Передний мозг Электрофизиологические записи в личинки данио рерио

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Простой метод для записи внеклеточных потенциалов поля в личиночной рыбок данио мозга описаны. Метод обеспечивает надежную

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (71), e50104, doi:10.3791/50104 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эпилепсия затрагивает почти 3 миллиона человек в Соединенных Штатах и ​​до 50 миллионов человек по всему миру. Определяется как возникновение спонтанной неспровоцированных припадков, эпилепсии могут быть приобретены в результате оскорбления в мозг или генетической мутации. Усилия по модели припадки у животных в первую очередь использовать приобретенные оскорбления (судорожного наркотики, стимуляцию или черепно-мозговой травмы) и генетических манипуляций (антисмысловой нокдаун, гомологичной рекомбинации или трансгенез) у грызунов. Данио рерио является моделью системы позвоночных 1-3, которые могут предоставить ценную альтернативу грызунов на основе исследования эпилепсии. Данио рерио широко используются в исследовании позвоночных генетики или развития, проявляют высокую степень генетического сходства с млекопитающими и выразить гомологов для ~ 85% известных человеческих одной мутации гена эпилепсии. Из-за своих небольших размеров (4-6 мм в длину), личинки данио рерио могут быть сохранены в объемах жидкости столь же низко как 100 мкл во время раннего развития и ARRAрый в мульти-луночных планшетах. Реагенты могут быть добавлены непосредственно в раствор, в котором развиваются эмбрионы, упрощения введения препарата и позволяет быстро в естественных условиях скрининга тестируемых соединений 4. Синтетические олигонуклеотиды (morpholinos), мутагенеза, цинкового пальца нуклеазы и трансгенных подходов может быть использован для быстрого создания нокдаун гена или мутации у рыбок данио 5-7. Эти свойства позволить себе рыбок данио исследования беспрецедентными статистического анализа преимуществ власть над грызунами в изучении неврологических расстройств, таких как эпилепсия. Потому что «золотым стандартом» для лечения эпилепсии исследований является мониторинг и анализ аномальных электрических разрядов, которые происходят в центральной структуры мозга (например, эпилептические припадки), метод эффективного записи активности мозга в личиночной рыбок данио описано здесь. Этот метод адаптации обычных внеклеточной методы записи и позволяет стабильный долгосрочный мониторинг активности мозга в неповрежденный личинки данио рерио. Sдостаточное записи показаны для острого шок, вызванный ванны применения судорожного наркотиков и спонтанных припадков, записанные в генетически модифицированной рыбы.

Protocol

1. Производство яиц и коллекции

  1. Данио рерио хозяйства следует стандартным процедурам, описанным ранее 8. Короче говоря, взрослые данио созданы в разведении танков с перегородками на месте. Когда свет в комнате прийти на следующее утро, разделители удаляются из племенных танков и рыба разрешены примерно от 20 до 60 мин ненарушенных время спаривания.
  2. Яйца из разведения танков, собранных в сито и промыть яйцо водой. Яйца затем переносят в чашку Петри с яйцом воды. Неоплодотворенные яйца и мусор удаляются с помощью передачи пипетки.
  3. Место чашке Петри содержащие собранные яйца в инкубаторе (28-32 ° C). После яиц вылупляются, около двух дней после оплодотворения (DPF), удалить хориона и любой другой мусор с передачей пипетки.
  4. В нужный день после оплодотворения (3 до 8 DPF) удалить чашке Петри содержащие свободно плавающих личинок и место на лабораторном столе при комнатной температуре.

  1. Использование съемника микропипетки, потяните 1,2 мм OD боросиликатного стеклянный капилляр на две иглы и магазин в 150 мм чашки Петри или пустую коробку пипеткой путем прокладки над глупыми пандусы замазкой. Иглы могут быть вытащил заранее. Различные OD стеклянные капилляры могут быть использованы в зависимости от типа усилителя headstage доступны.
  2. Backload микроэлектрод с внеклеточной решение для записи (2 М NaCl) с использованием 1 мл шприц с Nalgene шприц фильтр (4-мм) и Microfil нити (Warner Precision Instruments) прилагается. Встряхните или нажмите болюса на кончике иглы, пока есть мало или совсем нет пузырьков осталось.

3. Иммобилизация в агар

  1. Подготовка свежий раствор 1,2% агар низкой температурой плавления в яйце воды. Место агар решение в комплекте водяной бане при температуре ~ 37 ° C.
  2. Подготовка покровное с камерой запись и место в морозильной камере (5-10 мин). Запись камеры должна MATCч, что использовались на буровой электрофизиологии. Мы используем низкопрофильных открытых алмазов ванны изображения камеры от Warner Instruments (модель RC-26GLP).
  3. Использование Пастера или передачи пипетки, положите одну личиночной данио рерио в небольшой капле воды яйца в чистую тарелку чашке Петри. Для этого капля, добавьте каплю раствора, содержащего анестетик (0,02% Tricaine) и парализующий агент (1 мг / мл α-bungarotoxin).
  4. Мониторинг рыбок данио за потерю движения (5 до 10 мин).
  5. Удалить покровное / записи камеры с морозильной камерой. Поместите камеру на сцену стереомикроскопа. Использование передачи пипетки, смешать несколько мл 1,2% низкой температурой плавления агарозы с каплей и передачи решения (с рыбой) на покровное / записи камеры.
  6. С помощью кончика пипетки или тонкой тупой иглой, положение личинки под стереомикроскопа так, что спинной части рыбы подвергается поверхность геля агарозы. Разрешить агарозы, чтобы укрепиться (5-10 мин), затем с помощью плоского шпателя передачи агар бБлокировка на запись камеры установлены на буровой электрофизиологии.

3. Внеклеточный поле записи

  1. Добавить 2-5 мл среды рыбок данио записи на записи камеры. Если препарат изменения необходимы, заливать камеру с записью решения в размере около 1 мл / мин. Нет оксигенации записи решение необходимо.
  2. Вставьте микроэлектрод (около 1 мкм диаметром кончика, 2-7 МОм) в усилитель headstage установленный на трехмерные микроманипулятора. Убедитесь, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы обеспечить диапазон движения и регулировки. Принесите микроэлектрода чаевые в плоскость зрения микроскопа, высоко над сценой, и с помощью грубой регулировки нижнего уровня чуть выше и немного впереди глава рыбок данио.
  3. С усилителя в "текущем зажим" режим нулевых электродов.
  4. Использование грубой регулировки нижнего торца электрода так, чтобы она не коснется ыurface из рыбок данио, немного впереди переднего мозга.
  5. При использовании тонкой регулировки шага продвижения кончик электрода, пока она прокалывает кожу рыбок данио. Дайте отстояться и затем перейти электрод несколько микрон в переднем мозге.
  6. Запись электрической активности в текущем зажим режиме с использованием Axoscope программного обеспечения. Данные, полученные в частоте дискретизации 10 кГц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Примеры электрографических захвата типа разряда записаны в мозг из агар-встроенные личинки данио показано на рисунке 1. Большая амплитуда мульти-всплеск всплеск разряда в этих образцах был вызван ванны применения судорожного наркотиков, 40 мМ пилокарпин (в, 6 DPF) или 1 мм пикротоксина (в B, 8 DPF). В этих записях, иммобилизованных и агар-встроенные рыбок данио постоянно контролируется в течение 90 мин. Рыбы остаются жизнеспособными при этих условиях записи до 24 часов. Препараты добавляли в среду купания и обычно диффундируют в агар для выявления активности в личиночной рыбок данио мозга в пределах от 30 до 45 мин. Этот метод может быть использован при относительно небольших объемов лекарственного раствора (2-5 мл), как личинки не требуют непрерывной перфузии и могут быть записаны в статической конфигурации ванну, если это необходимо. В панели C, разряд спонтанных всплесков показан для генетически модифицированных рыбок данио на 3 денье; запись была сделана в данио рерионосителя записи. Морфолино олигонуклеотида инъекции в 1-2 клеточной стадии был использован для нокдаун экспрессии гена для клубневые склероз комплекс (tsc1a), детский формы эпилепсии связаны с эпилептическими припадками и аутизмом. Внеклеточной записи могут быть также получены из зрительного покрышки. Например, см. Барабан и соавт. (2005) 9 или Барабан и соавт. (2007) 10. Как показано здесь, электрических событий может варьироваться в форме волны и продолжительность в зависимости от механизма действия использоваться, чтобы выявить судорожную активность.

Рисунок 1
Рисунок 1. Внеклеточной полевых записей аномальной активности разряда взрыв, записанные в переднем мозге иммобилизованных и агар-встроенные личинки данио рерио. Запись электроды расположены под визуальнымнаблюдения на Olympus BX50 прямой микроскоп. Записи в (А) и (Б) было начато примерно от 40 до 45 мин после применения препарата. (A) Multi-всплеска разряда, записанные в пилокарпин, антагонист мускариновых рецепторов ацетилхолина. (B) съемка разрядов, записанных в пикротоксина, ГАМК-рецепторов. (C) один многостраничный всплеск всплеск разряда записаны от 3 DPF личинки данио вводят морфолино против tsc1a.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Внеклеточной метод записи, представленные здесь позволяет очень чувствительный и быстрый анализ активности мозга. Эти записи аналогичны электроэнцефалографии (ЭЭГ) мониторинг обычно используется для оценки наличия аномальных электрических разрядов (например, арест) в моделях грызунов эпилепсии 11 и пациентов 12. Внеклеточной записи могут быть объединены с фармакологической манипуляции, как показано здесь. Эти типы записей, также может быть использован для оценки потенциальных эпилептические фенотипов в генетически модифицированных рыбок данио. Мутант рыбок данио, как правило, доступны для многих генных мутаций, выявленных в ЕНУ мутагенеза экранов (см. данио рерио Международный ресурсный центр, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) или через новые Tol2 трансгенных 7 и цинковый палец нуклеотидной 13 методов. Как показано здесь, быстрый нокдаун гена с использованиемморфолино олигонуклеотидов следует электрофизиологического мониторинга уже в 3 DPF обеспечивает дополнительный метод оценки захват вызывающие дефекты гена. Запись электрод может быть легко размещен в любом рыбок данио структуры, включая тектуме или мозжечка, а также несколько электродов записи могут быть использованы в случае необходимости. Ограничение этих записей является то, что трудно оценить точное расположение кончика записи электрода по отношению к конкретным ядер головного мозга. Наличие у рыбок данио проведения флуоресцентной журналистам в конкретных ядер или типов клеток будет смягчить это ограничение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Автор хотел бы поблагодарить Питера Кастро и Мэтью Dinday к их скорейшему усилия по созданию данио рерио в лаборатории. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья EUREKA гранта (# R01NS079214-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low melting Fisher-Scientific BP1360-100 Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media Fisher-Scientific BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2
pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
α-bungarotoxin Tocris Bioscience 2133 1 mg/ml
Capillary glass tubing Warner Instruments G120TF-3 Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier Warner Instruments PC-505B We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Filter/amplifier Cygnus Technology FLA-01 We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Axon A/D board and Axoscope software Molecular Devices Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions.
Egg water Instant Ocean 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22, (1), 49 (2011).
  2. Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93, (2), 231 (2011).
  3. Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
  4. Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
  5. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26, (2), 216 (2000).
  6. Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
  7. Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  9. Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, (3), 759 (2005).
  10. Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, (6), 1151 (2007).
  11. Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 39 (2006).
  12. Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51, (4), 592 (2010).
  13. Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138, (20), 4555 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics