다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

Published 2/23/2013
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Biology
 

Summary

우리는 개발 및 저렴한 비용에 즉시 사용할 수 각지에서 만들어진 작은 chemostats의 소형 풋 프린트 배열을 확인. 생리학 및 실험 진화 결과는 큰 볼륨 chemostats과 비슷했다. ministat 배열은 기존 chemostat 실험, 기능 유전체학, 화학 심사 어플리케이션을위한 컴팩트 저렴하고 접근 할 플랫폼을 제공합니다.

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Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

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Abstract

Chemostats는 세포가 문화 밀도가 특정 영양소를 제한하여 제한되는 강력히 제어, 화학적으로 지속적인 환경에서 재배되는 지속적인 문화 시스템입니다. chemostats에서 1,2 데이터는 지속적인 성장 속도를 제공하는 등 양적 phenotypes의 측정을위한 고도의 재현 아르 정상 상태에서, 환경. chemostats 이러한 이유로, chemostats는 유전자 표현 3-6 및 정상 상태 평형의 문화의 다른 특성의 분석을 통해 생리의 미세 규모의 특성화를 위해 유용한 도구가되었습니다. 7 장기 실험 미생물 인구가 채택 특정 궤도를 강조 할 수 있습니다 제어 된 환경에서 적응 진화 중. 사실, chemostats들은 발명부터 실험 진화에 사용되었습니다. 8 진화 실험에서의 일반적인 결과는 각 생물 복제에 대한 변이의 독특한 레퍼토리를 얻기 위해. 9-13이 다양성이 훨씬 더 큰 처리로 진화 실험을 수행하여 발견 할 수가 남아 있습니다하는 것이 좋습니다.

우리는 여기서 미니 chemostats 또는 비교적 단순하고 저렴한 비용으로 배열의 설계 및 운영 제시 ministats을하고 생리학 결정과 효모로 진화 실험에서의 사용을 확인합니다. 이 방법은 chemostats 수십은 연동 운동의 펌프를 멀티 플렉스 하나를 실행의 성장을 수반. 문화는 응용 프로그램의 다양한 실용적이며 20 ML의 작업 볼륨에서 유지 관리됩니다. 그것은 처리량을 증가 비용을 감소하고, 자세한 건물 및 운영 지침을 제공하는 것이 아니라 기능적으로 변종, 종, 및 성장 매개 변수의 큰 숫자를 특징뿐만 아니라 유전자에 대한 일반적인 플랫폼으로이 디자인 연구 및 산업 애플리케이션을 동기를 부여 할 수 있다는 우리의 희망입니다 또는 약물 라이브러리.

Introduction

미생물의 성장과 진화의 역학은 미생물학, 생태학, 유전학, 그리고 생명 공학에 기초합니다. 배양의 미생물의 가장 일반적인 방법은 세포가 영양이 풍부한 국물에 낮은 밀도에서 주사 및 채도를 재배 배치에 있습니다. 표준 실험실 장비를 사용하여 수행 할 간단하지만, 일괄 문화는 변동 화학 환경을 경험하고 대응 세포 생리학을 변경. 이 이기종 성장 환경은 미묘한 생리적 차이를 숨길 수 있습니다 이차 성장과 스트레스 효과가 발생할 수 있습니다. 직렬 배치 송금을 통해 실험 진화가 특정 선택 조건에 적응을 연결하려는 시도를 복잡하게, 성장 상 특정 subpopulations의 복합 혼합물에 대해 선택할 수 있습니다. 양적 phenotypes의 측정은 지연 시간과 같은 기능의 부정확 한 샘플 타이밍 및 대안의 소음으로 인해 어려울 수 있습니다. 연속 문화는 대안을 제공합니다성장 정권은 어디에서 세포가 reproducibly 생리적 정상 상태에 도달 할 정의 성장률에서 화학적으로 균일 한 환경에서 재배 할 수 있습니다. 때문에 이러한 장점으로 인해 세포 상태의 실험 진화 및 특성 연구는 종종 chemostat 같은 지속적인 문화의 제어 환경을 사용합니다. 14

이러한 장점의 감사는 chemostat 문화에 대한 관심의 부활하게되었다. 15 1950 년의 도입 이후, 1,2 chemostat 시스템은 리터에서 microliters에 이르기까지 저울의 다양한과 응용 프로그램의 다양한 기능에 개발되었습니다. 16 상업적으로 생산 bioreactors에서 사용자 지정 microfluidics 플랫폼에 glassblown 선박, 공유 일반적인 디자인 원칙을 다양 -19 이러한 다양한 디자인. 문화 챔버는 흔들어서와 aerated (보통 그것을 통해 공기를 버블 링에 의해)과 그 안에 포함 된 미생물은 균일 유지하고있다통증은 항상 문화 챔버 전체에 분산. 정의 구성의 신선한 매체가 지속적으로 추가되고 추가의 속도는 성장 속도를 제어하고 문화 경험 화학 환경에 영향을 미칩니다 있습니다. 오버 플로우는 성장 관 문화 볼륨을 설정,이 오버플로를 통해 문화는 신선한 매체가 입력되는 동일한 비율로 샘플링됩니다. 이런 식으로 문화는 빠르게 많은 생물 매개 변수가 일정하게 유지되는 생리적 정상 상태에 도달합니다. chemostats과 문학에서 이러한 다양한 플랫폼에 대한보고의 장점에도 불구하고, 채택은 이러한 시스템을 구축하고 운영의 어려움, 상업 옵션과 관련된 높은 비용에 의해 제한되었습니다. 또한 이러한 장치를 만들고 사용하는 방법에 대한 설명은 불투명 할 수 있습니다.

우리는 디자인과 저렴한 비용으로 쉽게 구할 수 각지에서 만들어진 작은 chemostats의 소형 풋 프린트 배열의 사용에 대한 지침을 제시한다. 우리 obs큰 볼륨 상업 bioreactors에서 배양 효모에보고 된 데이터에 우리의 장치를 비교할 때 매우 일관성있는 실험 매개 변수 및 재현 결과를 정말 짜증나. 이 10-15 세대 내에 정상 상태 균형을 도달 평형에서 유사한 문화 밀도를 획득을 통해 보는 세포 생리의 재현성이 포함되어 있습니다. 또한, 유전자 발현 패턴 ministats과 상업 큰 볼륨 플랫폼 간의 일치합니다. 세 복제 문화 사이의 희석 비율, 광학 밀도 및 유전자 표현의 재현성의 안정성은 우리의 플랫폼의 견고성을 보여줍니다. 우리는 또한 같은 적응 변이가 큰 볼륨 chemostats과 마찬가지로 유사한 실험 진화 timescales을 통해 발생을 보여줍니다.

Protocol

프로토콜에 걸쳐 적절한 무균 기술을 사용합니다.

1. 부품을 조립하고 Ministat 배열을 준비

  1. 모든 부분을 주문하십시오.
  2. 유리 튜브를 청소합니다. 20 ML 볼륨에서 튜브를 표시합니다.
  3. 코르크 공기가있는 어셈블리, 미디어 및 유출 포트를 확인하고 청소 유리 문화 튜브의 상단에 넣어.
  4. 가습 방을 준비하고 모든 비 autoclaved 부분을 주선합니다.
  5. 충분한 튜브의 길이와 호환 커플 링을 사용하여 공기, 유출, 미디어 튜브를합니다.
  6. 코르크 어셈블리와 호일 필터와 미디어 압력솥을 위해 준비를 빠른 연결합니다.에 튜브의 각 유형 (공기, 미디어 및 유출 물을) 연결
  7. 멸균 chemostat 매체 제작에 사용하기 위해 상자 속에 든 대형 유리 병을 준비합니다.
  8. 적절한 설비를 갖춘 두 구멍 고무 마개를 삽입하여 문화 샘플링 병을 준비합니다. 압력솥을 위해 준비를 각 필터를 돋보이게하는.
  9. Fi를t 깔끔하게 하나 이상의 압력솥 트레이에 배열을 조립하고 모든 부품을 압력솥.
  10. 확인하고 autoclaved carboys에 chemostat 미디어를 필터링합니다.

2. 실험 설정하기

  1. 700 ML ddH 2 O. 각 수화 병 채우기
  2. 원하는 온도로 가열 블록 세트에 autoclaved ministats를 놓습니다.
  3. 4 포트 매니 폴드에 항공사를 놓고 공기 펌프를 켜십시오.
  4. 100 ML 수집 병에 유출 선을 연결합니다.
  5. 미디어 튜브 및 미디어 상자 속에 든 대형 유리 병의 끝에서 호일을 제거하고 두 개의 빠른이 연결 연결합니다. 연동 운동의 펌프 카트리지를 통해 펌프 튜브의 각 길이를 스레드 및 장소에 넣어 클릭합니다. 미디어 펌프를 켭니다.
  6. 챔버가 채워 보자. 미디어 펌프의 전원을 끄십시오.
  7. 70 %의 에탄올과 코르크 어셈블리를 뿌려서 주사기를 사용하여 문화의 예방. 냉동 글리세롤 재고로 inoculum의 샘플을 저장원하는 경우. 문화는 30 시간에 성장 보자.
  8. 공기 흐름이 해제와 문화 볼륨 20 ML로 설정 될 때까지 유출 바늘의 높이를 조정합니다. 이 시간의 과정을 통해 몇 가지 조정이 걸릴 수 있습니다. 언제가 다시 공기 흐름을 돌려 마쳤다.
  9. 에 미디어 펌프를 켜십시오.
  10. 미디어 작업 문화 볼륨을 설정하는 동안 수집하고, 시간을 기록 포함 된 유출 샘플링 병을 비 웁니다.
  11. 시간 제로 측정 자리를 대신 할 15 분 - 2 시간 (DNA 분석하면 샘플하고자하는 어떤 양에 따라)에 대한 살균 수집 관에 유출 라인. 원하는 경우도이 시간에 각 문화 글리세롤 냉동 재고를 확인하십시오.

3. 매일 측정

  1. 얼음에 15 분 - 2 시간 (등 실험에 필요한)을 얼음에 시간 제로 측정, 샘플과 및 DNA 및 냉동 가공 샘플에 대한 샘플 시간을 기록 있습니다.
  2. RNA 샘플에는 작은 권을 수집를 들어문화에서 주사기와 22G 5 "바늘을 사용하여 매화 또는 전체 문화를 수확 각 ministat을 토로하다. 샘플은 여과에 의해 수집, 신속하게 촬영하고, 액화 질소에 즉시 냉동해야합니다.
  3. 희석 비율을 수량화하기 위해 각 ministat의 마지막 샘플링 이후 수집 된 유출 물을 측정합니다. 펌프 설정을 재조정하여 필요한 경우 희석 비율을 조정하거나 벌금 개별 펌프 라인에서 조정 조정.
  4. 빈 수집 병에서 유출 라인을 교체합니다.
  5. 셀 / ML뿐만 아니라 관심의 다른 끝점을 수량화하고 글리세롤 냉동 재고를 확인하십시오.

4. 후 실험 정리

  1. 별도의 트레이에있는 모든 튜브를 놓고 ddH 2 O.으로 과도하게 세정 수족관 펌프를 사용하여 드라이 튜브.
  2. ddH 2 O와 코르크 어셈블리를 청소하고 차례 물을 aspirating과 분배, 바늘을 청소 바늘 삽입을 사용합니다. 을 제거하는 바늘과 코르크의 바깥 쪽을 닦아잔여 미디어.
  3. 물과 에탄올로 유리 튜브를 청소하고, 3 물리적 오염 물질을 제거는 Kimwipes과 포셉을 고사리.
  4. 씻어 사용하기 전에 다시 모든 부분을 건조.

Representative Results

ministat 배열은 위 않으며 (그림 1A, B) 문화에 따라 신진 효모의 haploid 마타 실험실 스트레인 (S288c) 황산 - 제한 이전에 설명 된대로 조건을 10. 우리는 일반적인 chemostat 응용 프로그램에 대한 효능을 테스트 생리학의 결정을 포함하는 데 사용 및 설명 실험 진화. ministats를 확인하기 위해, 우리는 10,20,21 ATR의 Sixfors의 fermentors이 ministats의 열 배나 볼륨으로, 300 ML 작동 볼륨에 실행되었다. 이전에 산업 fermentors에서 수행 여러 실험 chemostat 사용을 위해 수정 반복, 그리고 상당히 다른 모드가 문화 폭기 및 교반의. 우리는이 fermentors을 획득 장비 안정성, 정상 상태 생리학, 실험 진화 결과 및 유전자 발현 패턴을 복제하려고 시도했습니다.

희석 속도와 폭기의 균일는 chemostat 설계의 중요한 측면이기 때문에, 우리 나성장의 15 세대가 지난 후 32 ministats에서 실제 희석 속도를 asured 및 0.17 권 / 시간 (4-5 드랍스 / 분)의 대상 희석 속도로 우리가 32에서 0.0075의 표준 편차로 0.17208의 평균 희석 률을 달성 발견 복제합니다. 이 범위는 유전자 발현에 대규모 변화가 관찰 된 어떤 이상 대상 설정에서 + / -0.01 권 / 시간 차이가 우리의 전형적인 관용에있었습니다. 4월 22일에서 23일까지 ministats 간 공기 흐름 속도가 307.5 ML 것으로 확인되었다 9.57 ML / 분의 표준 편차로 / 분. 이 방에 공기 흐름이 강력하고 균일하게 4 방 사이에 나누어 제시 및 산업 fermentors에 폭기에 대해 설명 된 것과 유사한 값입니다. 20

우리는 이전에 효모의 8분의 8 황산 - 제한 진화 실험에서 고친 화성 유황 이온 전송 SUL1의 반복 증폭을 관찰했다. 10 생에서 결과의 일관성을 감안할 때님의 조건은 우리 시스템의 능력을 테스트하기 위해 황산 - 한계를 선택했습니다. chemostat 문화의 필수 요소는 일정한 화학 환경을 유지 할 필요가 있습니다. 환경의 제한 영양소 또는 기타 변경 사항의 풍부한의 변동은 일반적으로 주어진 문화에 세포의 수가 변경 될. 우리는 0.057 단위의 표준 편차와 함께 성장 ~ 15 세대가 지난 후 1.12의 평균 A600을 (~ 10 9 셀) 찾기, 16 복제 문화에서 휴대폰 번호 (그림 2A) 및 측정 재현성을위한 프록시 광학 밀도를 측정, 또는 5.1 %. 비교를 들어, 산업 fermentors에서 재배 네 복제 문화에서 가져온 측정 2.5 %의 표준 편차를 보여 주었다. 세포는 성장 챔버에 잘 혼합했다 : OD 및 유출 트랙에서 가져온 세포 수의 측정은 문화 관 (데이터가 게재되지 않음)에서 직접 촬영 샘플에 해당했다. 이러한 결과는 플랫폼의 견고성을 입증산업 fermentor와 유사한 허용 오차 내에서 일정한 화학 환경을 유지하기 위해 D 능력.

생리학의 더 민감한 표시 장치로서, 우리는 ministats과 산업 fermentor에서 황산 제한에 따라 성장 문화의 게놈 전체의 정상 상태 유전자 발현을 비교했다. ministats의 유전자 발현은 세 생물은 (그림 2B) 복제에서 유사성의 높은 학위를 보여 주었다. 우리는 이전에 RNA위한 두 복제 Sixfors의 chemostats에서 파생하여 microarray에 공동 hybridized 있다고 지적, 유전자의 99 %의 표현은 경험적 의미의 차단과 같은 1.5X의 사용을 허용, 1.5 배 범위 내에서 하락했다.에서 21 진 표현은 세 복제 ministats, 비교 pairwise는 유전자의 99 %가 산업 fermentors의 결과 비교, 1.5-1.7 배 범위 내에서 하락했다. 세 샘플은 개별 배열과 나중에 계산 pairwise 비율 hybridized되었다, 그래서이 VA매독은 생물학적 소음뿐만 아니라 간 배열은 소음, 잠재적으로 게시, 공동 hybridized 결과에 비해 복제 사이의 변화를 과대 평가 등이 있습니다. 138 유전자가 differentially 세 ministat>의 1.5 배대로 산업 fermentor에서 재배 일치하는 문화에서 수집 한 샘플에 비해 복제 표현했다. ministats 표현에 감소 유전자는 크게 철 대사에 풍부하게되었습니다. 이 서명은 각 장치 구성의 다른 금속 성분을 반영 할 수 있습니다 Sixfors 장치는 문화에 익숙해 금속 임펠러 및 폭기 조립이 포함되어 있으며, 이전에 사용 된 미디어 carboys는 금속 하드웨어를 필요합니다. ministat는 스테인레스 스틸 바늘,하지만 다른 금속 구성 요소를 사용합니다. 이 협회의 생물학적 중요성은 분명하지만 증가 표정으로 유전자는 크게, 세포 멤브레인과 관련된되었습니다.

마지막으로, 우리는 실험 진화 unde을 테스트R 이러한 조건. 배열 비교 게놈의 하이브리드 (CGH, 그림 2C)에 의해 감지로 황산 - 제한된 성장 250 세대가 지난 후, 4 독립적 인 진화 인구에서 테스트 4분의 4 클론 SUL1의 증폭을 보여 주었다. 이 결과는 유사한 시간 간격으로 큰 볼륨 chemostats의 결과와 일치하는 것입니다. 10

그림 1
문화 챔버의 그림 ministat 배열의 1. A. 설계 및 배치. B. 디자인.

그림 2
그림 2. A. Experime그 문화를 보여주는 ntal 데이터 성장의 십 세대 (N = 16)에서 평형에 도달합니다. 생물 셋이 일치하는 황산 - 제한 Sixfors의 chemostat에서 재배 일반적인 기준에 비해 황산 제한에 따라 정상 상태 동안 샘플 S1-3를 복제에 대한 B. 식 데이터 . C. SUL1의 amplifications은 황산 - 제한된 환경에서 성장 250 세대가 지난 후 ministats에서 발견. 설명에 따라 각 발전 클론의 게놈 DNA는 CGH에 의해 조상의 DNA에 비해되었다. (21)은 사본 번호가 각 증폭 지역에 대한 계산과 각 amplicon 옆에 표시됩니다 의미합니다. 모든 microarray 데이터가 증가 GSE36691 아래 GEO 데이터베이스에 입금됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

모든 chemostat와 같이 ministats에 Chemostat 재배는 세부 사항 및 문제 해결에 대한주의가 필요합니다. 오염 연속 문화 실험에 큰 우려이기 때문에, 우리는 일반적으로 박테리아와 곰팡이 접종시 오염 및 장기 진화 실험 기간 동안 모든 50 세대에 현미경을 통해 봐. 우리가 큰 300 세대 (데이터 미도시)의 96 진화 실험에서 오염을 관찰하지 않은 날짜를합니다. ministats과 유출 라인에 의해 문화 챔버을 식민지화하는 미생물의 가능성 사이의 교차 오염에 대한 테스트하기 위해 우리는 다른 모든 ministat은 위와 같이 효모와 나머지는 어떤 문화를 주사하지 않은과 주사 있다는 등 16 ministats을 실행. 문화는 매일 비우지 된 공동 폐기물 용기로 샘플링했다. 오염 물질이 유출 라인을 통해 입력하는 것이 가능 있다면 그러므로 우리는 가능성이 관찰했을 그이 experim의다닐. 삼주 우리는 비 주사 ministat 문화 튜브의 성장을 관찰하지 않은 주사 및 비 주사 문화의 바둑판 패턴의 성장보다 100여 세대, 외부 효모 또는 다른 미생물의 오염의 실험에서 발생 가능성이 있다는 제안 중 유사한 시간 프레임.

ministats은 상업 chemostats와 유사한 방식으로 작동하도록 설계했지만,이 배열의 모듈 형 특성은 최적화에 대한 사용자의 요구와 예산에 맞게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 연동 운동의 펌프 0.0186 권 / 시간에 3.6 권 / 시간 (데이터가 게재되지 않음) 사이의 유량을 얻을 수 있습니다. 희석 속도의 증가 제어는 다른 펌프 모델 달성 할 수 있습니다. 낮은 희석 속도로 작업이 비말 전달의 동일한 주파수를 달성하기 위해 더 높은 게이지 바늘의 대체를 필요로 할 수도 있습니다. 인구 크기는 진화 실험의 적절한 설계를위한 중요한 고려 사항입니다.여기에 사용되는 표준 희석 속도와 영양소 농도는 출판 진화 연구와 같은 크기의 동일한 순서의 비교적 많은 인구의 크기를 (~ 10 9 세포)를 제공합니다. 11 크거나 작은 인구가 작동 볼륨을 변경하거나 영양소 농도를 제한하여 유지 될 수 있습니다. 증가 돌연변이 공급도 높은 돌연변이 속도가 긴장과 협력하여 얻을 수 있습니다.

ministats 또한 현재 디자인을 통해 개선 될 수 있습니다. 인스턴스 결로는 문화 튜브 벽에 수집 할 수 있으며 크게 깊은 waterbath, 보육, 또는 일정한 온도 룸을 사용하여 줄일 수 있습니다하십시오. 거리며 걷게과 황산 제한된 문화의 벽 ​​성장 300 세대 (데이터가 게재되지 않음), 계면 활성제의 다양한으로 48분의 5 진화 실험에 표시 상대적으로 드문 것 같습니다하지만이 특성을 감소 또는 지연에 도움이 될 수 그 이용하실 수 있습니다. 거리며 걷게 충분한 문화와 방해하는 경우에믹싱, 증가 교반은 각 공기 펌프가 나누어 져있는 방법의 수를 줄임으로써 또는 교반 장치를 추가하여 달성 될 수있다. 용해 가스 농도, 산도, 또는 다른 매개 변수에 대한 추가 프로브는 또한 다른 디자인으로 포함 할 수있다. 17

큰 볼륨 상업적 chemostats에보고 된 데이터에 우리의 장치를 비교하면 잠재적 인 수정에도 불구하고,이 프로토콜에 설명 된 ministats를 사용하여, 우리는 매우 일관 실험 매개 변수 및 재현 결과를 관찰했다. 이 10-15 세대 (그림 2A) 내에 정상 상태 균형을 도달 평형에서 유사한 문화 밀도를 획득을 통해 보는 세포 생리의 재현성이 포함되어 있습니다. 유전자 발현 패턴은 철 대사 유전자를 제외하고, 생물 세 ministats에서 복제 맞은 편 ministats 및 상업 대규모 플랫폼 (그림 2B) 사이 일관했다. 이 EXPression 차이는 가능성이 두 장치 또는 미디어 재료의 품질 개선의 금속 함량의 변화로 인해 발생합니다. 우리의 데이터는 ministats가 일관성있는 환경이 필요합니다 생리학 또는 경쟁 실험에 유용합니다 것이 좋습니다.

ministat 디자인은 우리가 250 세대에 황산 제한에 따라 문화를 발전하고 SUL1의 궤적에서 증폭를 특징 CGH 사용 실험 진화 응용 프로그램에 충분한 경우 테스트하려면 -. 큰 볼륨 chemostats에서 이러한 조건 하에서 장기적 진화의 특징 10 우리는 관찰 황산 - 제한된 미디어 4분의 4 독립적 인 진화 실험 (그림 2C)에서 클론의 SUL1의 증폭. 전체 촬영이 데이터는 ministats 전통 chemostat 응용 프로그램의 다양한 유용 할 수있는 강력한 플랫폼 것이 좋습니다. 우리가 배양 신진 효모에서 자신의 사용을 시연 있지만, ministats 그래야또한 실제로 배양 균 및 기타 효모 종에 사용 된 다른 생물체와 유사한 디자인과 호환되지. 16,17,25 또한 작은 문화 볼륨과 미디어 상관이 감소 필요성이 요구되는 실험 ministats에게 매력적인 대안을 만들 수 있습니다 비싼 또는 이국적인 시약은 화학 물질 또는 유전 화면의 경우가 될 수 있습니다.

Disclosures

저자는 사람들이 관심 충돌이 없다는 점 선언합니다.

Acknowledgements

비디오의 창조는 연구 자원에 대한 국립 센터 (5P41RR011823-17)과 국립 보건원에서 일반 의료 과학 국립 연구소 (8 P41 GM103533-17)에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 작품은 NSF 교부금 1,120,425에 의해 지원되었다. MJD는 리타 알렌 재단 학술 수 있습니다. AWM은 NIH T32 HG00035에 의해 부분적으로 지원됩니다. 우리는 프로토콜을 향상 도움 안나 선샤인 감사드립니다. 또한, 우리는 ministats 초기 사용자로 사라 DiRienzi, 셀리아 Payen, 에이미 Sirr을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

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References

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Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

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