मधुमेह अनुसंधान में β सेल जन वितरण के आकलन के लिए इन्फ्रारेड ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी के पास

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Summary

हम ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट) के अनुकूलन का वर्णन

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Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., Norlin, N., Pileggi, A., Sharpe, J., Georgsson, F., Alanentalo, T., Ahlgren, U. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

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Abstract

ऑप्ट अनुकूल निकट अवरक्त (NIR) स्पेक्ट्रम में इमेजिंग की क्षमता शामिल करके, हम यहाँ अग्नाशय के ऊतकों की छवि बड़ा चूहा अग्न्याशय के रूप में, शरीर के लिए संभावना वर्णन, और चैनलों की संख्या (सेल प्रकार) हो सकता है कि वृद्धि एक ही नमूना में अध्ययन किया गया है. हम आगे कम्प्यूटेशनल उपकरण है कि उपलब्ध कराने के एक नंबर के कार्यान्वयन का वर्णन, पद के लिए 2 / सुधार एल्गोरिदम द्रव्यमान का एक नमूना (हमारे मामले में अग्न्याशय) केंद्र (COM) रोटेशन की धुरी (AR) 2 की 1 / सही स्थिति: संरेखण ट्यूनिंग है जो tomographic पुनर्निर्माण 2 और 3 / तीव्रता समकारी ऑप्ट आधारित बीसीएम 3 determinations में शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल के दौरान ज्यामितीय विकृतियों को रोकता है. इसके अलावा, हम एक नमूना धारक है कि छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना की unintentional आंदोलनों के लिए जोखिम कम से कम का वर्णन करता है. साथ में, इन प्रोटोकॉल बीसीएम वितरण और अन्य संगठनों के आकलन के लिए सक्षमएर सुविधाओं, बरकरार pancreata या अन्य अंगों (आइलेट प्रत्यारोपण के अध्ययन में उदा) की मात्रा के दौरान प्रदर्शन एक संकल्प के साथ Langerhans की व्यक्तिगत islets के स्तर तक नीचे.

Introduction

β कोशिकाओं का उत्पादन इंसुलिन शरीर के लिए रक्त ग्लूकोज homeostasis को नियंत्रित करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, अग्नाशय के बीसीएम वितरण का आकलन पूर्व नैदानिक ​​मधुमेह अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए जरूरी हैं. उदाहरण के लिए चिकित्सीय व्यवस्था के मूल्यांकन में, endocrine सेल या रोग के लिए कृंतक मॉडल में भेदभाव मधुमेह aetiology के अध्ययन पर लक्षित जीन पृथक के प्रभाव अक्सर इस तरह के विश्लेषण पर निर्भर करते हैं. परंपरागत रूप से, आकलन के इन प्रकार समय लेने वाली stereological दृष्टिकोण कि आकार और अग्न्याशय के जटिल संरचनात्मक संविधान की वजह से प्रदर्शन के लिए मुश्किल हैं पर भरोसा किया है. वर्तमान में अधिकांश उच्च संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण (आमतौर पर ऑप्टिकल), पर्याप्त गहराई में प्रवेश नहीं कृन्तकों में पूरे अग्न्याशय इमेजिंग की अनुमति प्रदान करने के लिए नहीं है. विपरीत, इमेजिंग दृष्टिकोण है कि उनके प्रवेश गहराई (आम तौर पर परमाणु) तक सीमित नहीं हैं गरीब संकल्प करने के लिए प्रदान करने के लिए पूर्ण बीसीएम वितरण को हल करने और बाधा उत्पन्न कर रहे हैंपर्याप्त विपरीत 4,5 एजेंटों की कमी से.

ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी एक 3 डी इमेजिंग साधन है कि सेमी पैमाने पर करने के लिए 6 मिमी पर जैव चिकित्सा नमूनों के उच्च संकल्प के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है. इसके द्वारा, स्थानिक स्थिति और व्यक्ति Langerhans की islets व्यक्त इंसुलिन की मात्रा पर जानकारी सामान्य और मधुमेह 3,7-10 चूहों में अग्न्याशय की मात्रा भर में निकाला जा सकता है. वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य आगे β कोशिकाओं अग्नाशय के आकलन के लिए इस तकनीक की क्षमता को बढ़ाने के लिए है, उनके अंतर्जात वितरण, जब अन्य ऊतकों, उनके अन्य अग्नाशय घटक (जैसे सेल प्रकार घुसपैठ) के संबंध में और बड़े में grafted संभव पहले से अग्नाशय तैयारी.

निकट अवरक्त ऑप्टिकल प्रक्षेपण (NIR ऑप्ट) टोमोग्राफी सेटअप

प्रोटोकॉल, एक ऑप्ट मूल शार्प द्वारा वर्णित सेट पर आधारित स्कैनर नीचे में 1, निकट अवरक्त रेंज में इमेजिंग के लिए अनुकूलित और वर्णित किया जाता है. माउस अग्न्याशय (बीसीएम जैसे) के एक चैनल के आकलन के लिए, 3001 SkyScan स्कैनर (Bioptonics) का इस्तेमाल किया जा सकता है.

धातु halide दीपक है कि 650nm ऊपर तरंगदैर्य पर उच्च एक पारा चापदीप से उत्तेजना ऊर्जा प्रदान करता है, उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति करती है. प्रकाश एक तरल प्रकाश गाइड के माध्यम से स्थानांतरित किया है. Fluorochromes और NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग और चैनल जुदाई के लिए बैंड पास फिल्टर का एक उपयोगी संयोजन 3 चित्र में दिखाया जाता है. NIR स्पेक्ट्रम में उच्च मात्रा दक्षता के साथ प्रकाश उत्सर्जित वापस प्रबुद्ध सीसीडी कैमरा के साथ पाया जाता है. ऑप्ट स्कैनिंग एक LabView मंच है कि कैमरे के नियंत्रण और stepper मोटर का उपयोग कर स्वचालित है. बरकरार चूहे pancreata, एक संरक्षित चांदी लेपित दर्पण और एक बड़ी क्युवेट के आकार में नमूने का समर्थन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, एक नमूना धारक है कि अवांछित खड़ी movemen समाप्तनमूने के स्कैन के दौरान टीएस डिजाइन किया गया था.

Protocol

1. नमूना तैयार करने और स्कैन

1.1 नमूना तैयार

निम्नलिखित प्रक्रिया को अनिवार्य रूप से किया जाता है 7 के रूप में पहले से वर्णित है.

  1. अग्न्याशय फसल. ठंडा पीबीएस प्रयोग proteolytic गिरावट से बचने के.
  2. पीबीएस में 4% पीएफए ​​में 2-3 घंटे के लिए बर्फ पर ऊतक को ठीक करें. यकीन है कि lobes "बाहर फैल निर्धारण के दौरान. इस के बाद पुनर्निर्माण संरचनात्मक स्थलों की पहचान की सुविधा होगी.
  3. 30 मिनट के लिए अतिरिक्त पीबीएस में धो लें.
  4. मेथनॉल में stepwise अग्न्याशय (33, 66%, 100%), 15 / मिनट कदम निर्जलीकरण. यह विरंजन (कदम 5 देखें) के दौरान बुलबुले के गठन minimizes और फ्रीज विगलन (कदम 7 देखें) के दौरान सेल विनाश को रोकता है.
  5. एच 2 2 हे: DMSO आरटी में 02:01:03 के अनुपात में 24 को अंतर्जात ऊतक प्रतिदीप्ति बुझाने घंटा के लिए बफर विरंजन हौसले से तैयार ओह में ऊतक सेते हैं. बड़े नमूनों नई bleachi के लिए विदेशी मुद्रा के लिएएनजी और एक और 24 घंटे के लिए बफर सेते.
  6. पर अतिरिक्त ओह में धो लें.
  7. -80 में कम से कम 5 चक्रों के लिए फ्रीज पिघलना ° सी - आरटी एंटीबॉडी प्रवेश की सुविधा है.
  8. Stepwise वापस rehydrate (33, 66%, 100%) TBST, 15 मिनट / कदम.
  9. 10% (अधिमानतः एक ही प्रजाति है जो माध्यमिक एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया है से) सीरम, DMSO 5% और 0.01% नाज़ के साथ TBST में आरटी पर 12-24 घंटे के लिए ब्लॉक
  10. 48 घंटा के लिए बफर RT रोकने में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते, बड़े नमूनों (यहां इस्तेमाल किया एंटीबॉडी अभिकर्मकों की तालिका में सूचीबद्ध हैं) के लिए 72 घंटा का विस्तार.
  11. पर अतिरिक्त TBST में धो लें.
  12. Fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 48 घंटे के लिए सेते हैं, आरटी, बड़े नमूनों के लिए 72 घंटे के लिए विस्तार.
  13. पर अतिरिक्त TBST में धो लें.

1.2

निम्नलिखित प्रक्रिया का वर्णन agarose में नमूना कैसे माउंट करने के लिए और यह कस्टम बनाया नमूना धारक देते हैं (चित्र देखें 7) स्कैनिंग चुनते पूर्व.

  1. में 3A Hörnblad एट अल 3 चित्रा अनुसार, प्लीहा, ग्रहणी और गैस्ट्रिक lobes अलग. lobes के बीच संबंधों को आगे Hörnblad एट अल 11 में स्पष्ट किया जाता है.
  2. 1.5 (w / v)% कम DH 2 हे, फिल्टर में तापमान के पिघलने agarose तैयार करने के लिए, 37 शांत करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस और DH 2 हे में ऊतक कुल्ला दूर डिटर्जेंट धोने और बर्फ पर agarose embedding पहले बुलबुले निकालें.
  3. बाहर एक agarose अपने नमूने enclosing ब्लॉक में कटौती और एक ~ 1 नमूना और agarose के आधार के बीच सेमी स्पेसर छोड़. Agarose ब्लॉक (≤ 90 °) के तेज किनारों को छाँटो प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए.
  4. ओह (33, 66%, 100%) में stepwise नमूना निर्जलीकरण, समय प्रत्येक कदम के बीच संतुलन में लाना करने के लिए अनुमति देता है. जब नमूना डूब यह equilibrated माना जाता है.
  5. लोबान बेंज: लोबान शराब की एक 1:2 समाधान में नमूना साफ़oate (Babb) जब तक यह पारदर्शी हो जाता है. विनिमय Babb और एक अतिरिक्त 12 घंटे के लिए समाधान सेते.
  6. नमूना धारक में मंजूरी दे दी नमूना स्थिति और यह धारक के flanges में drilled छेद के माध्यम से agarose स्पेसर के माध्यम से 2 सुइयों डालने से सुरक्षित कर सकते हैं.
  7. और यह एक Babb समाशोधन समाधान के साथ भरा क्युवेट में डूब स्कैनर में नमूना रखें. जब pancreata की एक श्रृंखला की तुलना एक ही बढ़ाई सभी स्कैन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. बढ़ाई श्रृंखला में सबसे बड़ा नमूना के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

ए.आर. में 1.3 नमूना की स्थिति

निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रक्रिया के लिए ठीक एक COM-ए.आर. एल्गोरिथ्म का उपयोग कर नमूना स्थिति का वर्णन करता है. यह प्रक्रिया तभी लागू होता है जब ROI ज़्यादा से ज़्यादा पूरे नमूना शामिल है. एल्गोरिदम के विस्तृत विवरण के लिए, देखने के लिए कृपया Cheddad एट अल 2.

  1. बीओटी के लिए दो स्थानों में नमूना की छवियों मोलज शारीरिक रचना और संकेत चैनल. 0 X-अक्ष के साथ जुड़े रहेंगे, सबसे बड़ा प्रक्षेपण क्षेत्र, और 90 ° (z-अक्ष के साथ जुड़े) में 2 की स्थिति प्रदर्शित 1 स्थिति. हम शरीर रचना विज्ञान कल्पना GFP चैनल का उपयोग कर रहे हैं.
  2. ROI दहलीज उम्मीद अधिकतमकरण शरीर रचना छवियों पर एल्गोरिथ्म (EM) लागू करें.
  3. द्विआधारी दोनों 0 ° और 90 ° अनुमानों के लिए चरण 2 में प्राप्त छवियों के COM अंक (एक्स - निर्देशांक) की गणना.
  4. एक ऊर्ध्वाधर पहचान की लिंक 0 ° ​​और 90 ° संकेत चैनल के चित्र पर चरण 3 में गणना बिंदु के माध्यम से गुजर लाइन सुपरइंपोज़.
  5. चरण 4 में अधिग्रहण के रूप में संदर्भ नमूना इतना है कि को देखने के क्षेत्र के बीच की रेखा पाया नमूना COM अंक के माध्यम से गुजरता है स्थानांतरित करने के लिए छवियों का उपयोग करें.

1.4 स्कैन

  1. जोखिम बार समायोजित करने के लिए शोर satura बिना संभव अनुपात उच्चतम संकेत प्राप्त करने केting प्रक्षेपण छवियों के किसी भी क्षेत्र. सभी चैनलों के लिए स्कैन किया जा दोहराएँ.
  2. 1 प्रतिदीप्ति चैनल के लिए स्कैन किया जा फिल्टर सेट का चयन करें. कम λ fluorophores से उत्सर्जन अब λ साथ fluorophores उत्तेजित और जिससे तस्वीर विरंजन का कारण हो सकता है. इस संभावना को कम करने के लिए, सबसे लंबे समय तक उत्तेजना λ साथ fluorophore 1 स्कैन.
  3. शटर खोलने के लिए नमूना रोशन और 360 ° पर प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा, प्रत्येक चैनल के लिए ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ नमूना घूर्णन. कदम NIR ऑप्ट सेटअप के लिए इस्तेमाल किया कोण 0.9 डिग्री और Bioptonics 3001 स्कैनर 0.45 ° के लिए.
  4. अगले चैनल के लिए उपयुक्त फिल्टर का चयन करें और इसके बाद के संस्करण के रूप में आगे बढ़ना है.

2. कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण और पुनर्निर्माण

2.1 misalignment अधिग्रहण के बाद पता लगाने और सुधार (एक मूल्य ट्यूनिंग)

प्रक्षेपण टोमोग्राफी में, यह सामान्य रूप में आवश्यक हैएक के बाद संरेखण ठीक धुन रोटेशन की धुरी के साथ छवियों के पुनर्निर्माण के लिए पहले की स्थिति के अनुमानों के लिए मूल्य असाइन करें. हालांकि, ऑप्टिकल अक्ष की दिशा में एक कैमरे के कोण में छोटे विपथन नमूना की लंबाई के साथ गैर वर्दी मूल्यों के कारण और इस तरह ज्यामितीय विकृतियों को प्रेरित कर सकते हैं. ऐसी विकृतियों से बचने के लिए, एक कम्प्यूटेशनल पूरे नमूना भर में सटीक और एकीकृत के बाद संरेखण मूल्य (एक मूल्य) विधि को खोजने के 2 लागू किया जा सकता है.

  1. एक असतत फूरियर प्रयोग 0 में विशिष्ट संकेत के एक प्रक्षेपण ° और 8 पिक्सल ऊंचाई ब्लॉकों में 180 ° विभाजित और x-अक्ष के साथ प्रत्येक ब्लॉक के बीच में (एक मूल्य) बदलाव की गणना करने के लिए बिजली की ताक़त को परिणत करना.
  2. एक रेखीय कम से कम वर्गों कोण θ 'है जो नमूने की लंबाई के साथ x-अक्ष पारी की ढलान का वर्णन की गणना करने में मदद करने के लिए, और एक घूर्णी केंद्र बिंदु मिल प्रतिगमन लागू.
  3. सभी proje घूर्णन द्वारा स्कैनिंग के दौरान misalignments के लिए सहीघूर्णी केंद्र बिंदु के आसपास θ / 2 'ctions.

2.2 कंट्रास्ट सीमित अनुकूली हिस्टोग्राम समकारी (CLAHE)

वस्तुओं (islets) बहुत कमजोर संकेत है, जो खतरे में हैं "बाहर thresholded" पुनर्निर्माण और / या मात्रात्मक आकलन के लिए विभाजन के दौरान प्रदर्शन का पता लगाने के विभाजन की सुविधा के लिए, एक CLAHE एल्गोरिथ्म प्रक्षेपण छवियों के लिए लागू किया जा सकता है. CLAHE आपरेशन दो प्रमुख तीव्रता परिवर्तनों के साथ किया जाता है:

  1. स्थानीय विपरीत का अनुमान है और प्रक्षेपण छवि में गैर अतिव्यापी ब्लॉक के भीतर equalized.
  2. तीव्रता तो द्विरेखीय प्रक्षेप के माध्यम से ब्लॉकों के बीच सीमा क्षेत्रों में normalized हैं.

नाम विपरीत सीमित क्लिप सीमा है, जो छवि में saturating पिक्सल से बचने के लिए सेट कर दिया जाता है को संदर्भित करता है. इस प्रोटोकॉल में, MATLAB बनाया समारोह में इस्तेमाल किया "adapthisteq" और डिफ़ॉल्ट ग के साथ लागू 0.01 के होंठ सीमा और 256 की एक टाइल आकार. नोट, इष्टतम टाइल आकार empirically परीक्षण किया जाना और विश्लेषण नमूना के आधार पर भिन्न हो सकते हैं की जरूरत है. एल्गोरिथ्म और उदाहरण पर अधिक जानकारी Hörnblad एट अल 3 में पाया जा सकता है.

नोट: ऊपर सूचीबद्ध कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण कदम (COM AR-A-मूल्य ट्यूनिंग और CLAHE सहित, 1.3-2.2 देखें) मानक एल्गोरिदम पर निर्मित कर रहे हैं और MATLAB (Mathworks) में क्रियान्वित कर रहे हैं.

2.3 पुनर्निर्माण tomographic और आईएसओ सतह प्रतिपादन

  1. फ़िल्टर वापस प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म का उपयोग, सही और normalized छवियों अब एकीकृत misalignment मुआवजा और गतिशील रेंज के अनुकूलन के लिए न्यूनतम आवश्यकता के साथ खंगाला जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, सभी पुनर्निर्माण बाहर फ़िल्टर्ड वापस प्रक्षेपण NRecon (Skyscan) सॉफ्टवेयर, 1.6.8 संस्करण में उपलब्ध विधि का उपयोग किया जाता है (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). नोट, एक imaged वस्तु की बढ़ाई लेंस का केन्द्र बिन्दु से इसकी दूरी पर निर्भर करता है जब तक समानांतर बीम ज्यामिति इमेजिंग सेटअप में कार्यान्वित किया जाता है. इसलिए, जब NRecon सॉफ्टवेयर के लिए एक प्रक्षेपण डाटासेट आयात यह महत्वपूर्ण है साथ में स्रोत (मिमी) दूरी और स्कैनर (काउंटर दक्षिणावर्त इनपुट "सीसी" के लिए और दक्षिणावर्त इनपुट "CW" के लिए) के घूर्णी दिशा सही वस्तु शामिल लॉग फाइल, पुनर्निर्माण के दौरान कोन बीम प्रेरित कलाकृतियों से बचने के लिए.
  2. कल्पना और आभासी प्राप्त वर्गों के ढेर यों, 3 डी आईएसओ सतहों उपयुक्त छवि प्रसंस्करण Imaris या Volocity के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग उत्पन्न करते हैं.

Murine आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण की प्रक्रिया मधुमेह अनुसंधान संस्थान Preclinical सेल प्रसंस्करण और प्रोटोकॉल के तहत translational कोर मॉडल की समीक्षा में प्रदर्शन किया गया और Miam के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदितमैं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति. पशु अनुसंधान के लिए नैतिक समिति, उत्तरी स्वीडन, अन्य सभी जानवरों से जुड़े प्रयोगों को मंजूरी दे दी है.

Representative Results

वर्तमान रिपोर्ट में हम निष्कर्षण और कृंतक pancreata में बीसीएम डेटा (और अन्य ऊतकों) NIR ऑप्ट (चित्रा 1) का उपयोग करने के कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. चित्रा 2 में सचित्र, अग्नाशय नमूना से ऊतक autofluorescense के रूप में स्पष्ट रूप से NIR स्पेक्ट्रम में कमी की उम्मीद है. Langerhans की इंसुलिन लेबल islets के मूल्यांकन के लिए अनुपात: यह मतलब संकेत में शोर करने के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि (एन एस) की ओर जाता है. स्पेक्ट्रम के रूप में यहाँ बताया NIR भाग में इमेजिंग ऑप्ट के रूपांतरों से, कम से कम तीन विशिष्ट चैनल पर्याप्त एस के साथ कल्पना हो सकता है: एन अनुपात साथ अलग murine अग्न्याशय की मात्रा भर में एंटीबॉडी लेबल सेल प्रकार का आकलन सक्षम चैनल जुदाई (चित्रा 3 और 4 देखें). लागू मधुमेहजनक प्रक्रियाओं और / या सामान्य रूप में बीसीएम आकलन की इमेजिंग तकनीक के इस प्रकार के दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता हैइंसुलिन के संबंध में आसपास के और / या सेल प्रकार के (4 चित्र देखें) बातचीत करने के लिए सकारात्मक क्षेत्रों. इस तरह के आकलन बढ़ ऊतक प्रवेश गहराई NIR संभव सीमा में प्राप्त करने के लिए पहले की तुलना में बहुत बड़ा चूहा अग्न्याशय, जो 3-5 बार अपने माउस समकक्ष (चित्र देखें 5) से भी बड़ा है सहित नमूनों में प्रदर्शन करने के लिए धन्यवाद. की परवाह किए बिना कि क्या दिखाई या NIR तरंगदैर्य का उपयोग कर रहे हैं, CLAHE के कार्यान्वयन काफी विभिन्न genetical और शारीरिक स्थितियों के दौरान तकनीक का पता लगाने संवेदनशीलता (चित्रा 6 देखें) में वृद्धि से बीसीएम आधारित आकलन निकलना सुविधाजनक हो सकता है. विकसित नमूना धारक के लिए एक खाका 7 चित्रा में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. फ़्लोचार्ट हत्या में बीसीएम ऑप्ट आधारित विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्रणine अग्न्याशय. एक ठेठ माउस अग्न्याशय का आकलन करने के लिए आवश्यक समय 13-14 दिन है. समय के बहुमत ऊतक प्रसंस्करण और immunohistochemical धुंधला हो जाना (10 दिन) के दौरान खपत लगभग 2 दिन, ऊतक समाशोधन की आवश्यकता है जबकि स्कैनिंग की लंबाई जोखिम समय की आवश्यकता (सामान्य रूप से चारों ओर 1 घंटा) पर निर्भर है. बाद में कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण आम तौर पर एक दिन के भीतर किया जाता है. नोट, अपेक्षाकृत लंबा धुंधला हो जाना प्रोटोकॉल आदर्श नमूनों की बड़ी मात्रा के बैच प्रोसेसिंग के लिए उपयुक्त है.

चित्रा 2
चित्रा 2. विभिन्न तरंगदैर्य पर बीसीएम आकलन के लिए शोर अनुपात को एक माउस ग्रहणी अग्नाशय पालि, इंसुलिन के लिए और (488 Alexa, 594, 680 और fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ दाग संकेत.विभिन्न तरंगदैर्य पर एन अनुपात: 750), एस निर्धारित किया गया था. छवियों, प्रत्येक संकेत चैनल के लिए 1 प्रक्षेपण फ्रेम दिखा. प्रत्येक संकेत चैनल के लिए एन: बी, मतलब एस illustrating ग्राफ. अनुपात मतलब आइलेट (215 islets पर आधारित) पृष्ठभूमि तीव्रता (exocrine ऊतक से अंतर्जात ऊतक प्रतिदीप्ति) द्वारा विभाजित तीव्रता के रूप में निर्धारित किया गया है. सी, एस ग्राफ दिखा: एन Alexa 594 चैनल के लिए प्राप्त: प्रत्येक चैनल एस के लिए सामान्यीकृत में व्यक्तिगत islets के लिए एन अनुपात. एक ही रास्ता एनोवा सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. महत्व स्तर संकेत दिया .01 ** p <अनुरूप. (ए) में 1 मिमी से मेल खाती है. स्केल बार बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा3. चैनल जुदाई., माध्यमिक तालिका में सूचीबद्ध Alexafluor रंगों के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी अलग पर proteinG sepharose मोती immobilized रहे थे. बी, फ्लोरोसेंट मोती तो एक agarose प्रेत में विभिन्न स्तरों पर एम्बेडेड थे और संकेत फिल्टर का उपयोग imaged.

चित्रा 4
चित्रा 4. मधुमेह अनुसंधान आधारित multichannel इमेजिंग चुनते., ऑप्ट गैर मोटे (इशारा) मधुमेह टाइप 1 मधुमेह के लिए मॉडल से एक अग्न्याशय (12 सप्ताह, ग्रहणी पालि) आईएसओ सतह पुनर्निर्माण आधारित है. चिकनी पेशी α-actin (रक्त वाहिकाओं, लाल) और CD3 (टी lymphocytes घुसपैठ, हरे), नमूना (β कोशिकाओं आइलेट, छद्म नीला रंग) इंसुलिन के लिए दाग है. इसी माध्यमिक एंटीबॉडी थे, Cy3, IRDye-680 और क्रमशः DyeLight-750.insets (A'-'' ') व्यक्ति संकेत चैनल दिखाते हैं. बी, एक माउस जिगर (lobus भयावह lateralis) पालि syngenic islets के साथ grafted और NIR ऑप्ट दो सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के साथ imaged ऑप्ट छवि (देखने झटका). इंसुलिन व्यक्त islets नीले रंग में pseuodocolored कर रहे हैं और चिकनी पेशी α-actin सकारात्मक जहाजों लाल रंग में हैं. दृष्टिकोण संवहनी नेटवर्क के भीतर आइलेट भ्रष्टाचार वितरण के आकलन के लिए सक्षम बनाता है. स्केल सलाखों 1 मिमी के अनुरूप.

चित्रा 5
चित्रा 5. NIR ऑप्ट बड़ा नमूनों की इमेजिंग, टाइप 2 मधुमेह (9 महीनों में प्लीहा पालि) के लिए Zucker फैटी मॉडल से एक चूहा अग्न्याशय में बीसीएम वितरण के आईएसओ सतह प्रतिपादन की सुविधा, छवि नमूना चूहे पर संभावना exemplifying NIR ऑप्ट अग्न्याशय पैमाने. के रूप में निर्धारितइस तकनीक द्वारा प्रदर्शित पालि ~ 6 बार अपने माउस समकक्ष से बड़ा (v / v) और 10139 Langerhans की islets मात्रा जिसका β सेल कुल lobular मात्रा के 1.32% बनाता व्यक्त इंसुलिन बंदरगाहों. बी, tomographic इसी खंड (ए) illustrating है कि islets ऊतक के सभी गहराई से पता चला रहे हैं में टूटी हुई लाइन. सी, आईएसओ सतह एक माउस (8 सप्ताह में प्लीहा पालि) अग्न्याशय एक आकार के संदर्भ के रूप में प्रदर्शित में बीसीएम वितरण का प्रतिपादन. प्रदर्शित पालि 2490 इंसुलिन व्यक्त islets जिसका β सेल मात्रा कुल lobular मात्रा के 0.89% बनाता harbors. pancreata जीपी Alexa594 संयुग्मित (माउस) बकरी विरोधी जीपी और IRDye 680 गधा संयुग्मित विरोधी जीपी (चूहा) एंटीबॉडी क्रमशः विरोधी इंसुलिन के साथ दाग रहे हैं. में नमूनों (एसी) (सी) मिमी 2 से मेल खाती है पैमाने पर और बड़े पैमाने बार में चित्रित कर रहे हैं.

चित्रा 6 6 चित्रा. ऑप्ट इमेजिंग द्वारा murine अग्न्याशय में CLAHE islets का पता लगाने की सुविधा एसी, प्रतिनिधि आईएसओ सतह प्रदान की एक C57BL / 6 माउस अग्न्याशय (8 सप्ताह में प्लीहा लोब) की ऑप्ट छवियों को इंसुलिन के लिए लेबल. ऑप्ट छवियों के आईएसओ सतह पुनर्निर्माण से पहले प्रदर्शन किया गया (ए, छद्म हरे रंग का) और (बी, छद्म लाल रंग) CLAHE प्रोटोकॉल के बाद लागू किया गया था. सी, गैर सामान्यीकृत डेटा में ओवरले (ए) और (बी) में CLAHE संसाधित डेटा. लाल केवल islets "" C'- सी, प्रतिनिधि (A) गैर सामान्यीकृत और CLAHE प्रसंस्कृत (बी) छवियों के उच्च बढ़ाई उपरिशायी के रूप में की उपस्थिति द्वारा दिखाया ", CLAHE स्क्रिप्ट छोटे और कम संकेत का पता लगाने की सुविधा तीव्रता islets वर्तमान उदाहरण में दर्शाया नमूना (CLAHE प्रसंस्करण के बाद) 1.74 मिमी (3 की मात्रा के साथ 2419 islets harbored इसी unprocessed प्रक्षेपण डेटा के आधार पर संख्या 1057 वाई islets1.77 3 मिमी) की एक मात्रा वें. डी और ई, नियंत्रण (डी) और / ओब ओब प्रकार 2 12 6 महीने CLAHE प्रोटोकॉल को लागू करने में मधुमेह (ई) के लिए माउस मॉडल से उदाहरण डेटा. अग्न्याशय / ओब ओब (ई) में बड़े पैमाने पर आइलेट आकार में सामान्य वृद्धि के नोट. (डी) और (ई) अग्न्याशय रूपरेखा (ग्रे) ऊतक autofluorescence से संकेत पर आधारित है. सी में स्केल बार एसी में 500 सुक्ष्ममापी है. सी में स्केल बार 'सी' और ई में सी'' बार स्केल में 1 मिमी से मेल खाती है में 200 सुक्ष्ममापी मेल खाती है (डी) और (ई) में छवियाँ (एसी) Hörnblad एट अल 3 से अनुकूलित कर रहे हैं और कर रहे थे उत्पन्न Bioptonics स्कैनर 3001.

7 चित्रा
चित्रा 7. ऑप्ट नमूनों की कुर्की के लिए नमूना धारक नमूना flanges में पूर्व drilled छेद के माध्यम से agarose स्पेसर के माध्यम से सुई डालने से सुरक्षित है. धारक एक stepper मोटर के माध्यम से करने के लिए hinged हैमजबूत चुंबक अपने आधार में स्थित है. इस सेटअप अस्थिर glues के उपयोग omits और स्कैनिंग के दौरान नमूना के अवांछित आंदोलनों से बचाता है.

Discussion

ऑप्ट इमेजिंग के लिए वर्णित तकनीकों murine अग्न्याशय की मात्रा भर स्थानिक और मात्रात्मक मापदंडों के निष्कर्षण के लिए सक्षम बनाता है. Mesoscopic यह इमेजिंग के इस प्रकार के लिए प्राप्त संकल्प में सीमाओं के कारण ध्यान दिया जाना चाहिए कि, के रूप में सबसे इमेजिंग रूपात्मकता के लिए, बड़ा नमूना कम संकल्प (हालांकि एक उच्च संकल्प सीसीडी उपयोग ऑप्ट स्कैन के संकल्प में वृद्धि करनी चाहिए) . इसलिए, बरकरार अग्नाशय माउस lobes के मूल्यांकन के लिए, हालांकि वर्तमान में तकनीक करीब 7 (लगभग 15-20 सुक्ष्ममापी) एकल कक्ष संकल्प नहीं प्रदान करता है. फिर भी, माउस अग्न्याशय में बीसीएम वितरण की निकासी के लिए प्रोटोकॉल डेटा है कि यह करना चाहिए और अधिक से अधिक अच्छी तरह से मैच उन जैसे बिंदु 3,13 morphometry गिनती के द्वारा प्राप्त करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए प्रदान की है कि हालांकि CLAHE प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन काफी अधिक islets का पता लगाने के लिए अनुमति देता है इन islets आम तौर पर छोटे हैं और योगदान नहीं करतेते समग्र β सेल संस्करणों के लिए काफी है.

immunohistochemical शामिल प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत लंबा (अप करने के लिए दो सप्ताह) कर रहे हैं, लेकिन वास्तविक हाथों नमूना तैयार करने के लिए समय पर कम है और इसलिए तकनीक को अच्छी तरह से 9 पशुओं के बड़े साथियों के अध्ययन के लिए अनुकूल है. यदि heterogenic वितरण पैटर्न के संभावित जांच के लिए एक ध्यान केंद्रित है, यह जोर दिया जा सकता है कि देखभाल कदम में लिया जाना चाहिए निर्धारण के विषय में और से बचने कि अग्नाशय के ऊतकों एक प्रतिकूल रास्ते में तय हो जाता है और एक फ्लैट ("बाहर फैल बढ़ते चाहिए ) ऊतक के माउंट करने के लिए इस तरह के आकलन को सुविधाजनक बनाने के लिए संघर्ष किया जाना चाहिए.

एक महत्वपूर्ण मुद्दा जब ऑप्ट प्रदर्शन है कि नमूना COM रोटेशन की धुरी पर तय हो गई है और कहा कि इसे ले जाने के लिए, नहीं है, या तो खड़ी या क्षैतिज स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान,. इसलिए यह जरूरी है एक स्थिर यांत्रिक और attachi के लिए एक अच्छी तरह से कार्य प्रणाली की स्थापनाएनजी नमूना. हम एक नया माउंट (7 चित्रा) के निर्माण से इस मुद्दे को हल.

समानांतर ज्यामिति हमारे NIR ऑप्ट या Bioptonics 3001 स्कैनर, जो पीठ और प्रक्षेपण छवियों में परिधीय वस्तुओं के सामने पदों के बीच एक खड़ी बदलाव के रूप में खोजा गया था के लिए सच नहीं था. स्रोत दूरी संबंधित स्कैनर के लॉग फ़ाइल में ऑब्जेक्ट (2.3.1 देखें) को समायोजित करके हम काफी हमारे डेटा की गुणवत्ता में सुधार कर सकता है और प्रक्षेपण छवियों के दूर किनारों पर ज्यामितीय विकृति है, जो विशेष महत्व का है के लिए सही बड़ा नमूनों का आकलन.

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम फिल्टर सेट का एक सुझाव है कि तीन अलग - अलग विशिष्ट चैनल व बरकरार अग्नाशय की तैयारी के आकलन में एक "शरीर रचना" चैनल के दृश्य की अनुमति प्रदान करते हैं. जाहिर है, इन सेटिंग्स बेहतर एक दिया हालांकि अध्ययन के लिए उपयोग fluorochromes फिट संग्राहक fluores के सभी रूपों के साथ के रूप में, हो सकता हैप्रतिशत माइक्रोस्कोपी, खून बहाना के माध्यम से संकेत के संभावित खतरे को ध्यान से मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इंसुलिन लेबल islets के fluorochromes कि 750 एनएम ऊपर उत्साहित कर रहे हैं के साथ अध्ययन अभी तक हमें धातु halide दीपक कि हमारे सेट अप का इस्तेमाल का उपयोग संभव नहीं है. यह संभव है कि वैकल्पिक प्रकाश स्रोतों (जैसे लेजर डायोड) के साथ संयोजन में उचित तरंगदैर्य में भी उच्च मात्रा दक्षता के साथ एक कैमरा NIR ऑप्ट के संभावित आगे बढ़ाने के लिए और भी उच्च तरंगदैर्य पर इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए.

ऑप्ट इमेजिंग मिमी सेमी पैमाने पर स्थानिक और मात्रात्मक बायोमेडिकल नमूना के आकलन के लिए एक अत्यंत बहुमुखी तकनीक है. हालांकि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल / अग्न्याशय मधुमेह अनुसंधान का मुख्य उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है कि वे संभव को अन्य प्रजातियों नमूना प्रकार और मार्करों पर अनुसंधान करने के लिए अनुवाद चाहिए. संभावित द्वारा बरकरार अग्नाशय की तैयारी में कई अलग चैनलों कल्पना, इमेजिंग NIR ऑप्ट चurther विपरीत अन्य इमेजिंग रूपात्मकता, के रूप में लंबे समय के रूप में इन विपरीत एजेंटों को भी एक ऑप्ट द्वारा detectable fluorophore ले जाने के लिए तैयार किया जा सकता है गैर इनवेसिव आकलन के लिए इरादा एजेंटों की तेज विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए एक उपकरण के रूप में की क्षमता रखती है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

डॉ. पी. Lindström ओब / ओब चूहों को प्रदान करने के लिए स्वीकार किया है. जे Lehtonen वीडियो उत्पादन और संपादन के साथ मदद के लिए जे गिल्बर्ट के साथ सहायता के लिए स्वीकार किया है. (जे एस: इस अध्ययन में मधुमेह अनुसंधान संस्थान फाउंडेशन (एपी), किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (एपी और UA), यूरोपीय आयोग (सी.पी. आई पी 228933-2 FP-7, अनुदान कोई समझौता नहीं) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ) UA, केम्पे मूलाधार, अम्यो विश्वविद्यालय और स्वीडिश अनुसंधान UA के लिए परिषद

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol Scharlau ME03162500
30% H2O2 Scharlau HI01362500
Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
Liquid Light Guide 11504116
Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

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References

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Comments

1 Comment

  1. Very interesting. this is not my field of study but I believe that your work is very important and it blows my mind. Christoffer Svensson, We know who has the BIG brains in the family. Congratulations on all your success and hard work I am proud of you. One day you have to take a couple of hours and sit down and explain it to me.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    January 15, 2013 - 1:07 AM

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