 4.. Fra figur 4B var ringbredde Determined å være 113 nm (FWHM). Denne verdien er bredere enn den forventet bredden av et enkelt FtsZ protofilament (5-10 nm basert på in vitro EM 11). I Figur 4C, er ringen diameteren målt som 1050 nm. Denne diameter kan brukes til å beskrive kvantitativt graden av innsnevring under celledeling.

Annen kvantitativ tilnærming er å beregne molekyl tetthet ved å telle antallet molekyler lokalisert innenfor et definert område. Tettheten målingen gir informasjon om hvor tett molekyler er pakket i strukturen. Molecule tetthet kan beskrives i både relative og absolutte termer. Relativ tetthet (f.eks fraksjon av molekyler i Z-ringen g. hele cellen) gir informasjon om fordelingen av molekyler i forskjellige cellulære regioner. Absolutte densitetsmåling kompliseres av det faktum at PALM bildet (figur 3Aiv) er faktisk en 2D-projeksjonav et 3D-objekt. For å omgå denne komplikasjonen, ansetter vi TIR-PALM, noe som begrenser deteksjon flyet til en enkelt side av Z-ring. De resulterende data er vist i figur 5E. Siden de plottede molekyler representerer et delsett av den totale FtsZ befolkningen, er tettheten bestemmes en nedre grense av den faktiske tetthet. Maksimal tetthet observert i TIR bilder av Z-ring tyder på at noen punkter inneholder overlappende protofilamenter 10.

Figur 1
Figur 1. En forenklet skjematisk av vår mikroskop oppsett. Alle tre lasere styres av en tilpasset bildebehandlingsprogrammet utviklet i MetaMorph som muliggjør nøyaktig kontroll over den aktuelle eksitasjonsbølgelengde. Den mørke grå linjen viser excitation lysvei, mens den lysegrå linje angir utslipp banen. For total innvendig Reflection (TIR) ​​mikroskopi, er det justerbare plattformen oversatte vinkelrett lysbanen for å forandre hendelsen vinkel.

Figur 2
Figur 2. Et sammendrag av PALM metoden. I utgangspunktet alle FtsZ-mEos2 molekyler er på den grønne fluorescens tilstand. Ved eksponering for kontinuerlig belysning ved 405 og 561 lasere, er enkle molekyler stokastisk konvertert til den røde fluorescens tilstand. Frekvensen av denne prosessen bestemmes av kraften av 405 laser, mens photobleaching rate bestemmes av kraften av både 405 og 561 laser. Ideelt, er frekvensen av aktivering og fotobleking balansert på en slik måte at bare ett molekyl oppdages per ramme. Når et tilstrekkelig antall rammer anskaffes, blir bildene behandlet i Matlab ved å montere hver identifisert sted som beskrevet i trinn 4.1. Hver Unique molekylet blir deretter plottet (trinn 4.4) på ​​et enkelt plan, og dermed generere en PALM bildet, vist her i pseudo-rød farge. Rammen skissert i rødt ble bestemt å inneholde en gjenta flekk fra det samme molekylet som foregående ramme og ble derfor ikke inkludert under byggingen av PALM bildet.

Figur 3
Figur 3. Representative bilder av faste (A og B) og levende (C og D) celler som uttrykker FtsZ-mEos2. For alle cellene, kan omrisset og generelle form bli visualisert i lysfelt bilde (I). Ensemble fluorescence bilder (ii) er anskaffet med magnetisering fra 488 laser (trinn 3.8) og representerer fordelingen av hele bassenget av FtsZ-mEos2. Ensemblet image rekonstruert fra PALM data (iii, trinn 5.4) gir en kvalitativ sjekk for metodens trofasterepresentasjon av den sanne ensemblet strukturen. Den genererte PALM bilde (iv) er summering av alle unike FtsZ-mEos2 lokaliseringer og representerer en sannsynlighetstetthet kart for FtsZ-mEos2. Cellen omrisset er representert ved den stiplede linje i gule bilder III og IV. Celler A og C viser FtsZ i et enkelt bånd konformasjon, mens cellene B og D illustrerer FtsZ adoptere en spiralformede lysbue konformasjon, som ikke påvises i diffraksjon-begrenset ensemble bilde (iii). Scale barer, 500 nm.

Figur 4
Figur 4. A. En PALM bilde som viser skjematiske fremstillinger av Z-ringbredde (rød) og Z-ringen diameter (grønn). B. ringbredde beregnes ved å montere det projiserte intensitet profilen (blått Xs) langs den lange aksen av cellen med en Gaussian funksjonen (gray-linjen) og deretter bestemme FWHM (rød stiplet linje). Her ble ringbredde bestemt til å være 113 nm. C. Ring diameteren bestemmes av første projisere intensiteten profilen langs den korte akse av cellen og deretter beregne den fulle lengde (grønn stiplet linje) av intensiteten profilen over null. Diameteren på Z-ringen ble bestemt til å være 1050 nm.

Figur 5
Figur 5. TIR-PALM tillater nøyaktig telling av molekyler. Som i figur 3, er de lysfelt bilde (A), ensemble fluorescens bilde (B), rekonstruerte ensemble fluorescens bilde (C) og PALM bilde (D) vist for en gitt celle uttrykker FtsZ-mEos2. De samme dataene brukes til å konstruere D plottes på nytt som en kontur plott av molekylet density (molekyler per piksel) i E. Fra dette tetthet analyse, ble FtsZ-mEos2 fast bestemt på å være maksimalt til stede på 8 molekyler per piksel. Fordi en enkelt lag av FtsZ protofilamenter ville resultere i en maksimal tetthet av 5 molekyler per piksel 10, denne analysen tyder på at Z-ring består av flere lag med FtsZ protofilamenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PALM bildene inneholder informasjon om molekyl teller og stillinger innenfor en celle, slik at detaljert analyse av fordelingen og arrangement av target proteinmolekyler som er vanskelig å oppnå på annen måte. Nedenfor skisserer vi forholdsregler som bør tas for å trekke nøyaktig kvantitativ informasjon og samtidig opprettholde det biologiske relevansen av PALM bilder. Vi har også utforske informasjon som kan være best oppnås ved hjelp av levende vs fast celler. Endelig foreslår vi veier for å skaffe ekstra super-oppløsning informasjon om celledeling maskiner.

Den ovenfor beskrevne metode ble optimalisert for å gi nøyaktige PALM bilder med følgende måter. Først, karakterisert vi og optimalisert funksjonaliteten fusjonsproteinet for å sikre at den virker som en pålitelig markør for Z-ringstrukturen 10. Sekund, vi finjustert uttrykk for fusjonsproteinet siden både over-og under-uttrykk resultateri avvikende struktur formasjon 10,12,13. Tredje, valgte vi terskler for unike molekyl bestemmelse (trinn 4.1.5) basert på fluoroforen photoblinking egenskaper 14. Photoblinking kompliserer fastsettelse av unike molekyler og ved neglisjering, fører til overcounting av enkle molekyler. Selv overcounting ikke påvirker dimensjon målinger, ikke forsterke den absolutte tetthet målinger og kan skape inntrykk av falske klynger. Alle disse faktorene bør vurderes nøye når du søker denne metoden til andre proteiner av interesse.

Valget av levende eller faste celler for avbildning avhenger av den ønskede informasjon og gjennomstrømning. Live-cell imaging er raske (30 s), men bare rapporter om localizable (dvs. saktegående) molekyler. Dette betyr vanligvis at bare membran-assosiert molekyler er observert i levende celler, mens faste celler gir informasjon om alle merket molekyler. Live-cell imaging provides høyoppløselige strukturelle dimensjoner og morfologi, men kan ikke gi nøyaktige molekyl tetthet målinger på grunn av bevegelsene til molekyler. Faste celle bilder kan gi all denne informasjonen, men krever lite UV aktivering nivå slik at unike molekyler kan identifiseres. Dette fører til utvidet avbildning ganger (> 15 min). I tillegg kan fiksering forårsake strukturelle avvik. Alle disse faktorene bør være balansert når du velger hvilken prøve som skal brukes.

PALM metoden vi har beskrevet gir super-oppløsning detaljer om Z-ring struktur som kan sammenlignes på tvers av ulike stammer, celle-syklus stater, og oppvekstforhold. Implementering av nye teknologiske fremskritt kan gi bedre innsikt i cytokinetic mekanismen av Z-ring. For eksempel, å innføre astigmatisme i deteksjon sti er den enkleste måten å legge tredimensjonale evne (~ 100 nm z-oppløsning) til den optiske setup illustvurdert i figur 1 15. Også, samtidig avbildning av to eller flere proteiner på samme tid er blitt et realistisk alternativ med raske fremveksten av spektralt-distinkte photoactivatable fluorescerende proteiner. Endelig ville utvikling av en fluorescerende protein som photoactivates i en UV-uavhengig måte tillate langvarig overvåking av en enkelt celle uten å generere DNA skade indusert av 405 nm lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Grant: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 x MEM Amino Acids Sigma M5550
100 x MEM Vitamins Sigma M6895
IPTG Mediatech 46-102-RF
16% Paraformaldehyde Electron Micrsocopy Sciences 15710-S
SeaPlaque GTG Agarose Lonzo 50111
50 nm Gold Beads Microspheres-Nanospheres 790113-010
FCS2 Imaging Chamber Bioptechs
Stage Adaptor ASI I-3017
Inverted Microscope Olympus IX71
1.45 NA, 60x Objective Olympus
IXON EMCCD Camera Andor Technology DU897E
488-nm Sapphire Laser Coherent
561-nm Sapphire Laser Coherent
405-nm CUBE Laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
  2. de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
  3. Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
  4. Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
  5. Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
  6. Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
  7. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  10. Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. (2010).
  11. Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. (2007).
  12. Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
  13. Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
  14. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats