Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Vi beskriver en live-cell imaging metode som gir innsikt i protein dynamikk i T-celle aktivering prosess. Vi viser den kombinerte bruk av T-celle spredning assay konfokal mikroskopi og bildeanalyse for å gi kvantitative resultater å følge signalering kompleksdannelse gjennom T-celle-aktivering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beskyttelse mot smittsomme sykdommer er mediert av immunsystemet 1,2. T-lymfocytter er master koordinatorene for immunforsvaret, regulere aktivering og svar av flere immunceller 3,4. T-celle aktivering er avhengig av at gjenkjennelse av spesifikke antigener som vises av antigen-presenterende celler (APCer). Den T-celle antigen-reseptor (TCR) er spesifikk for hver T-celle-klon, og bestemmer antigenspesifisitet 5.. Bindingen av TCR til antigenet induserer fosforylering av komponentene i komplekset TCR. For å fremme T-celleaktivering, må dette signalet bli omformet fra membranen til cytoplasma og kjernen, initiere en rekke viktige reaksjoner som rekruttering av signaler proteiner til TCR; APC stedet (immun synapse), deres molekylære aktivering, cytoskeletal omorganisering, heving av intracellulær kalsium konsentrasjon, og endringer i genuttrykk 6,7. Riktig iitiation og opphør av aktivering av signalene er avgjørende for riktig T-celle responser. Aktiviteten av signaler proteiner er avhengig av dannelsen og opphør av protein-protein interaksjoner, poste translasjonelle modifikasjoner som protein-fosforylering, dannelse av proteinkomplekser, protein ubiquitylation og rekruttering av proteiner til forskjellige cellulært 8. Forstå det interne driften av T-celle aktivering prosessen er avgjørende for både immunologisk forskning og kliniske applikasjoner.

Ulike analyser har blitt utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner, men gjør biokjemiske analyser, slik som det mye brukte co-immunoutfelling metode, ikke tillate protein å plassering skjelnes, og dermed utelukker observasjon av verdifull innsikt i dynamikken i cellulære mekanismer. I tillegg er disse bulk analyser vanligvis kombinere proteiner fra mange forskjellige celler som kan være på ulike stadier av than undersøkte cellulær prosess. Dette kan ha en ødeleggende effekt på tidsmessig oppløsning. Bruken av sanntids avbildning av levende celler som tillater både romlig sporing av proteiner og evnen til å skille mellom timelig signaleringshendelser, og dermed belyse dynamikken i prosessen 9,10. Vi beskriver her en fremgangsmåte for sanntids avbildning av signalering-kompleksdannelse under T-celle-aktivering. Primære T-celler eller T-cellelinjer, slik som Jurkat, er transfektert med plasmider som koder for proteiner av interesse fusjonert til monomere fluorescerende proteiner, hindrer ufysiologisk oligomerisering 11.. Levende T-celler blir sluppet over et dekkglass forbelagt med T-celle-aktiverende antistoff 8,9, som binder seg til komplekset CD3/TCR, indusere T-celle-aktivering mens overvinne behovet for spesifikke antigener aktiveringsreagenser. Aktiverte celler er konstant avbildes ved bruk av konfokal mikroskopi. Imaging dataene blir analysert for å gi kvantitative resultater, slik som det colocalization koeffisient av de signaler proteiner.

Protocol

En. T-celle Transfeksjon

  1. Klargjør aktivert Amaxa Nucleofector løsning ved å blande settets "tillegg" løsning på Nucleofector Solution. Den aktiverte oppløsningen kan lagres ved 4 ° C i opp til tre måneder.
  2. Dyrk Jurkat T-celler i kulturmedium [10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin-løsning, og 2 mM L-glutamin i RPMI]. Optimalt bør celler anvendes 1-2 uker etter tining. Ved hjelp av cellekulturer i logaritmisk vekst er avgjørende for høy transfeksjon effektivitet og celle overlevelse. Alternativt kan, med små modifikasjoner, kan denne protokollen benyttes med primære T-celler, som tidligere beskrevet 8.. Det bør understrekes at når varigheten av aktiveringen av primære T-celler er lengre enn den av Jurkat T-celler (~ 30 min), montert et mikroskop trinns inkubering skal benyttes for å opprettholde CO 2, fuktighet og temperatur i hele aktiveringsprosessen.
  3. Samle 5X 10 6 log-fase T-celler pr transfeksjon inn i et 15-ml tube.
  4. Sentrifuger cellene i 7 minutter ved 400 x g ved romtemperatur.
  5. Under sentrifugering, utarbeide en 6-brønn plate. Fyll en brønn for hver transfeksjon med 5 ml kulturmedium, og pre-inkuberes ved 37 ° C.
  6. Samle rørene fra sentrifugen og kast supernatanten. Cellepelleten suspenderes i 1 ml RPMI.
  7. Sentrifuger cellene i 7 minutter ved 400 x g ved romtemperatur.
  8. Under sentrifugering, forberede transfeksjon løsning. I én brønn av en 96-brønns plate, blande aktivert 100/il Amaxa Nucleofector oppløsning fremstilt i trinn 1 med 5 ug DNA av plasmidet av interesse som koder et fluorescensmerket kodet protein. Optimalt bør DNA-konsentrasjonen være større enn 1 ug / ml, for å unngå fortynning av oppløsningen transfeksjon.
  9. Bland godt ved forsiktig pipettering.
  10. Etter sentrifugering av cellene, fjerner all supernatanten mens ikke disturbing pelleten.
  11. Pipetter DNA / transfeksjon løsning to ganger.
  12. Tilsett DNA / transfeksjon løsning på pelleten.
  13. Overfør cellene til Amaxa kyvetten.
  14. Sett kyvetten inn i Amaxa Nucleofector enheten.
  15. Bruk H-10 Amaxa transfeksjon setting for elektroporering (for Jurkat) eller T-23 (for primære T-celler).
  16. Fjern 6-brønns plate fra inkubatoren.
  17. Etter elektroporering, omhyggelig Overfør supernatanten med cellesuspensjonen til 6-brønns plate ved hjelp av en Pasteur-pipette. En pellet består av celle rusk kan danne. Unngå å overføre pelleten.
  18. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 ° C.
  19. Overfør 2,5 ml av cellesuspensjonen fra hver brønn inn i en ny brønn. Tilsett 2,5 ml varmt kulturmedium (beskrevet i trinn 2) til hver brønn.
  20. Etter 72 timer, overføres cellene til et sterilt rør og sentrifuge i 7 minutter ved 400 x g ved romtemperatur. Kast supernatanten og erstatte den with dyrkingsmedium supplert med pattedyrcelle utvalg antibiotikum hensiktsmessig for plasmidet brukt (anvende en konsentrasjon som passer for de antibiotika som brukes, vi brukte G418 og / eller Hygromycin i konsentrasjoner på 1,3 mg / ml og / eller 0,2 mg / ml, respektivt). Kultur cellesuspensjonen i en fersk godt. Alternativt kan celler bli transfektert transient og avbildes 48 timer etter transfeksjon. For å forberede forbigående transfektert celler, co-transfektere cellene med de to plasmider samtidig i trinn 8, fortsetter normalt til trinn 20, og deretter gå direkte til steg 23. Legg merke til at under dette scenariet, bør cellene brukes umiddelbart, og generelt deres fluorescensintensitet er heterogen og ikke nødvendigvis høy.
  21. Dyrk celler med kultur-medium supplert med de riktige valg antibiotikum. Splitte cellene og supplere dem med antibiotika-supplert kulturmedium etter behov.
  22. Etter 2 uker, bekrefter vellykket transfeksjon ved bruk av FACS (influensaorescence-aktivert celle sortering) som følger:
  23. Samle 10 6 transfekterte celler, 10 seks mock transfekterte celler (negativ kontroll), og 10 6 celler som er kjent for å stabilt uttrykke fluorescently tagget protein. Hvis cellene er tilført med mer enn én fluorescerende protein (se trinn 27), bruke flere, enkeltvis merket cellelinjer som positive kontroller.
  24. Sentrifuger cellene i 7 minutter ved 400 x g ved romtemperatur.
  25. Kast supernatanten. Resuspender celler i 500 pl FACS-buffer (PBS w / o Ca2 + og Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% natriumazid).
  26. Bruk en analytisk FACS å verifisere mobilnettet fluorescens. Sammenlign fluorescens av de transfekterte celler til den av de negative og positive kontroller.
  27. Å transfektere cellene med en ekstra, fluorescently tagget protein, gjentar du trinn 3-26 ved hjelp av transfekterte celler.
  28. Celler som viser høye nivåer av fluorescens bør brukes. Optimalt er minst 50% avcellene i kulturen skal være sterkt fluorescerende. Cell fluorescens kan økes ved cellesortering via FACS.

Eventuelle andre merkede proteiner må være smeltet sammen til forskjellige fluorophores og kodes på plasmider som koder for forskjellige valg antibiotika. Utvalg medium for celler transfektert med mer enn ett plasmid bør suppleres med alle passende antibiotika.

2. T-celle Sprer analysen Forberedelse

  1. Bruk Lab-Tek II tysk coverglass system 4 kammer lysbilder. Pass på å ikke uhell skrape den indre overflaten av kamrene, f.eks med en pipette spissen, under forberedelse eller bruk.
  2. Forbered 50-ml lysbilde forberedelse løsning: Ta 4,6 ml 12 M (37%) HCl, tilsett 38,5 ml 100% etanol, og 6,9 ml dobbeltdestillert vann.
  3. Fyll hvert kammer av lysbildet med 500 ul lysbilde forberedelse løsning.
  4. Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
  5. Suge kammerets, tørke dem helt.
  6. Inkuber avdekket lysbilder for en time ved 45 ° C till helt tørr.
  7. Forbered 0,01% poly-L-lysin-løsning ved å fortynne 0,1% poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) i dobbelt destillert vann.
  8. Påfør 500 mL til hvert kammer.
  9. Inkuber lysbilde i 15 min ved romtemperatur.
  10. Sug kamrene, tørke dem helt.
  11. Inkuber i 3 timer ved 45 ° C inntil fullstendig tørr.
  12. Belagt lysbilder kan lagres tørt i flere måneder ved romtemperatur.
  13. Forbered et aktiverende antistoff løsning. Bruk en anti-CD3 antistoff: enten HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) eller UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 mg / ml i 400 mL PBS, per kammer. Denne løsningen bør være forberedt kort tid før lysbilde forberedelse.
  14. Fyll hver kammer med 400 pl av den aktiverende antistoff løsning.
  15. Inkuber lysbildet i 2 timer ved 37 ° C, eller fortrinnsvis over natten ved 4 ° C.
  16. Fjern aktiverende antistoff solution og vasker kammeret to ganger med 300 mL PBS. Fra dette punktet, må kamrene forblir fylt med buffer.
  17. Oppbevar PBS-fylt lysbilde ved 4 ° C. Vi foreslår at du bruker de preparerte lysbilde kamre innen 1 uke.

3. T-celle aktivering og bildebehandling

  1. Forbered bildebehandling buffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS 38.75 ml RPMI uten fenol red]. Imaging buffer kan lagres ved 4 ° C etter filtrering.
  2. Aktiver Zeiss LSM 510 Meta mikroskop. Varm mikroskopet oppvarmet monteringsrammen til 37 ° C. Velg "Expert mode".
  3. Klikk på "Hent"-fanen og åpne følgende kategorier: Lasere, mikroskopi, konfigurasjon, scan, tidsserier.
  4. Aktivere de nødvendige lasere. For eksitasjon av mCFP og mYFP, sett Argon / 2 laser til "standby" i 5 min, deretter til "on".
  5. Hvis du har utført dette live-cell imaging analysen før, med de samme fluorophores, åpner den resulterende LSM-filen, klikker du på "gjenbruk" icon, og fortsette fra trinn 9. Ellers fortsetter fra trinn 6.
  6. Definer kanaler ved hjelp av filtre som passer for eksitasjon og emisjon av fluorescerende proteiner som brukes.
  7. I "Scan kontroll"-vinduet, velg Z stabelen alternativet.
  8. Oppgi følgende skanningsparametre: Antall skiver: 5; Intervall: 0,5 mikrometer; Current skive: 3.
  9. Forbered en Accublock Digital Dry Bath (Labnet) ved 37 ° C i nærheten av mikroskop.
  10. Varm bildebehandling buffer til 37 ° C.
  11. Forbered den lagrede lysbildet ved aspirasjon av PBS, og erstatte den med 600 ul av varm bildebehandling buffer.
  12. Inkuber raset ved 37 ° C. Hold raset i inkubatoren til trinn 13, i minst 15 min.
  13. Samle 5 x 10 5 transfekterte T-celler.
  14. Sentrifuger celler for 2 min ved 400 × g.
  15. Kast supernatanten.
  16. Resuspender cellene i 1 ml varm bildebehandling buffer, og overføre dem til en 1,5 ml Eppendorf tube.
  17. Plasser test røret på Accublock Digital Dry Bath.
  18. Ta varmet lysbilde fra inkubatoren, og montere den på varmet mikroskop monteringsramme.
  19. Klikk på "Vis"-ikonet.
  20. Bland cellesuspensjonen og fjerne 1-2 pl.
  21. Sett spissen av pipetten inn i avbildning buffer over bunnen av lysbildet. Unngå å skrape raset.
  22. Seed cellene over målet blenderåpning.
  23. Umiddelbart begynne visuelt spore fluorescerende celler som de ned. Velg en celle som viser høy fluorescens i begge kanaler.
  24. Før cellen når overflaten av lysbildet, aktiverer den LSM-modus.
  25. Veksle bare en eksitasjon laser. Velg en laser som du har en DIC kanal.
  26. Sett Zoom til en. Klikk på "Fast XY"-ikonet. Klikk på "Stop"-ikonet. Ved hjelp av beskjæringsverktøyet, velger du en ROI sentrert på cellen.
  27. Sett Zoom til tre. Klikk på "Fast XY"-ikonet, og deretter manuelt sette fokus på optimalt vis cellen. Klikk på "Stop" icon.
  28. Veksle alle de nødvendige eksitasjon lasere.
  29. Begynn opptaket ved å klikke på "STARTt"-ikonet. Bildet cellen for helheten av den spredningsprosessen (vanligvis 5 minutter). Når du er ferdig, klikk på "Stop"-ikonet.
  30. Lagre filen.
  31. Å skaffe flere celler, klikker du på "Vis"-ikonet. Hvis det er celler som ennå ikke kommer i kontakt med raset i bunnen, fortsetter du fra trinn 23. Unngå bildebehandling celler som allerede har begynt spredning prosessen. Ellers fortsetter du til trinn 32.
  32. Hvis den observerte rasområdet er stort sett blottet for celler, legge til en annen delmengde av celler (fortsette fra trinn 20). Ellers fortsetter du til trinn 33.
  33. Å skaffe flere celler, beveger feltet slik at området over målet blenderåpning er blottet for celler.
  34. Legg til en annen prøve av celler (og fortsette fra trinn 20).
  35. Etter å ha utført alle ønsket bildebehandling, åpne en lagret LSM fil.
  36. Klikk på "Galleri", "Time + Z" og "Delsett".
  37. Velg relevant tidsrom og Z stabelen.
  38. Lagre den nye filen.
  39. Utfør trinn 35-38 for alle tenkelig filer.

4. Imaging Data Analysis

  1. Åpne LSM filer ved hjelp Imaris programvare (Bitplane AG, Zürich Sveits).
  2. Klikk "overgå". Klikk på "Image Processing"-menyen, og velg "Bytt Tid og Z". Dette vil hjelpe i riktig beskjæring av bildet.
  3. Klikk på "Edit" verktøylinjen og velg "Crop 3D" i drop-menyen. Beskjære bildet for å inkludere bare området rundt cellen. Vi foreslår beskjæring en 300 × 300 pixel kvadrat sentrert på cellen. Legg merke til at formen og plasseringen av cellen kan endre seg over tid. Observere t aksen, sørg for at cellen er innenfor beskåret regionen på alle tidspunkter.
  4. Klikk på "Image Processing"-menyen, og velg "Bytt Tid og Z" for å gjenopprette den opprinnelige temporal separasjon av bildet.
  5. Trykk på "Coloc"-knappen på verktøylinjen på hovedmenyen. Velg "Bygg Tid Dep. Coloc ". Imaris vil automatisk beregne intensitet terskler for hver kanal på hvert tidspunkt.
  6. Se resultatene av colocalization analyse ved å velge "Channel statistikk". Eksportere dataene ved å klikke på "Export".
  7. Gjenta trinn 1 til 6 for hver avbildes celle. Det anbefales at minst 50 celler analyseres på denne måte.
  8. Beregn middelverdien Pearsons colocalization koeffisient og dens standard feil eller avvik.

Representative Results

Vi presenterer et eksempel på levende T-celle avbildning og analyse. Forut for avbildning eksperimentet ble SLP76 mangelfull T-celler (J14) analysert ved bruk av FACS for å bestemme ekspresjon av de fluorescerende proteiner (figur 1). T-celler transfektert med de merkede signalanlegg proteiner mCFP-NCK og SLP76-mYFP ble avsatt over aktiverende lysbilder og avbildes i T-celle spredning (figur 2). Samlet bilder viser dynamikken til protein lokalisering gjennom aktivering og sprer seg (figur 3). Datastyrt bildebehandling gir ny innsikt og kvantitativ informasjon fra de visualiserte celler, samtidig som menneskelig bias. For å undersøke colocalization av de to proteinene i hele mobilnettet aktiveringsprosessen, benyttet vi den colocalization verktøy for Imaris programvare (Bitplane AG, Zürich Sveits). Ved å sammenligne de colocalization koeffisienter mellom ulike tidspunkt over avbildes celler, var vi kunne fastslå at colocalization av Nck og SLP76 ikke endres betydelig gjennom T-celle aktivering (p> 0,3) (figur 4).

Figur 1
Figur 1. FACS-analyse av celler transfektert med dobbelt fluorescensmerket-merkede proteiner data er vist som fluorescensintensitet histogram for (A) mCFP; (B). MYFP, og (c) som en prikket linje. Fluorescensintensiteten av J14 celler transfektert med mCFP-Nck og SLP76-mYFP er representert i cyan og gult, henholdsvis. Untransfected J14 negative kontroll celler er indikert med svarte linjer.

/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Figur 2. En skjematisk fremstilling av live T-celle spredning analysen (A) Utarbeidelse av T-celle aktiverende lysbilder;. (B) bor T-celle spredning analyse og analyse;. (C) mikroskopi oppsett Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Fordeling av Nck og SLP76 under T-celle aktivering prosess. Celler som uttrykker mCFP-Nck og SLP76-mYFP ble sluppet over anti-CD3 stimulerende antistoff forbelagte Dekkglass og stadig avbildes i en periode på 7 min. mCFP-Nck er representert ved cyan, mens SLP76-mYFP er vist i gult.


Figur 4. Kvantitativ analyse av protein colocalization. Bildebehandling av celler ble utført ved hjelp av Imaris programvaren (Bitplane AG, Zürich Sveits). Colocalization beregnes som Pearsons korrelasjonskoeffisient mellom intensiteter av mCFP kanalen og mYFP kanal for hver piksel. Pearsons colocalization koeffisienter beregnet fra ulike tidspunkt sammenlignes. Tretti sekunder inn i aktiveringsprosessen, ble colocalization koeffisient av mCFP-Nck og SLP76-mYFP økt signifikant (p <0,05). Disse resultatene ble beregnet ved å analysere> 50 uavhengige celler. Gjennomsnitt ± standard avvik er vist.

Discussion

Reguleringen og funksjon av flere cellulære prosesser avhenger av dannelsen og opphør av protein-protein interaksjoner. Mikroskopisk bildebehandling gjør at sanntids sporing av fluorescently merket proteiner i levende celler. Colocalization av kodede proteiner kan foreslå en direkte eller indirekte interaksjon mellom proteiner, og kan brukes til å forsterke resultatene oppnådd ved biokjemiske metoder, slik som immunoutfelling. I motsetning biokjemiske metoder, gjør det mulig for levende celle avbildning disse inter-protein interaksjoner som skal iakttas romlig og over tid, å lette overvåkning av fysiologiske prosesser som de oppstår, og påvisning av den cellulære fordelingen av proteinene. Ulike verktøy for kvantitativ analyse av colocalization har blitt utviklet, Pearsons korrelasjonskoeffisient er fortsatt et meget attraktivt og allment tilgjengelig metode for kvantifisering av graden av colocalization mellom to proteiner 12. Mens fluorescens resonans eNERGY transfer (FRET) eksperimenter aktivere sporing av inter-protein interaksjoner preget av nærhet (10 nm), krever denne metoden spesialiserte innstillinger (utstyr og kompatibilitet av fluorescerende taggings brukes) og kompleks databehandling. For de fleste bruksområder, colocalization analyse, i konjugering med biokjemiske metoder, utgjør en lett-å-bruke og grei metode for å observere protein-protein interaksjoner over tid.

Etablering av en fluorescens intensitet terskel for analyserte piksler, mens de ignorerer piksler under intensiteten terskelen for enten kanal, er av avgjørende betydning for nøyaktig og følsom colocalization analyse. Den brukte algoritmen for den objektive og automatisert bestemmelse av disse tersklene ble utviklet av Costes et al. 13 og er gjennomført av bildebehandlingsprogrammer som Imaris og Volocity.

Her viser vi bruk av live T-celle imaging metode for analyse av dynamikken i SLP76, en nøkkel stillas i T-celler, og Nck, adapterproteiner, som begge er essensielle for T-celle aktivering 14,15. Bilder av T-celler som samles under aktiveringen tyder på at de to proteinene er colocalized gjennom den cellulære aktiveringsprosessen (figur 3). Dette er kvantitativt bekreftes ved å utføre Pearsons colocalization test på bilder samlet gjennom aktiveringsprosessen. Den Pearsons colocalization koeffisienter utvalg -1 til 1, der en score på -1 betyr anti-sammenheng, betyr en score på en perfekt colocalization og 0 betyr ingen korrelasjon mellom de to image-kanaler. Sammenligning av Pearsons colocalization koeffisienter beregnet for ulike tidspunkt og for ulike celler indikerer at colocalization av Nck og SLP76 ikke endres betydelig mobilnettet aktivering, men forblir konstant (p> 0,3, figur 4). Mens den generelle colocalization coeffektive av disse proteinene ikke endres gjennom aktiveringsprosessen, den ikke eliminere muligheten av en dynamisk prosess med assosiasjon og disassociation oppstår mellom disse proteinene 18.

Protokollen vi presentert kan også tilpasses andre hematopoetiske cellelinjer ved å justere celle-vekstbetingelser som kreves, å velge en transfeksjon innstilling som passer for den aktuelle cellelinje og modifisere den cellulære aktiveringsprosessen, hvis dette er aktuelt. Vær oppmerksom på at mens vi brukte LSM 510 Meta konfokalmikroskop, med de nødvendige justeringer og bruk av innstillinger, kan andre Konfokalmikroskopi systemer med hell brukes i tillegg.

Bruken av levende T-cell imaging gjør at regulatoriske og aktivisering prosesser for å være direkte overvåket, slik signalering hendelser som skal utforskes med temporal og romlig oppløsning utilgjengelig bruke biokjemiske og molekylærbiologiske metoder. Vi presenterer en grei methOD for å utføre en levende T-celle spredning assay, overvåking relevante proteiner i sanntid og analysere dataene for å gi kvantitative resultater. Resulterende mikroskopi data kan også brukes for andre nedstrøms applikasjoner, for eksempel celle-form indeks analyse 16 og FRET analyse 17,18, avhengig av den spesifikke eksperimentelle oppsettet og forskningsformål.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Sophia Fried for teknisk assistanse. MBS takker følgende byråer for sin forskning support: The Israel Science Foundation for tilskudd no.1659/08, 971/08, 1503/08 og 491/10, departementene of Health & Science for tilskudd ingen. 3-4114 og 3-6540, Israel Cancer Association gjennom Estate til den avdøde Alexander Smidoda, og Taubenblatt Family Foundation for Bio-medisin excellence stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics