Immunology and Infection

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Summary

シトロrodentium感染腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。

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Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

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Abstract

このプロトコルは、感染症や大腸炎の堅牢なモデルを生成するために必要な手順と同様に、マウスでシトロrodentium感染特徴付けるために使用方法を概説します。C. rodentiumは密接臨床的に重要なヒト病原体の病原性大腸菌に関連しているグラム陰性、マウスの特定の細菌性病原体である大腸菌と腸管出血性大腸菌大腸菌Cと感染時にrodentium、免疫応答性マウスは、ささやかな、一時的な体重減少と下痢に苦しんでいます。組織学的には、腸陰窩の伸長、免疫細胞の浸潤、および杯細胞の枯渇が観察される。感染のクリアランスは3〜4週間後に達成される。感染後の異なる時点で腸上皮バリアの完全性、細菌負荷、および組織学的損傷の測定は、感染に感受性マウス系統の特性評価を可能にします。

病原性機構細菌の病原体は、そのホストの腸管を植民地と同様に、このような感染症から身を守る、特定のホストの応答が十分に理解されてs。したがってC.腸内細菌感染のrodentiumモデル 、これらのプロセスの我々の理解を助けるための貴重なツールとして機能します。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患(IBDs)にリンクされている。これは、IBD患者で見られる不適応な慢性炎症性応答が腸内細菌に腸の粘膜免疫系の異常な暴露後遺伝的に感受性の個人で開発したという仮説が立てられている。したがって、感染性大腸炎のモデルの研究では、腸内細菌への潜在的病原宿主応答を定義するための大きな可能性を提供しています。C. rodentium誘発性大腸炎は、IBDの病因の潜在的なメカニズムの理解を促進し、腸内細菌に対する宿主応答の解析が可能になり、そのような希少なモデルです。小説の予防や治療法の開発に欠かせない。

Introduction

腸内細菌の病原体による感染症は、下痢や腸上皮バリア機能障害を含むだけでなく腸の病理と病態生理として、消化管(GI)炎症をトリガします。細菌の病原体は、そのホストの消化管と同様に、このような感染症から身を守る特定の宿主応答を植民地になることによって病原性のメカニズムがよく理解されていない、腸内細菌感染症のモデリングでしかし最近の進歩は、これらのプロセスの理解を助けるために始めている。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患(IBDs)にリンクされている。 IBDsクローン病(CD)とUCは慢性腸の炎症や組織の損傷によって特徴付けられる原因不明の複雑な疾患である。腸炎の多くのマウスモデルは、IL10などの遺伝的に改変された菌株での自発的な炎症から、存在している - / - マウスでは、化学の課題に対するデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)やdのような化合物とinitrobenzeneスルホン酸(DNBS)1。これは、IBD患者に存在する不適応な慢性炎症性応答は感染性大腸炎のモデルの研究はまた、潜在的に病原性のホストを定義するための大きな可能性を提供していますので、腸内細菌に腸管粘膜免疫系の異常被ばくによって遺伝的に感受性の個体で2を開発するという仮説が立てられている。腸内細菌への応答シトロrodentium誘発性大腸炎は、腸内細菌とIBDの病因の潜在的メカニズムのさらなる理解への宿主応答の解析を可能にする、よく1,3特徴付けられている感染性大腸炎の希少なモデルの一つであり、不可欠なステップ小説予防及び治療処置を開発インチ

C. rodentiumは密接重要なヒトに関連している(/ E)はグラム陰性取り付けると控えめ、ネズミ特有の細菌性病原体である病原体の病原性大腸菌大腸菌 (EPEC)及び腸管出血性大腸菌大腸菌 (EHEC)3-8。 / Eの病原体の家族が親密に宿主細胞上の非侵襲的な台座のような構造を形成し、盲腸と結腸上皮の根尖宿主細胞膜に付着。 Cと経口チャレンジ10 8 -10 9生物のrodentiumは陰窩、単核球の免疫細胞浸潤および杯細胞枯渇3,4の大腸過形成または伸長によって特徴付けられる感染性大腸炎の堅牢なモデルを生成します。植民地化の初期のサイトでは、数時間チャレンジ後、盲腸のパッチで2〜3日後に感染3遠位結腸に進行が続いています。免疫応答性マウス系統では、病原体のクリアランスは3〜4週間感染1,3,4後に達成される。しかし、多くの遺伝的に改変された菌株、 すなわち遺伝子欠損またはノックアウト( - / - )マウスは、increaを表示することが見出されている誇張された損傷および/ ​​または慢性の感染症や炎症9-14の結果感染に対する感受性をセッド。これらのノックアウト株ではこの感染性大腸炎モデルの使用は、生得的なシグナル伝達タンパク質を欠いている多くは、腸の感染症や炎症の解決に不可欠ないくつかの宿主タンパク質を明らかに不可欠となっています。

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Protocol

1。 シトロrodentium接種およびマウスの経口胃管栄養の準備

  1. 準備し、オートクレーブルリアベルターニ培地(LB)。
  2. 実行可能なCを得る滅菌白金耳またはピペットチップを用いてLB寒天プレート上に凍結グリセロールストックとストリークからrodentium。 37℃で一晩インキュベートする。接種ループまたはピペットチップを用いてLBプレートからコロニーを持つファルコン培養管の滅菌LB培地3 mlを接種する。接種物の調製は、無菌技術を使用して行われるべきである。
  3. Cをインキュベートrodentium文化好気的に37℃、200rpmでベンチインキュベーションシェーカーで一晩。接種LBブロスは、一晩培養した後に濁って見えるはずです。
  4. 、100μlの各マウスを強制経口投与した1mlシリンジに取り付け胃管栄養針をひっくり返した電球を使用して、 rodentium文化 。しっかりと首と背中の上にたるんだ皮膚をつかんで優しく首筋マウスを、親指と指を使って。頭部を固定し、強制給餌針の挿入のための食道をまっすぐに人差し指で動物の頭を後ろに引きます。
  5. 直立姿勢でマウスを維持し、その口の側面に沿って、その舌の上に強制飼養針のバルブ先端を向ける。そっと口の屋根に沿って針を渡し、食道の下のそれを進める。この手順の中で感じた何らかの抵抗がある場合は、強制飼養針を取り外し、それを再挿入してください。
  6. ゆっくり細菌接種の100μlを注入し、静かに強制飼養針を外します。そのケージに戻した後、マウスの呼吸と動作を監視します。

注意:

  • ステップ2および3で、またスープ自体のない細菌汚染がないことを確実にするために一晩培養する無菌LBブロス3mlで無菌技術を用いて鷹の培養管を準備します。 LBブロスで一晩培養した後に明らかに表示されます。
  • それが24時間以上にわたって接種されている場合は一晩培養した培養液は捨てられるべきです。
  • すべてのC. rodentiumの感染や感染動物の筐体は、バイオセーフティレベル2の施設で実施されなければならない。

2。 Cの結腸上皮関門透過性を測定するrodentium感染マウス

  1. 所望の時点、感染後に障壁の完全性を測定します。
  2. アッセイ当日、4 kDaのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)デキストランは150μlの各マウスを強制経口投与し、標準曲線を準備するために80ミリグラムミリリットル-1の濃度になるように生理食塩水(PBS)に溶解し、リン酸緩衝十分な準備をします。
  3. FITC-デキストラン150μlの首筋マウスと強制経口投与。この時点でケージから餌を撤回します。
  4. 4時間後にマウスを麻酔gavagingと心臓穿刺を介して、できるだけ多くの血液(約450μl)のように収集しています。血液凝固を阻止するためにマイクロチューブに3パーセント酸 - クエン酸デキストロースの最終濃度に血液を追加します。マウスを安楽死させると細菌数(ステップ3.1から3.5)をPBS中結腸組織を収集し、組織固定のためにホルマリン、最終的には免疫蛍光染色10%(ステップ4.1から4.8)であった。
  5. 4℃で遠心機で12分間、1,000×gで血液サンプルをスピン血清を採取し、PBS中の1/10、1/100に希釈します。複製し、96ウェルプレートに、これらの2つの希釈で各試料100μlを加える。
  6. 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μg/ mlの:標準曲線を準備するには、以下の濃度になるようにPBSでマウスを強制経口投与するために使用した元の80ミリグラムml -1の FITC-デキストランを薄める。三重で96ウェルプレートに各濃度の100μlを添加する。
  7. wavファイルで励起蛍光光度計を用いて、各サンプルの蛍光を定量485nmおよび535nmの発光波長のelength。
  8. 標準曲線をプロットすることにより、生データを分析します。入力各サンプル中のFITC-デキストランの濃度を決定するために標準曲線によって生成された直線の方程式に各サンプルの生データ。

注意:

  • 手順4以降では、氷の上に血液サンプルを保持し、光への曝露を最小限に抑えます。
  • 重篤な組織損傷がこのポイントの後に発生するようにした時点で、または前に上皮バリアの完全性を測定する場合は、7日後の感染症は、最適です。深刻な被害が出現する前に、障壁の完全性を測定することは、あなた Cの間に透磁率の最大の違いを判別することができマウス系統間でrodentium感染
  • 感染していないコントロールマウスも上皮バリアの完全性のためにテストされていることを確認します。

3。 Cの組織における細菌負荷の測定rodentium感染マウス

  1. 1ミリリットル滅菌PBS追加ndはラウンドビーズオートクレーブした金属は無菌操作を用いて、2 mlの遠心チューブを底を打った。各動物から採取した個々の組織は、別々のPBSのチューブ内に配置されます。組織の添加前にチューブの重量を量る。
  2. マウスの盲腸および結腸を削除します。結腸から盲腸を分離し、鉗子を用いて管腔内容物を押し出す。 PBSのチューブにコンテンツを追加します。 10%ホルマリン固定のために遠位結腸と盲腸から0.5cmのセクションを分離した後、縦方向に残存結腸と盲腸を開き、チューブに組織を配置する前に、滅菌PBSで洗浄カット。
  3. 組織をPBSチューブを計量した後、30 Hzで6分間ビーズビーターを使用してサンプルをホモジナイズする。
  4. 無菌技術を用いて、96ウェルプレートにウェル当たり180μlの滅菌PBSを追加します。各行の最初のウェルに各均質化したサンプル20μlを添加する。よく混和して、連続的に希釈し、10 -1(最初の我々から希釈液を得るために、各ウェル以前から20μlを添加10 -6〜LL)。グリッド付きの正方形の底のLBプレートに三連で各試料からの各希釈液10μlをプレート。 37℃で一晩インキュベート℃、
  5. 次に平均コロニー形成単位(CFU)、3カウントを数えて、各サンプルがカウントされたときの希釈を記録します。オリジナル1mlの試料20μlを使用したのと、50で平均CFUを掛けて、サンプルはCFU / mlで、結果としてカウントされたときの希釈率。最後に、CFU / gを決定するために組織重量で割る。

4。組織学的評価と感染結腸組織の免疫蛍光染色

  1. ステップ3.2のように組織を採取します。ホルマリンで一晩ストア組織は、その後、70%エタノールで洗浄してください。パラフィンの組織を埋め込むと染色に5μmの切片を切った。組織学的評価のためにヘマトキシリン​​·エオシン染色および免疫蛍光染色のため、次のステップに進みます。
  2. 場所のスライドで、前染色組織を脱パラフィンする65 10分間℃の水浴中でコプリン染色壺を置く。次に、2分間ずつ4回の洗浄のためにキシレンのプレーススライド。 95%エタノール、75%エタノールとdH 2 0:スライドは、次のそれぞれに1 5分間洗浄に続いて100%エタノールで2つの5分間の洗浄、再水和されるべきである。これらの洗浄は有害な蒸気への暴露を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。
  3. あらかじめ温めておいたクエン酸ナトリウム緩衝液、その後30分間蒸し器に場所とコプリンジャーに入れ、スライドは、その後30分間放置します。このプロセスは、潜在的な抗原部位を取り出すホルマリン固定により形成されたタンパク質のクロスリンクが解除されます。
  4. 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。 PAPのペンで組織の周りに乾いたスライドやマーク領域は、組織に局在染色試薬を維持し、疎水性の障壁を作成することができます。
  5. 免疫染色水分チャンバ内のブロッキングバッファーを用いて室温で1時間( 例えば 、α-ヤギ血清)のブロック組織。
  6. 堅苦しい薄める抗体希釈バッファーを使用して所望の濃度に進抗体。ブロッキングバッファーを捨て、組織に一次抗体を50から100μlを添加する。 2時間4℃で一晩または室温でインキュベートする。
  7. 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする組織や抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の50〜100μlを添加する。 5分間、3回のdH 2 Oで洗浄します。
  8. DAPIはゴールドマウント培地を延長し、カバースリップを適用追加、スライドを脱水。蛍光顕微鏡下でスライドを表示します。

注意:

  • PBSアジドは、ステップ4以降の洗浄培地で細菌の増殖を回避するための代替として新たに調製し、PBSで置換することができる。

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Representative Results

標準的な感染実験では、マウスは、100μlの一の強制経口投与によって、約2.5×10 8 CFUに感染しているrodentium文化CとC57BL / 6マウスの感染ささやかな、一時的な体重減少と下痢でrodentium結果 。 C57BL / 6マウスを持つまれな出来事が、動物が病気になると安楽死が必要な場合があります。したがって、マウスは異なる株が感染症の影響を受けている程度を判断するために、体重減少などpiloerect毛皮や猫背の姿勢などの苦痛の症状の程度を監視する必要があります。

図1〜図4に示された結果は、凍結グリセロールストックから調製した一晩培養した培養液を使用して行う感染症の代表的なものである。 7日、感染後に、マウスを麻酔し、血液が心臓穿刺を介して収集された。血清で測定図1 FITC-デキストランC57BL / 6マウスのと同様に、以前に感染9時に損なわ上皮バリアの完全性を示すことが見出された受容体2(TLR2)ノックアウトマウス、Toll様から。無傷の腸上皮バリアの存在下で、4 kDaのFITC-デキストランは、この層を通って貧弱透過性である。したがって、血清中のFITC-デキストランのレベルの増加は、この分子が通過を許可感染中腸上皮バリアの完全性の障害を示唆している。コントロールとして、FITC-デキストランと強制経口感染していないマウスの血清レベルも表示されている。

一週間後の感染によって、大腸内の細菌の負荷が10 9 CFU / gの3,4付近にピークが見出されている。細菌負荷は、感染を確認するためだけでなく、さまざまなノックアウトマウスが増加または減少した細菌負担に苦しむかどうかを評価する目的の時点、感染後に測定することができる。 Cなどrodentiumができ密接ADH腔の病原体である腸上皮細胞、管腔の内容物における細菌負荷、盲腸および結腸の組織へのEREを測定することができます。 図2は、C57BL / 6マウスの腸内腔の中だけでなく、一日で7感染後盲腸と結腸組織を測定した典型的な細菌負荷を示していますマウス。

病理学のほとんど Cの間に観察さC57BL / 6マウスにおけるrodentium感染 colon11の先端2 cmで発生します。肉眼的に、7日後の感染によって、結腸粘膜の肥厚ならびに大腸の長さの短縮は、C57BL / 6マウスに見られるように少しあからさまなダメージと、観察される。通常、感染の際に、C57BL / 6マウスは、免疫細胞の浸潤、結腸陰窩および杯細胞の減少( 図3)の伸長によって組織学的特徴のみ中等度の炎症および病理に苦しむ。

図3のH&Eセクションに見られるように、いくつかのホストの応答がDUR搭載されているCとる感染rodentium。さらに、これらの変化を特徴づけるために、免疫蛍光染色は、細胞増殖、細胞死、あるいは自然免疫と獲得免疫応答のマーカーとして、目的のタンパク質の変化を調べるために利用することができます。免疫蛍光染色は、感染した組織内での局在などの細菌の応答の側面を検討する上でも、貴重なものです。この染色法の例は、ホストタンパク質Ki67の(赤)、細胞増殖および Cのマーカーを調べる12日目、感染後に細菌の局在を調べるためrodentiumタンパク質TIR、緑は、 図4に示されている。

図1
図1。上皮バリアの完全性を評価するための血清FITC-デキストラン。マウスの測定があった血清FITC-デキストランレベルが決定された後に、感染していない条件下で4 kDaのFITC-デキストランとし、感染後7日目の強制経口投与。 C57BL / 6マウス(WT)マウスは、感染していない条件と比較して7日、感染後にFITC-デキストラン血清レベルで無視できる程度の増加を示す。これとは対照的に、TLR2 - / -マウスは、C.時、この株で著しく損なわ障壁の完全性を示唆しているベースラインと比較して、血清中のFTIC-デキストランの大幅に増加したレベルを持っているrodentium感染 、前述のように示されている。

図2
図2 でrodentium内腔、盲腸内の負荷、および7日後の感染で感染したC57BL / 6マウスのコロン。ルーメン、盲腸および結腸組織は、収集ホモジナイズし、LB寒天上でシリアル希釈で播種した。各Circleは、個々の動物から採取し、単一のサンプルを表しています。垂直のエラーバーはSEMを示すものが実線は幾何平均を示す。

図3
図3。 C.による被害の組織学的分析rodentium感染 7日目、感染後適度な免疫細胞の浸潤、ならびに陰窩の伸びでは、杯細胞の枯渇と軽度の浮腫が感染していない組織を制御するために比較して観察されています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図4
図4。感染していないと、12日後の感染で免疫蛍光染色C57BL / 6マウスの接合部組織。遠位結腸組織が ​​宿主タンパク質Ki67の(赤) Cのために染色されているrodentiumタンパク質TIR(緑)。

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Discussion

シトロrodentium感染は、感染症およびマウスにおける大腸炎の両方を研究するための貴重なモデルを提供します。このユニークなモデルは、両方のホストの応答だけでなく、細菌の病原性の性質の特徴付けを可能にします。手順では、このプロトコルの詳細は、このモデルの成功した使用を概説した。

大腸炎を誘発し、応答を解析するときに留意すべきは、このプロトコルにはいくつか重要なステップがあります。まず、新鮮な一の準備LBブロスでrodentiumの接種は、マウスの正常な感染症のために必要です。 10 8 -10 9生物の線量が接種をシェーカーにまたは長期間室温でベンチの上に残っている場合、マウスのほとんどの株を感染させるために必要とされるように、文化の中で残っている十分な生菌が存在しません感染時に大腸炎を誘導した。それは前に細菌接種を攪拌することも重要である各マウスは、細菌の等しい線量を受けることを保証するために、感染症のために注射器をロードする。感染の末端上に組織を採取する際、発生することが適切な組織固定のために必要とされる10%ホルマリンの十分なボリュームで結腸組織の水没を完了します。それは組織が5mlのバイアル中ではなく、組織への定着剤の10:1の比率としてマイクロ遠心チューブにホルマリンを添加することが提案されていることをお勧めします。適切な固定は後で組織学的分析と同様に、これらの組織の免疫蛍光染色のために不可欠です。それは別のノックアウト株はCの誘導時に応答を変えることになることに留意することも重要ですrodentium性大腸炎。初めて新型インフルエンザに感染すると、マウスは密接に必要に応じて、実験のために人道的エンドポイントを決定するために監視されるべきである。上皮バリアの完全性、細菌負荷、および組織学的分析のための時間ポイントは、マウスの応答に基づいて定義することができます感染症への関心のひずみ。

細菌負荷を決定するLBプレート上の組織ホモジネートのメッキはCに対してPCRを行う、完全に選択的な方法ではありませんように細菌コロニーにrodentium特定の遺伝子がCを区別するために行うことができます皿の上に他のbacterialcoloniesからrodentium。この媒体はCのより選択的であるとして、もう一つのオプションは、マッコンキー寒天培地上で平板組織ホモジネートにあるLB寒天よりrodentium。別のアプローチは、ストレプトマイシン耐性野生型Cを使用することですストレプトマイシン耐性株とrodentiumひずみ instead.Substitutionは、このプロトコルで説明したのと同じ大腸炎モデルの誘導になります。これらの感染から組織ホモジネートがストレプトマイシンのではなく、単独でLB寒天を添加したLB寒天上にめっきすることができるようにストレプトマイシン耐性株を使用することの利点は、細菌負荷のより容易な分析のためのものです。これはcommの潜在的な成長を回避CFUカウント処理をより簡単に、より正確な製版上ensal微生物。別の代替細菌負荷を測定しながらでは、カウントされる前に、遅い細菌の増殖で、その結果、2〜3日°Cで一晩または室温でのどちらかで37 LB寒天上で組織ホモジネートの希釈液をめっき後にプレートをインキュベートすることである。

このプロトコルは、感染性大腸炎の堅牢なモデルを生成するために必要な手順の概要を説明し、同様にCを特徴づけるために使用される方法マウスでrodentium感染 。余談病原体 - 宿主相互作用と免疫応答を調べるために、このモデルを使用してから、それはまた、細菌感染が大腸がんのリスクを高めることができますどのように勉強するために使用することができます。これは、Cを露光することにより行うことができます発癌物質アゾキシメタンへの、または上皮細胞増殖にどのように感染症の影響を研究することによって、または上皮細胞分化や腫瘍発生15に関与する遺伝子でrodentium感染マウス。私達このプロトコルで概説感染性大腸炎モデルING、細菌数はまた、腸間膜リンパ節、脾臓、肝臓などの腸管外のサイト、で評価することができる。これらの臓器におけるより大きな数字は、テストされているマウス系統は、感染の影響を非常に受けている可能性があります。説明免疫蛍光染色法を用いて、感染に応答メカニズムの事実上無限の数は、探索することができます。ここで詳述技法に精通したら、プロトコルは、より徹底的にCへの応答を特徴づけるために、このような遺伝子発現レベルのRNA抽出と評価のためのような他のエンドポイントを、測定するために組織を採取するように変更することができrodentium感染

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Disclosures

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、クローン病と潰瘍性大腸炎カナダの財団(CCFC)と健康研究(CIHR)のためのカナダの研究所からBAV、営業の補助金によって支えられている。 GBはCIHR卒業学生の身分によって賄われていた。 BAVは、小児消化器病の小児IBDの研究カナダリサーチチェアの腸管と肝疾患(子)財団議長児です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

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References

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