Une nouvelle méthode de stabilisation vertébrale pour Produire contusion Traumatisme médullaire

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Summary

La stabilisation vertébrale est nécessaire pour minimiser la variabilité, et pour produire cohérentes expérimentales blessures de la moelle épinière. En utilisant un appareil de stabilisation personnalisé en conjonction avec le dispositif de frappe NYU / Mascis, nous avons démontré ici le matériel et la procédure appropriée pour générer reproductibles cervicale (C5) blessures de la moelle épinière hémi-contondante chez des rats adultes.

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Walker, M. J., Walker, C. L., Zhang, Y. P., Shields, L. B., Shields, C. B., Xu, X. M. A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (95), e50149, doi:10.3791/50149 (2015).

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Abstract

Blessures animaux cliniquement pertinente moelle épinière cervicale (SCI) modèles sont essentiels pour développer et tester des thérapies potentielles; Toutefois, la production de SCI cervicale fiable est difficile en raison de l'absence de méthodes satisfaisantes de stabilisation vertébrale. La méthode classique pour stabiliser la colonne vertébrale est de suspendre la colonne cervicale rostrale et caudale par des pinces attachées aux apophyses épineuses cervicales. Cependant, ce procédé de stabilisation ne parvient pas à empêcher le tissu produisant au cours de la contusion que les processus de la colonne vertébrale cervicale sont trop courtes pour être efficacement fixé par les pinces (figure 1). Ici, nous introduisons une nouvelle méthode pour stabiliser complètement la vertèbre cervicale au même niveau de la blessure d'impact. Ce procédé minimise efficacement le mouvement de la colonne vertébrale à l'endroit de l'impact, ce qui améliore grandement la production de SIC cohérentes. Nous fournissons description visuelle de l'équipement (Figure 2-4), la méthodes, et un protocole étape par étape, pour la stabilisation de la 5 vertèbre cervicale (C5) de rats adultes, pour effectuer une laminectomie (figure 5) et produire un contondante SCI par la suite. Bien que nous démontrons qu'une contusion cervicale hémi-en utilisant le dispositif de frappe NYU / Mascis, cette technique de stabilisation vertébrale peut être appliqué à d'autres régions de la moelle épinière, ou être adapté à d'autres appareils SCI. Améliorer l'exposition de la moelle épinière et la fixation par la stabilisation vertébrale peut être utile pour produire des blessures cohérentes et fiables à la moelle épinière. Ce procédé de stabilisation vertébrale peut également être utilisé pour des injections stéréotaxiques et des traceurs de cellules, et pour former une image en utilisant la microscopie à deux photons dans diverses études neurobiologiques.

Introduction

Force mécanique cohérente et reproductible sur les tissus de la moelle cible est essentiel pour minimiser la variabilité fonctionnelle et histologique et pour établir avec succès des blessures de la moelle épinière contondante (SCI) modèles 1-7. La quantité de force appliquée à une région cible de la moelle épinière dépend des méthodes utilisées pour la stabilisation de la colonne vertébrale. Décalage en position de la colonne vertébrale cible lors d'un contact entre le piston d'impact et de la moelle épinière modifie la force de blessure résultant. Le modèle SCI contondante col de l'utérus est un modèle cliniquement plus pertinent que d'autres formes de SCI, car environ 50% des cas SCI homme se produisent à ce niveau 8, et plusieurs études ont été réalisées SCI en utilisant des modèles de blessures cervicales animaux 9-14. Bien que les modèles SCI contondantes utilisent souvent une certaine forme de stabilisation en serrant le processus de la colonne vertébrale antérieure et postérieure à l'endroit de la blessure, cette préparation est difficile pour la production du col SCI. &# 160; Comme le montre cette démonstration, le procédé de stabilisation est avantageux que nous avons développé dans sa capacité à augmenter à la fois la qualité et la reproductibilité de la blessure par contusion. En particulier, cette méthode de stabilisation vertébrale a été créé dans le but de modifier les lacunes et les défis des autres modèles: 1) la variabilité de rendement vertébrale sous la force de l'impact peut se produire par serrage dorsales adjacente apophyses épineuses rostrale et caudale à la laminectomie. Le degré de déplacement vertébral dépend du nombre d'articulations vertébrales entre l'impact et les vertèbres étant stabilisée (figure 1). Par conséquent, plus les articulations impliquées la moins stable de la colonne vertébrale devient; 2) des processus épineux dorsales sont l'insuffisance de serrage fragile et la cause à la suite d'une fracture de l'apophyse épineuse ou la pince de glisser hors du processus; et 3) les apophyses épineuses de ces vertèbres sont extrêmement courts entre la vertèbre C3 à T1 par rapport à ceux de la verte thoraciquebrae, ce qui rend difficile l'aide de colliers traditionnels de saisir les apophyses épineuses pour stabiliser le rachis cervical.

Nous décrivons ici un nouveau procédé de stabilisation de la colonne vertébrale pour la production en C5 contondante SCI femelles adultes de rats Sprague-Dawley. Cette méthode peut être utilisée pour la stabilisation d'autres niveaux de la colonne vertébrale et la moelle épinière, et ainsi conjugués avec d'autres appareils contondantes SCI, y compris le cordon Université de New York / multicentrique animaux Spinal Injury étude (NYU / Mascis) impacteur 15 (Figure 2) , Precision Systems et Instrumentation, LLC Infinite Horizon (IH) dispositif 16, l'Ohio State University / électromagnétique Spinal Cord Injury dispositif 1, et l'appareil Système blessures Louisville (LISA) 17, permettant une utilisation répandue dans la recherche SCI.

Protocol

1. Exposition du col de l'utérus vertébrale Laminae

  1. Nettoyer la surface chirurgicale avec 70% d'éthanol, préchauffée avec un coussin chauffant. Couvrir la surface avec un champ opératoire stérile avant de placer une gaze stérile, des cotons-tiges, et des outils chirurgicaux autoclaves dans le domaine de la chirurgie. Utilisez un stérilisateur de microbilles pour la chirurgie inter-stérilisation des instruments chirurgicaux.
  2. Anesthésier le rat avec de la kétamine (87,7 mg / kg) / xylazine (12,3 mg / kg) par voie intraperitoneale (IP). Le plan de l'anesthésie adéquate est atteinte lorsque l'animal cesse de répondre à un stimulus de pincement orteil. Injecter en sous-cutané 0,01-0,05 mg / kg buprénorphine et 5 mg / kg Carprofen avant l'intervention chirurgicale. La buprénorphine devrait alors être administré tous les 8-12 h et Carprofène une fois par jour, pour les 4-7 premiers jours après la chirurgie.
  3. Appliquer une pommade de protection pour les yeux de l'animal pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie.
  4. Rasez la zone chirurgicale sur la dorsalesurface du rat de la région médio-thoracique à l'arrière de la tête avec une tondeuse. Enlever la fourrure rasée aide d'un aspirateur équipé d'un filtre HEPA.
  5. Appliquer la solution de bétadine à la zone rasée comme un gommage chirurgicale puis nettoyer la zone avec 70% tampons imbibés d'alcool isopropylique.
  6. Utilisez une lame de scalpel pour effectuer une incision médiane de 3-4 cm dans la peau de la base de la tête caudale à la mi-thorax.
  7. Identifier la ligne médiane du fascia et les muscles sous-cutanés antérieure à la glande de l'hibernation au bas du cou; couper à travers le trapèze et d'autres muscles le long de la ligne médiane pour réduire l'hémorragie.
  8. Trouver la ligne médiane de deux régions du tissu adipeux sous-tend les muscles; couper les muscles paraspinous caudale strictement le long de la ligne médiane, et les couches musculaires séparés en utilisant un petit écarteur de tissu jusqu'à ce que le niveau du T2 thoracique apophyse épineuse est atteint.
  9. Identifier et couper le muscle relié à l'apophyse épineuse T2 à utiliser this la structure comme un point de repère anatomique.
  10. Retirer la pointe cartilagineuse de l'apophyse épineuse de T2 pour améliorer la visibilité des vertèbres cervicales.
  11. Séparer les muscles spinaux latéralement des apophyses épineuses et lames de C4-T1; Toutefois, épargner le muscle couvrant sur la lame de C3 pour prévenir les saignements.
  12. Couper les muscles sur les lames à partir de C4-T1 latéralement vers les facettes des deux côtés de la colonne vertébrale.
  13. Après la moelle lames sont exposés, placer l'animal sur sa surface ventrale dans le canal en forme de U du stabilisateur.
  14. Identifier la vertèbre C5 en comptant les apophyses épineuses rostralement du T2 à T1 repère, C7, C6, et enfin C5.

2. Stabiliser les vertèbres et Exécution de l'impact des blessures

  1. Positionner les deux bras de stabilisateur en acier inoxydable à suspendre l'animal en plaçant les bords dentelés des bras sous l'lateral facettes de l'C5-6 vertèbres (figure 1C). Après avoir obtenu les bras avec vertèbres en place (figure 2B), régler l'appareil pour assurer la stabilisation de la colonne vertébrale est de niveau et centré. Enfin, verrouiller les bras en serrant les vis du stabilisateur.
  2. Couper les ligaments entre les apophyses épineuses et lames à C4-5 et C5-6 d'identifier la marge de la lame de C5.
  3. L'utilisation d'un micro-rongeur, un clip loin la moitié de la lame sur la droite à C5 comme prévu SCI (Figure 5C-E). Après laminectomie, transport de l'animal avec le stabilisateur sous le dispositif de blessures. Fixer l'animal avec stabilisateur sur un support (figure 3A-C) afin d'aligner avec précision le piston sur la cible de la moelle épinière à l'aide d'un micro-manipulateur latéral (figure 3).
  4. À fort grossissement, localiser les zones d'entrée de la racine dorsale C5 et C6 (DREZs) sur la surface de la moelle épinière dorsale exposée sans durotomy. Visez le piston au milieu des deux DREZs identifiés et mi-chemin entre la ligne médiane et le bord latéral de la moelle épinière (figure 5B).
  5. L'utilisation d'un dispositif de frappe NYU / Mascis avec une pointe de 2,5 mm de diamètre (figure 3A et B), produire une C5 hémi-contusion (figure 5B & E) par une baisse de 10 g tige x 12,5 mm de hauteur (figure 2A).
  6. Vérifiez la blessure visuellement par des ecchymoses sur la moelle épinière (Figure. 5E, flèche) et vérifiez les paramètres de blessures fournies par le logiciel NYU 12,17 (figure 6).
  7. muscles de suture et des tissus mous avec stérile 4-0 vicryl suture, puis fermez l'incision de la peau avec des agrafes chirurgicales (EZ Clips).
  8. Appliquer une pommade antibactérienne sur le site chirurgical.
  9. Administrer 5,0 ml de solution saline stérile à 0,9% sous-cutanée à l'animal pour l'hydratation.
  10. Placer l'animal dans un chaleurenvironnement contrôlé par (recirculation padcage d'eau chaude sur un coussin chauffant)) avec de la nourriture humide prévu sur la literie (changés tous les jours), et une bouteille d'eau avec un long bec pour un accès facile placé sur le plancher de la cage. Fournir des soins pour assurer une récupération adéquate avant de retourner à l'animal de la cage de la maison.
  11. Comme il se agit d'une blessure contondante cervicale unilatérale, l'animal sera probablement perdre fonction de la patte avant ipsilatérale, transitoire, qui commence à récupérer pendant les premières semaines après l'accident. Cependant, la fonction controlatéral doit rester intact, donc l'animal doit être capable de manger et boire sans perte de valeur, et ne ont qu'une dépréciation mineur dans la locomotion et le toilettage.

Representative Results

À la suite de ce protocole, cohérente et reproductible cervicale hémi-contondante SCI est produite (Figure 5 & 6). L'utilisation d'un stabilisant pour stabiliser les vertèbres processus latérales de la même vertèbre au niveau destiné à SCI permet à ces résultats satisfaisants. En utilisant ce procédé, non seulement la vertèbre C5 cible, mais également adjacent C4 et C6 sont rigidement fixés.

Le logiciel NYU / Mascis fournit une lecture avec un graphique situé sur un x et y-axe et prend en charge l'utilisation de notre méthode de stabilisation vertébrale, et de l'équipement (figure 6). Ce procédé de stabilisation permet de réduire la variabilité des blessures que peut provoquer le déplacement vers le bas à partir du tissu cible et de la colonne vertébrale (figure 1). Après une lésion, un hématome bleuâtre unilatérale clairement centrée entre la C5 et C6 DREZs est visible (figure 5E). Ces paramètres de blessures sont conformes de l'animal à l'anusmal selon la lecture fournie par le logiciel NYU / Mascis (figure 6).

Comme l'hémi-contusion cervicale produit déficits des membres antérieurs claires, ce modèle est idéal pour évaluer membres antérieurs capacités fonctionnelles telles que l'atteinte, toilettage 13, et l'objet de manipulation 18-19. Comme déficits moteurs membres postérieurs sont moins importants, le Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) ​​locomotrice échelle de notation 4 ne est pas approprié pour une utilisation dans ce modèle. Le résultat fonctionnel après une blessure est plus visible dans les ipsilatérales déficits patte extenseurs, dans laquelle le rat présente une "matraqués" poing avec tous les chiffres fléchie 18. Tous les animaux exposés à la même gravité des blessures et le niveau de la moelle épinière doivent présenter des déficits similaires à la patte antérieure ipsilatéral illustré dans ce protocole, lors d'une lésion correcte. Animaux mal lésée peut présenter manifestation très différente et la durée des déficits 13,18.

Histologiquement, ce modèle produit des dommages de matière grise et blanche à l'épicentre des blessures et rostrale et caudale à l'endroit de la blessure, conduisant à la lésion et de la cavité formation considérable contenue presque exclusivement dans le côté blessé de la moelle épinière. Un grand formes de cicatrice gliale principalement basée astrocytes aux frontières de lésion avec la mort neuronale massif 18.

Figure 1
Figure 1: Illustration de la flexibilité de la colonne vertébrale au cours SCI contondante avec différentes méthodes de serrage. Figures A et B montrent flexibilité ou «rendement» de la colonne vertébrale lorsque apophyses épineuses sont serrés dorsale, permettant impacts inappropriées et des données incohérentes. L'illustration montre la Une affiche beaucoup plus de flexibilité lors de l'impact (ligne rouge pointilléeet les grandes flèches courbes) par rapport à celle représentée sur B (petites flèches courbes), que les pinces sont plus loin du site de laminectomie et des blessures. La figure C montre la stabilisation latérale avec notre dispositif décrit avec le bras stabilisateur fermement serrées sous l'apophyse transverse de la vertèbre lorsque le site d'impact sera effectuée. Il n'y a pas de flexibilité de la colonne vertébrale au cours de cette procédure, comme la vertèbre d'intérêt est complètement stabilisé.

Figure 2
Figure 2: NYU / Mascis impacteur et le récipient de stabilisation personnalisé. Figure A affiche les pièces et fonctions de l'appareil des blessures de la moelle épinière NYU / Mascis, avec de multiples réglages de la hauteur de la tige pour la gravité des blessures (en médaillon). Figures B et C illustrent le récipient en forme de U qui détient larat, et les bras de stabilisation en toute sécurité, en dents de scie qui stabilisent la colonne vertébrale au cours de la chirurgie et la blessure (conçu et réalisé par Zhang YP).

Figure 3
Figure 3: système et microadjuster latérale de montage personnalisé sur l'impacteur NYU / Mascis Figure A détaille les différentes composantes du système de montage personnalisé pour le stabilisateur de rat en forme de U pour les blessures de la moelle épinière.. Notez le microadjuster latérale dans la figure A, cruciale pour un alignement précis de la moelle épinière de rat de blessure. Figures B et C fournir de plus amples représentation du stabilisateur sans (B) et avec le conteneur de rat en forme de U (C) par rapport à d'autres importants les composants du dispositif de blessure (système de montage conçus et produits par YP Zbloquer).

Figure 4
Figure 4:. Mesures des composants individuels du dispositif et les pièces jointes stabilisation chirurgicale Chaque composant du système de stabilisation personnalisé est mis en surbrillance afin de faire apparaître les dimensions et la dimension (A, C et D). Bras de stabilisation thoraciques (B) sont présentés pour afficher l'application éventuelle de ce dispositif pour une utilisation dans différents modèles de chirurgie de la colonne vertébrale.

Figure 5
Figure 5: repères chirurgicaux et la préparation de l'hémi-contusion lésion de la moelle épinière cervicale. Figures A et B décrivent les monuments correctes pour impa bonalignement de ct sur le rat exposé moelle épinière. Le point d'impact appropriée est directement entre les dorsales racines C5 et C6 nerveuses (rostrale-caudale) et la ligne médiane et les bords latéraux de la moelle épinière (B). Montrer les statistiques de la CE, au plus fort grossissement, le processus d'exposition de la moitié souhaitée de la moelle épinière cervicale en cas de blessure, par laminectomie unilatérale prudent. En outre, les chiffres D et E démontrer le cordon immédiatement avant et après la moelle épinière des blessures par contusion. Remarque l'hémorragie visible (E) causée par l'impact (flèche noire).

Figure 6
Figure 6 :. Des exemples de acceptables par rapport lectures de données inacceptables suivantes impact avec l'impacteur NYU / Mascis. Le graphique du haut (A) et le haut ensemble de données (C) (B) et erreur lors de "réduction à zéro" de la tige du pendule et la pointe sur la surface de la moelle épinière, avant de fixer la hauteur de la tige d'impacteur (C). Notez l'erreur considérable indiqué pour la hauteur initiale et l'heure de début de la chute de frappe, comme indiqué par la flèche rouge et souligner. Le logiciel fournit également un avertissement que l'erreur a été détectée pour ces paramètres (en bas du panneau C).

Discussion

Ici, nous avons démontré une méthode de stabilisation cervicale de la colonne vertébrale pour la production unilatérale contondante SCI à C5. Ce procédé de stabilisation augmente la précision du traumatisme anatomiquement compatible et produit des déficits fonctionnels 13,18. En d'autres modèles qui se appuient sur dorsale serrage des apophyses épineuses, le risque de dommages de processus épineux ou de détachement des pinces de la vertèbre est assez élevé. Ces modèles peuvent également permettre à la colonne vertébrale considérable décalage et rendement de la force de contusion et de la nature flexible de la colonne vertébrale et les colonnes vertébrales (figure 1A et B). Le tissu rendement modifie le temps et les résultats en vigueur des blessures imprévisibles (figure 1A-B & 6B) de contact plongeur-tissu. Notre stabilisation vertébrale décrit fournit également d'autres avantages à la préparation chirurgicale: 1) cette méthode stabilise entièrement centrée sur les vertèbres C5 sous lamicroscope chirurgical qui augmente la précision des laminectomies (figure 1c); 2) l'animal monté dans le stabilisateur en forme de U peuvent être prises directement à partir de l'emplacement de chirurgie à la fixation de montage personnalisé, ce qui évite la procédure de remonter l'animal sur les appareils SCI et de gagner du temps; et 3) stabiliser les vertèbres au niveau de la blessure et dorsale et caudale directement au site souhaité de blessure peut grandement diminuer le déplacement du corps causé par la respiration, une autre mesure afin de réduire la variabilité.

Le principal avantage de l'utilisation de ce procédé de stabilisation est la quantité réduite de rendement, ou mouvement ventrale de la moelle épinière et de la colonne lors de l'impact. Basé sur la physique simple d'une blessure à une contusion, la force et l'énergie de l'impact seront transférés de la tige à la moelle épinière, idéalement avec l'absorption de cette énergie sur le site de l'impact cordon. Toutefois, si les rendements de la colonne vertébrale au-dessous du cordon, comme ce est possibledans le procédé de serrage épineuse dorsale (figure 1A et B), la force réelle appliquée à la corde est réduite et variable, en fonction du degré de rendement.

Bien que cette vidéo illustre l'ensemble de la procédure d'un modèle SCI contondante col de l'utérus, l'essence de cet article est l'introduction de la méthode de stabilisation vertébrale nous utilisons dans diverses applications dans notre laboratoire, en particulier pour les études SCI. Une version modifiée de ce dispositif de stabilisation et le procédé a été utilisé sur des souris 23 SCI. Cette méthode simple de la stabilisation de la colonne vertébrale est très utile pour la recherche SCI, et nous avons déjà utilisé cette méthode et l'équipement pour effectuer une contusion thoracique ainsi que des modèles de SCI lacération. Un autre laboratoire a récemment décrit une variante de cette forme de stabilisation des lésions cervicales dans ce journal 22. En résumé, nous introduisons cette nouvelle méthode de stabilisation vertébrale à plusieurs Surgicprocédures al pour générer reproductible SCI expérimentale allant de laminectomie à la production des blessures. Les avantages de ce dispositif de stabilisation ne sont pas limités à col contusion de la moelle épinière, car cette méthode de stabilisation a été adapté pour une grande variété d'expériences telles que les injections intra-rachidiennes, la transplantation cellulaire, la collecte du LCR des cisterna magna, hémisection et transection blessures, blessures contusion thoracique, l'imagerie in vivo utilisant la microscopie à deux photons, et l'enregistrement électrophysiologique moelle. L'augmentation de la qualité des interventions chirurgicales et aux blessures de la colonne vertébrale et de réduire la variabilité expérimentale permettra de fournir un aperçu de véritables mécanismes de blessure et de récupération, et l'écran les effets des différents traitements sur le désordre dévastateur de SCI.

Disclosures

Nous ne avons rien à communiquer.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé [NS36350, NS52290 et NS50243 à X-MX]; Fonds de dotation George Mari Hulman; l'État de l'Indiana; et un prix Ruth L. Kirschstein service national de recherches (NRSA) 1F31NS071863 à CLW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132
Dukal Gauze Sponges Fisher Scientific 22-415-490
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Webster Veterinary 07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450
Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261
Antiobiotic Ointment Webster Veterinary 07-877-0876
Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific 1006015
Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Surigical Scissors Fine Science Tools 15009-08
Scissors (blunt dissection) Fine Science Tools 14040-10
Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
Large Forceps Fine Science Tools 11024-18
Fine Forceps Fine Science Tools 11223-20
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade #15 Fisher Scientific 10015-00
EZ Clips Fisher Scientific 59027
Sterile sutures Fine Science Tools 12051-10
Instrument Sterilizer Fine Science Tools 14040-10
Surgical Stabilizer Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device Custom Manufactured W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience
Rutgers, The State University of New Jersey
e-mail: impactor@biology.rutgers.edu

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