O

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de doença infecciosa e colite, bem como os métodos utilizados para caracterizar Citrobacter rodentium infecção em ratinhos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa, patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com a importância clínica humana patógenos enteropatogênica E. coli entero-e E. coli. Após a infecção com C. rodentium, ratos imunocompetentes sofrem de perda de peso modesta e transitória e diarréia. Histologicamente, alongamento cripta intestinal, infiltração de células imunes, e depleção de células caliciformes são observados. Eliminação da infecção é conseguida ao fim de 3 a 4 semanas. Medição da integridade da barreira epitelial intestinal, a carga bacteriana, ou de lesões histológicas em diferentes momentos após a infecção, permitiu a caracterização de estirpes de ratinho susceptíveis à infecção.

O mecanismo de virulências por agentes patogénicos bacterianos, que colonizam o tracto intestinal de hospedeiros, bem como as respostas específicas de acolhimento que defendem contra essas infecções são pouco compreendidos. Por conseguinte, a C. rodentium modelo de infecção bacteriana entérica serve como uma ferramenta valiosa para ajudar a nossa compreensão desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Postula-se que as respostas inflamatórias crónicas adaptativos observados em pacientes com DII desenvolver, em indivíduos geneticamente susceptíveis, após a exposição anormal do sistema imune da mucosa intestinal de bactérias entéricas. Assim, o estudo de modelos de colite infecciosa oferece um potencial significativo para a definição de respostas do hospedeiro potencialmente patogénicos em bactérias entéricas. C. rodentium colite induzida é um tal modelo raro que permite a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas, promovendo a nossa compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD;essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

Introduction

Infecção por agentes patogénicos bacterianos entéricos desencadeia a inflamação gastrointestinal (GI), bem como a patologia do intestino e fisiopatologia, incluindo a diarreia e disfunção da barreira epitelial intestinal. Os mecanismos de virulência de patógenos bacterianos que colonizam o trato gastrointestinal de seus hospedeiros, bem como respostas de acolhimento específicas que defendem contra essas infecções são mal compreendidos, no entanto avanços recentes na modelagem de infecções bacterianas entéricas começaram a ajudar o nosso entendimento desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Doença de Crohn IBDS (CD) e UC são doenças complexas de etiologia desconhecida, caracterizada pela inflamação intestinal crônica e dano tecidual. Muitos modelos de rato de inflamação intestinal existe, a partir de inflamação espontânea em estirpes geneticamente modificados, tais como a IL-10 - / - de ratos, aos desafios químicos com os compostos, tais como o sulfato de sódio de dextrano (DSS) e dinitrobenzene sulfico (DNBS) 1. Há a hipótese de que os desajustados respostas inflamatórias crônicas presentes em pacientes com DII desenvolver em indivíduos geneticamente susceptíveis após a exposição anormal do sistema imunológico da mucosa intestinal de bactérias entéricas 2, portanto, o estudo de modelos de colite infecciosa também oferece um potencial significativo para definir potencialmente patogênica anfitrião . respostas a bactérias entéricas Citrobacter rodentium colite induzida é um dos modelos de colite infecciosa raras que tem sido bem caracterizados 1,3, permitindo a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas e uma maior compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD, um passo essencial no desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

C. rodentium é uma bactéria gram negativa e anexando effacing (A / E), patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com o humano importantepatógenos enteropatogênica E. coli (EPEC) e E. enterohemorrágicas coli (EHEC) 3-8. A família de agentes patogénicos A / E intimamente anexar à membrana apical da célula hospedeira do epitélio do ceco e do cólon, formação de uma estrutura não-invasivo pedestal semelhante sobre a célula hospedeira. Desafio oral com C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produz um modelo robusto de colite infecciosa caracterizada por hiperplasia do cólon ou alongamento das criptas, infiltração de células mononucleares imunológico e esgotamento das células caliciformes 3,4. O sítio inicial da colonização, algumas horas após o desafio, é no remendo cecal, seguido de progressão para o cólon distai 2 a 3 dias após a infecção 3. Em estirpes de murganhos imunocompetentes, a depuração do agente patogénico é alcançado 3 a 4 semanas após a infecção 1,3,4. No entanto, muitas estirpes geneticamente modificados, ou seja deficiente ou gene knockout (- / -), ratinhos, foram encontrados para exibir aumensed susceptibilidade à infecção, resultando em danos exagerados e / ou infecção crónica e inflamação 9-14. A utilização deste modelo de colite infecciosa nessas estirpes knockout, muitas proteínas de sinalização deficiente inatas, tem sido indispensável para revelar proteínas hospedeiras várias integrais para a resolução da infecção e inflamação intestinal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação do inoculo e Citrobacter rodentium gavagem oral de ratos

  1. Preparar e autoclave caldo Luria Bertani (LB).
  2. Obter C. viável rodentium a partir de um estoque de glicerol congelados e raia na placa LB agar usando um loop de inoculação estéril ou pipeta. Incubar a 37 ° C durante a noite. Inocular 3 ml de caldo LB estéril num tubo de cultura com falcon colónias da placa LB usando uma ansa de inoculação ou a ponta da pipeta. Preparação do inoculo deve ser feita utilizando técnicas assépticas.
  3. Incubar a C. cultura rodentium aerobicamente a 37 ° C durante a noite num agitador de bancada de incubação a 200 rpm. O caldo LB inoculado deve aparecer turva após cultura durante a noite.
  4. Use uma lâmpada de ponta de agulha gavagem gástrica ligada a uma seringa de 1 ml para cada rato gavagem com 100 ul da noite para o dia C. cultura rodentium. Gentilmente scruff o mouse, segurando firmemente a pele solta sobre o seu pescoço e costascom o polegar e os dedos. Puxe a cabeça do animal com o dedo indicador para imobilizar a cabeça e endireitar o esôfago para a inserção da agulha de gavagem.
  5. Manter o rato na posição vertical, e dirigir a ponta da agulha de bulbo gavagem ao longo do lado da boca e sobre a língua. Gentilmente passar a agulha ao longo do céu da boca e avançá-lo para o esôfago. Se houver qualquer resistência sentida durante este procedimento, remova a agulha gavagem e insira-o novamente.
  6. Lentamente, injectar 100 ul do inóculo bacteriano e retire cuidadosamente a agulha de gavagem. Monitore a taxa de respiração e comportamento do mouse após o retornar à sua gaiola.

Notas:

  • Nos passos 2 e 3, também se preparar um tubo de cultura falcon usando técnicas assépticas, com 3 ml de caldo LB estéril a ser cultivadas durante a noite para assegurar que não existe contaminação bacteriana do caldo de si. O caldo LB deve aparecer claro após cultura durante a noite.
  • Cultura durante a noite deve ser descartado se tiver sido inoculado durante mais 24 hr.
  • Todos C. infecções rodentium e habitação de animais infectados devem ser realizadas em um Nível de Biossegurança 2 instalações.

2. Medindo a permeabilidade da barreira epitelial do cólon em C. rodentium infectadas Mice

  1. Medir a integridade da barreira num ponto de tempo desejado após a infecção.
  2. No dia do ensaio, preparar suficiente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano dissolvido em tampão fosfato salino (PBS) a uma concentração de 80 mg ml -1 de gavagem a cada rato com 150 ul e para preparar a curva padrão.
  3. Rato da nuca e gavagem com 150 uL de FITC-dextrano. Retirar os alimentos do compartimento no momento.
  4. Anestesiar ratos 4 horas apósgavaging e recolher tanto sangue quanto possível (~ ul 450) através de punção cardíaca. Adicionar o sangue até uma concentração final de 3% de dextrose ácido-citrato em um tubo de microcentrífuga para impedir a coagulação. Eutanásia os ratos e coletar tecidos de cólon em PBS para contagem bacteriana (passos 3,1-3,5) e em formalina a 10% para fixação dos tecidos e, finalmente, imunofluorescência (passos 4,1-4,8).
  5. Girar as amostras de sangue a 1000 xg durante 12 min numa centrífuga a 4 ° C. Recolher o soro e dilua para 1/10 e 1/100 em PBS. Adicionar 100 uL de cada amostra a estas duas diluições numa placa de 96 poços em repetições.
  6. Para preparar a curva padrão, diluir o original 80 mg ml -1 de FITC-dextrano utilizado para gavagem os ratos em PBS com as seguintes concentrações: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng / ml . Adicionam-se 100 ul de cada concentração de uma placa de 96 cavidades em triplicado.
  7. Quantificar a fluorescência de cada amostra, utilizando um fluorímetro de uma excitação wavelength de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm.
  8. Analisar os dados brutos traçando a curva padrão. Introduzir os dados em bruto para cada amostra para a equação da linha gerada pela curva padrão para determinar a concentração de FITC-dextrano em cada amostra.

Notas:

  • Para a partir do passo 4, manter as amostras de sangue em gelo e minimizar a exposição à luz.
  • Quando se mede a integridade da barreira epitelial um ponto no tempo, ou antes, 7 dias após a infecção é o ideal, como dano tecidual grave ocorre após este ponto. Medindo a integridade da barreira antes da ocorrência danos graves permite determinar diferenças máximas na permeabilidade durante C. infecção rodentium entre linhagens de camundongos.
  • Assegure-se que os ratinhos de controlo não infectados, são também testados para a integridade da barreira epitelial.

3. Medição da carga bacteriana em tecidos de C. rodentium infectadas Mice

  1. Adicione 1 ml de PBS estéril umand um metal autoclavado talão para um fundo redondo 2 tubo de centrífuga ml, utilizando técnica asséptica. Tecidos obtidas de cada animal serão colocados em tubos separados PBS. Pesar os tubos antes da adição do tecido.
  2. Retire o ceco e cólon a partir do mouse. Separa-se o ceco do cólon e empurrar para fora o conteúdo luminal utilizando fórceps. Adicionar o conteúdo para um tubo de PBS. Depois de separar seções 0,5 centímetros do cólon distal e ceco por 10% de fixação de formalina, cortou o restante do cólon e ceco longitudinalmente e lavar com PBS estéril, antes de colocar tecidos em tubos.
  3. Pesar os tubos PBS com o tecido e, em seguida homogeneizar as amostras usando um batedor de esferas durante 6 min a 30 Hz.
  4. Utilizando técnicas assépticas, adicionar 180 ul de PBS estéril por poço de uma placa de 96 poços. Adicionar 20 ul de cada amostra homogeneizada para o primeiro poço em cada linha. Misturar bem e diluir em série, a adição de 20 ul de cada poço anterior para se obter a partir de diluições de 10 -1 (primeira,ll) a 10 -6. Placa de 10 ul de cada diluição de cada amostra, em triplicado, numa placa de fundo quadrado LB com uma grelha. Incubar durante a noite a 37 ° C.
  5. Contagem de unidades formadoras de colónias (CFU), em seguida, calcular a média dos três contagens, e registar a diluição na qual cada amostra foi contada. Multiplicar CFU médio de 50, a 20 ul da amostra original 1 ml foi usado, e pelo factor de diluição à qual a amostra foi contada, resultando em CFU / ml. Finalmente, dividir pelo peso de tecido para determinar a CFU / g.

4. Avaliação histológica e imunofluorescência de tecidos infectados Colon

  1. Recolha de tecidos como descrito no passo 3.2. Tecidos lojas em formol durante a noite, em seguida, lavar com etanol 70%. Incorporar tecidos em parafina e cortadas secções de 5 | iM para a coloração. Mancha com hematoxilina e eosina para avaliação histológica e prossiga para os passos seguintes para técnica de imunofluorescência.
  2. Para tecidos deparaffinize antes da coloração, desliza em lugaruma tina de coloração Coplin e colocado em banho de água a 65 ° C durante 10 min. Em seguida, as lâminas em xileno para colocar quatro lavagens de 2 minutos cada. As lâminas devem então ser re-hidratadas com duas lavagens de 5 minutos em etanol a 100%, seguido de uma lavagem de 5 minutos em cada um dos seguintes: etanol a 95%, etanol a 75% e de dH 2 0. Estas lavagens devem ser feitas num exaustor de fumos, para evitar a exposição a vapores prejudiciais.
  3. Colocar as lâminas na jarra de Coplin com pré-aquecido tampão citrato de sódio e depois coloque em um navio a vapor por 30 minutos, em seguida, deixe descansar por 30 min. Este processo divide a proteína ligações cruzadas formadas por fixação em formalina recuperar os locais antigénicos potenciais.
  4. Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Lâminas secas e em torno da área do ponto de tecido com uma caneta PAP para criar uma barreira hidrofóbica, mantendo os reagentes de coloração localizadas no tecido.
  5. Bloco tecido durante 1 hora à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (por exemplo, soro de cabra-α) numa câmara de humidade a imunocoloração.
  6. Diluir primary anticorpo para a concentração desejada utilizando tampão de diluição do anticorpo. Verter o tampão de bloqueio e adicionar 50-100 uL de anticorpo primário para os tecidos. Incubar a 4 ° C durante a noite ou à temperatura ambiente durante 2 hr.
  7. Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Adicionar 50-100 uL de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição do anticorpo para os tecidos e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora, no escuro. Lavar com dH 2 O durante 5 minutos, três vezes.
  8. Desidratar slides, adicionar DAPI Prolongar meio de Ouro de montagem e uma lamela. Ver lâminas sob um microscópio de fluorescência.

Notas:

  • PBS azida pode ser substituído com PBS preparado de fresco como uma alternativa para evitar o crescimento bacteriano no meio de lavagem para a partir do passo 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Durante uma experiência de infecção padrão, os ratinhos são infectados com cerca de 2,5 x 10 8 UFC, pela via oral de 100 ul durante a noite C. cultura rodentium. Infecção de ratinhos C57BL / 6 com C. rodentium resultados na perda de peso modesta e transitória e diarréia. Embora uma ocorrência rara com C57BL / 6, os animais podem ficar doentes e necessitam de eutanásia. Portanto, os ratinhos devem ser monitorizados para o grau de perda de peso e os sintomas da aflição, tais como pele e piloerect postura arqueada, para determinar a extensão em que as diferentes estirpes são afectados pela infecção.

Os resultados apresentados nas Figuras 1 a 4 são representativos de uma infecção utilizando uma cultura feita durante a noite preparado a partir de um estoque de glicerol congelado. Aos 7 dias após a infecção, os ratinhos foram anestesiados e o sangue foi colhido por punção cardíaca. Figura 1 mostra FITC-dextran medido no sorode ratinhos C57BL / 6, bem como a partir do receptor Toll como ratos 2 (TLR2) knockout, que foram previamente encontradas para expor a integridade da barreira epitelial comprometida durante a infecção 9. Na presença de uma barreira epitelial intacta intestinal, 4 kDa FITC-dextrano é pouco permeável através desta camada. Portanto, aumento dos níveis de FITC-dextran no soro sugerem uma deterioração da integridade da barreira epitelial intestinal durante a infecção permitindo que esta molécula a vazar toda. Como um controlo, os níveis séricos em ratinhos não infectados gavaged com FITC-dextrano são também apresentados.

De uma semana após a infecção, as cargas bacterianas no cólon têm sido encontrados para o pico de cerca de 10 9 CFU / g 3,4. Cargas bacterianas pode ser medida em pontos de tempo desejado após a infecção para confirmar a infecção, bem como para avaliar se ratinhos knockout diferentes sofrem um aumento ou diminuição da carga bacteriana. Como C. rodentium é um agente patogénico que pode luminal intimamente adhere de células epiteliais intestinais, as cargas bacterianas nos conteúdos cecais luminais, e os tecidos do cólon pode ser medido. Figura 2 mostra as cargas bacterianas típicos medidos no dia 7 após a infecção dos tecidos cecal e do cólon, bem como no lúmen intestinal de C57BL / 6 camundongos.

A maior parte da patologia observada durante C. rodentium infecção em ratinhos C57BL / 6 ocorre nos dois centímetros distais do colon11. Macroscopicamente no dia 7 após a infecção, o espessamento da mucosa do cólon, bem como um encurtamento do comprimento do cólon observa-se, com danos pouco evidente visto em ratinhos C57BL / 6. Normalmente durante a infecção, os ratinhos C57BL / 6 sofrer apenas a inflamação moderada e patologia caracterizada histologicamente por infiltração de células imunitárias, o alongamento de criptas do cólon e depleção das células caliciformes (Figura 3).

Como visto nas secções H & E na Figura 3, as respostas de vários hospedeiros são montados during infecção por C. rodentium. Para caracterizar melhor estas alterações, imunofluorescência podem ser utilizados para examinar as alterações nas proteínas de interesse, tais como marcadores de proliferação celular, morte, ou inata e adaptativa respostas imunes. A coloração de imunofluorescência é também valiosa para examinar os aspectos da resposta de bactérias, tais como a sua localização no interior do tecido infectado. Um exemplo desta técnica de coloração, examinando uma série de proteínas Ki67 (vermelha), um marcador para a proliferação celular e a C. rodentium proteína tir, verde, para examinar a localização bacteriana no dia 12 pós-infecção, é apresentada na Figura 4.

Figura 1
Figura 1. Medição de soro FITC-dextrano para avaliar a integridade da barreira epitelial. Murganhos foramgavaged com 4 kDa FITC-dextrano, em condições não infectados e aos 7 dias pós-infecção, após o que no soro de FITC-dextrano foram determinados. C57BL / 6 (WT) ratinhos exibem um aumento insignificante dos níveis de FITC-dextrano no soro de 7 dias pós-infecção, em comparação com condições de não-infectados. Em contraste, o TLR2 - / - murganhos aumentaram significativamente os níveis de FTIC-dextrano no soro de linha de base em comparação com a integridade da barreira, sugerindo severamente prejudicada neste esforço durante C. rodentium infecção, como tem sido mostrado previamente.

Figura 2
Figura 2. C. carga rodentium no lúmen, ceco e cólon dos ratinhos C57BL infectado / 6 ratinhos aos 7 dias pós-infecção. Lumen, ceco, cólon e tecidos foram recolhidos, homogeneizada, e plaqueadas em série de diluição em ágar-ágar LB. Cada cIrcle representa uma única amostra coletada de animais individuais. As linhas a cheio indicam a média geométrica, enquanto as barras de erro verticais indicam SEM.

Figura 3
Figura 3. A análise histológica da lesão causada por C. infecção rodentium. pela infiltração de células dia 7 pós-infecção moderada imunológico, bem como o alongamento das criptas, depleção de células caliciformes e edema leve é observada em relação ao controle do tecido infectado. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4
Figura 4. A coloração de imunofluorescência em não infectados e 12 dias pós-infecçãotecidos de construção, de ratinhos C57BL / 6. tecido do cólon distai são coradas para a proteína do hospedeiro Ki67 (vermelho) e o C. rodentium proteína tir (verde).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de doenças infecciosas tanto em ratos e colite. Este modelo único permite a caracterização de ambas as respostas do hospedeiro, bem como as propriedades patogénicas de bactérias. As etapas descritas neste detalhe o protocolo de uso bem sucedido desse modelo.

Há vários passos críticos neste protocolo para manter em mente quando induzir colite e analisar as respostas. Em primeiro lugar, a preparação de um dia para o outro fresco C. rodentium inoculo em caldo LB é necessária para a infecção bem sucedida de ratinhos. Como uma dose de 10 8 -10 9 organismos é necessária para infectar a maioria das estirpes de ratos, se o inoculo é deixado no agitador ou no cimo da bancada à temperatura ambiente durante longos períodos de tempo, não haverá suficiente organismos viáveis ​​remanescentes na cultura para induzir a colite após infecção. Também é importante para agitar o inoculo bacteriano antescarregar a seringa para a infecção, para garantir que cada rato recebe uma dose igual de bactérias. Quando a recolha de tecidos após término da infecção, completar submersão dos tecidos do cólon em um volume suficiente de formalina a 10% é necessário para a fixação do tecido adequado para ocorrer. Sugere-se que os tecidos em formalina a ser adicionado num frasco de 5 ml, em vez de tubos de microcentrífuga como uma razão de 10:1 de fixador de tecido é recomendada. Fixação adequada é essencial para posterior análise histológica, bem como a coloração de imunofluorescência desses tecidos. Também é importante ter em mente que as cepas knockout diferentes têm diferentes respostas sobre indução de C. colite rodentium. Ao infectar uma nova estirpe, pela primeira vez, os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados para determinar um humano de ponto final para a experiência, se necessário. Os pontos de tempo para análise da integridade da barreira epitelial, cargas bacterianas, e histologia pode ser definido com base na resposta do ratinhoestirpe de interesse para a infecção.

Como revestimento de homogenatos de tecidos, em placas de LB para determinar cargas bacterianas não é um método totalmente selectivo, a realização de PCR para um C. rodentium gene específico em colônias de bactérias pode ser feito para diferenciar C. rodentium de bacterialcolonies outros na placa. Uma outra opção é a de homogenatos de tecido de placas de ágar de MacConkey, como este meio é mais selectivo para C. rodentium de agar LB. Uma abordagem alternativa é a utilização de um estreptomicina resistente do tipo selvagem C. instead.Substitution rodentium estirpe com uma estirpe resistente à estreptomicina irá resultar na indução da colite mesmo modelo descrito no presente protocolo. A vantagem de usar a estirpe resistente a estreptomicina é para facilitar a análise de cargas bacterianas, como a partir de homogenatos de tecido destas infecções podem ser plaqueadas em placas de agar LB suplementado com estreptomicina, em vez de ágar LB sozinho. Isso evita o crescimento potencial da commmicróbios ensal na placa, tornando o processo de contagem de UFC mais fácil e mais preciso. Outra alternativa ao medir as cargas bacterianas, é a incubar as placas após plaqueamento de diluições de homogenatos de tecido em placas de agar LB a 37 ° C durante a noite ou à temperatura ambiente durante 2-3 dias, resultando em mais lento o crescimento de bactérias, antes da contagem.

Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de colite infecciosa, assim como os métodos utilizados para caracterizar C. rodentium infecção em ratinhos. Além de utilizar este modelo para examinar as interacções patogénio-hospedeiro e as respostas imunes, pode também ser utilizado para estudar o modo como a infecção bacteriana pode aumentar o risco de cancro do cólon. Isto pode ser feito através da exposição C. rodentium ratos infectados ao carcinógeno azoximetano ou estudando como infecção impactos sobre a proliferação de células epiteliais, ou em genes envolvidos na diferenciação de células epiteliais ou o desenvolvimento do tumor 15. Nosção do modelo de colite infecciosa descrito neste protocolo, o número de bactérias podem também ser avaliados em sítios extra-intestinais, tais como os nódulos linfáticos mesentéricos, baço e fígado. Números mais elevados nestes órgãos pode indicar que a estirpe de ratinho a ser testado é altamente susceptível à infecção. Usando a técnica de coloração de imunofluorescência descrito, um número virtualmente infinito de mecanismos em resposta à infecção, pode ser explorado. Uma vez familiarizado com as técnicas descritas aqui, o protocolo pode ser modificado para colher tecidos para medir outros parâmetros, tais como, por extracção de ARN e a avaliação dos níveis de expressão de genes, para mais completamente caracterizar as respostas de C. rodentium infecção.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento para BAV da Fundação de Crohn e Colite do Canadá (CCFC) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). GB foi financiado por uma bolsa de estudo de pós-graduação a partir de CIHR. BAV é a crianças com distúrbios intestinais e do Fígado (filho) Cadeira Fundação de Pesquisa IBD Pediátrica e do Presidente de Pesquisa do Canadá em Gastroenterologia Pediátrica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
  2. Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16, (9), 1583-1597 (2010).
  3. Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. 1027-38 (2006).
  4. Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
  5. Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3, (4), 333-340 (2001).
  6. Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
  7. MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
  8. Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
  9. Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
  10. Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76, (11), 4978-4988 (2008).
  11. Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, (3), 618-631 (2008).
  12. Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179, (1), 566-577 (2007).
  13. Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172, (1), 433-441 (2004).
  14. Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71, (9), 5077-5086 (2003).
  15. Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80, (9), 3107-3121 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics