DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot Tasarımı

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

DNA origami DNA moleküllerinin kendi kendini montaj programlayarak hassas nano nesneler imalatı için güçlü bir yöntemdir. Burada, DNA origami biyolojik ipuçları algılama ve şekli daha sonra istediğiniz bir etkisi geçirilen, kaydırarak cevap verebilen bir robot robot tasarımı için kullanılabilir açıklanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268, doi:10.3791/50268 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nükleik asitler şaşırtıcı derecede çok yönlü. Biyolojik bilgi depolama ortamı için 1 olarak doğal rolüne ek olarak, paralel hesaplama 2,3 kullanılan edilebilir, biyolojik olarak tanımak ve moleküler ve hücresel hedefler 4,5 bağlama, kimyasal reaksiyonlar 6,7 katalizör ve hesaplanan yanıtı üretmek sistemi 8,9. Önemlisi, nükleik asitler bir istenen etkiyi uygulamak için önceden belirlenmiş bir yanıt biyolojik ipuçlarının algılama bağlayan tek bir robot tüm bu dikkat çeken özellikleri entegrasyonu sağlayan, 2 ve 3 boyutlu yapıları 10-12 içine kendini monte programlanabilir.

Nükleik asitlerden oluşturma şekiller ilk Seeman 13 tarafından önerilen ve bu konu ile ilgili çeşitli varyasyonlar beri çeşitli teknikler 11,12,14,15 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, en önemli olarak adlandırılan DNA origamisi Desteksiz, belki de Rothemund önerdiği biridir16. Bu teknikte, bir uzun (> 7,000 bazlar) tek iplikli DNA 'iskele' arasında katlama 'zımba' olarak adlandırılan kısa tamamlayıcı kollarıdır, yüzlerce istenen şekil yöneliktir. Katlanır sıcaklık tavlama rampa tarafından yürütülmektedir. Bu teknik başarılı olağanüstü hassas ve sağlamlığı ile 2D şekiller çeşitli bir dizi oluşturulması gösterilmiştir. DNA origami sonra da 17,18 olarak 3D şekilde genişletildi.

Mevcut kağıt Douglas ve arkadaşları tarafından geliştirilen caDNAno 2.0 yazılımı 19 üzerinde durulacak. caDNAno çok yönlü özellikleri ile 2 ve 3 boyutlu DNA origami şekillerin tasarım sağlayan sağlam, kullanıcı dostu bir CAD aracıdır. Tasarım süreci nispeten basit ve verimli hale, DNA yapıları için sistematik ve doğru soyutlama düzeni dayanır.

Bu yazıda bir DNA origami na tasarımı göstermekson 20 tarif edilmiştir norobot. Bu robot bir görevi gerçekleştirmek için, harekete için algılama Bağlantıları anlamında 'robot' dir. Biz çeşitli algılama düzenleri yapıya entegre edilebilir nasıl açıklamak, ve nasıl bu istenen etkiyi geçirilebilir. Son olarak şekil için mekanik özelliklerini taklit etmek için Cando 21'i kullanır. Tartışmak kavramı birden fazla görevi ve ayarları adapte edilebilir.

Protocol

Bu yazıda olacak tasarım robotu seçilmiş bir hedef hücrenin yüzeyi üzerindeki reseptörlere bağlanmak için bir kargo C, mevcut yaparak bir protein P yanıt verir. Robot Şekil 1'de gösterildiği gibi, C, bir-reseptör bloke edici madde olabilir;. Fonksiyonu yok etmez mevcut olması gerekir, bir büyüme faktörü, vb, ve kimyasal bir DNA oligonükleotid bağlamak için bir yöntem. Robot iki durumu vardır. İki harici 'dudak' etkin olmayan, DNA kapıları melezleşmiştir zaman, robot güvenli bir şekilde tecrit edilir içinde herhangi bir kargo yüklü böyle kapalı kalır emin. P proteini varlığında, robot yük açmak ve ortaya çıkarmak için çeşitli mekanizmalar sağlayan bir (aşağıda tartışılmaktadır) tarafından açık kapılar. Yapı tasarlarken, kapıları bunu yapmak için etkinleştirdiğinizde robot kapalı durumda kendi üzerine kapatmak için yeterince esnek olmalı, ve açık durumuna bahar düşünün. Bir DNA davranış modelleme yapısı entegre termodinamik ve mekanik bileşenleri zordur, ve gerçek nesne bazı gelişmeler tekrarlanan gerektirebilir. Bununla birlikte, burada üzerine inşa edilebilir genel bir çalışma modeli kullanarak tasarım süreci, odaklanmak.

Dikkat

DNA origami tasarım ve katlama sürecinin daha kapsamlı bir anlayış için, son derece soyut tasarım arayüzü DNA temsil ve nasıl bir gerçek moleküler yapısı ile ilgilidir açıklar Douglas ve arkadaşları 19 tarafından orijinal caDNAno kağıt okuma tavsiye 3D DNA şekli. Bu kağıt çok net bir şekilde caDNAno temsil ve arayüzü anlatan iki video eğitimlerini eşlik ediyor. Ayrıca, Dietz ve birçok önemli yönleri ve Cando analiz aracı 21 dahil olmak üzere katlama sürecinin ayrıntılı protokoller, açıklayan arkadaşları tarafından daha yeni kağıt okuma tavsiye ederiz.

tle "> 1. caDNAno 2.0 ve Autodesk Maya 2012 indirin ve yükleyin

Not: Autodesk yazılım öğrenci ve akademik kullanım için ücretsizdir. Aşağıdaki talimatlar Autodesk bir akademik hesabı kurma içerir.

  1. Bir akademik hesap oluşturun http://students.autodesk.com/ . Hesap kurulum e-posta aldıktan sonra, aktivasyon linkine tıklayın ve istediğiniz gibi tercihlerinizi doldurun.
  2. Yükleme Merkezi'nden Maya 2012 ücretsiz sürümü indirin.
  3. Bilgisayarınızda Maya 2012 yükleyin.
  4. CaDNAno 2.0 yüklemeden önce bir kez Maya çalıştırın.
  5. Den caDNAno 2.0 en son sürümünü indirin ve kurun http://cadnano.org/ .
  6. Maya 2012 çalıştırın. Bir caDNAno simgesi grafik kullanıcı arayüzü sağ üst köşesinde yer almalıdır. CaDNAno gitmek için simgesini tıklatın.

2. Outlİstenilen Şekil ve İskele Strand Yol ine

  1. : Maya içinde caDNAno tasarımı arayüzü 3 panel (Şekil 2) içerir
    1. Üst panel: şekli başlangıçta özetlenmiştir kafes görünümü,. Bu panel çift sarmal düzey eylemler sağlar ve şekli bir bölümü görünümünü sağlar.
    2. Alt panel: düzenleme paneli, tek taban düzeyinde eylemler sağlayan.
    3. Sağ paneli: şeklin bir Maya tarafından oluşturulan gerçek zamanlı 3D modeli
  2. "Petek" simgesine tıklayın. Üst paneldeki kafesin üzerinde yakınlaştırma ve dışarı fare yapılabilir sırasıyla, aşağı yukarı ve.
    caDNAno iki olası tasarım örgüleri, petek ve kare sağlar; kare örgü genellikle de 22 kullanılabilir, ancak bu yazıda biz, petek düzeni kullanır.
  3. Sol panel üzerinde istenilen şeklin bölüm çizerek başlayın.
    Her daire çift DNA sarmalı temsil eder. Ch içinşeklinde inşa heliksler OOSE, sadece kendi merkezi (Şekil 3) sol-tıklayın. Tüm şekli özetlenen kadar sarmal tarafından sarmal devam edin. Alternatif olarak, şekil farenin sol tuşuna basarak ve sürekli şeklin anahat çizerek çizilebilir. Herhangi bir işlem Düzen menüsünde tıklayarak geri ve "Geri Al", ya da klavye kısayolu CTRL + Z (PC) veya CMD + Z (Mac) ile. Olabilir
    Bu noktada, seçilen heliksler sarı görünür. Aynı zamanda, bu alt panel sarmallarının oluşan şeklinde bir yan görünüşüdür, gösterecektir. Alt panelinde numaralandırma sarmal üst bir numaralandırma ile tutarlıdır.
  4. Alt panel dikkat edin. Satırları çift sarmal iki ipliklerini olan, bir temel (Şekil 4) temsil eden her kare ile: Her sarmal kareler iki sıra ile temsil edilmektedir.
    Düzenleme eylemleri bir sarmal boyunca gerçekleşecek nerede turuncu dikey çubuk belirler. Izgara boyunca ana konumundan olarak görünürturuncu çubuğunun üzerinde bir dizi. Sarmal çerçeve varsayılan boyu 42 üsleri olduğunu. Uzunluğu düzenleme panelinin sağ üst köşesinde gri ok simgelerden birine tıklayarak ve uzantısı uzunluğu (DNA sarmalının iki tam tur karşılık 21 katları, içinde seçerek uzatılabilir, hangi bir dönüş 10.5 yayılan bazları) (Şekil 4). kılavuz seçilen ok yönünde uzanır.
  5. Şekli boyunca gerçek iskele iplikçik yolu çizmek için, fare düğmesine basın ilk sarmal başlar ve ilk bölüm 2.3 'de seçildi aynı sırayı izleyerek tüm heliksler üzerine sürekli gitmek. Not:
    1. Heliksler bu kez turuncu rengi değişecektir seçilir.
    2. Alt panelinde, iskele iplikçik parçaları otomatik olarak seçilen heliksler de çekilecek.
    3. Sağ panelde gerçek zamanlı olarak inşa edilen şeklin 3 boyutlu model gösterecektir. Bu sonundasüreci, iskele iplikçik yolun bir taslak otomatik olarak alt panel (Şekil 5) çizilecektir.
  6. Iskele yolu tüm sol kenarlarında bir dikdörtgen çizin. Böylece seçilen kenarları kırmızı (Şekil 6) görünür unutmayın.
  7. Izgara sol tarafında bir grup olarak seçilen kenarlarını sürükleyerek iskele yolu uzatmak. Yolu doğru uzatılır kadar sağ kenarları için bu işlemi tekrarlayın. Iskele uzatma da sağ paneli (Şekil 7) 3 boyutlu şekil uzanır unutmayın.
  8. Geri kalanından izole olan iskele yolu parçaları bulun ve bağlayın. Bizim şekli, örneğin, heliks 0-9 izole edilmiş bir parçasını oluştururlar. Helix 9 ihtiyaçları sarmal 12 bağlı olması (heliksler 9 ve 10 şeklinde [üst panelde] böylece bağlanamaz bitişik değildir unutmayın).
  9. Bağlanacak teller üzerinde yakınlaştırma ve kullanarak "Seç" aracı bir istediğiniz herhangi bir noktaya tıklayınşeritlerin. Mavi bir iskele parçası boyunca herhangi bir noktaya tıkladıktan sonra, 'köprü' simgeleri geçitler izin verilen pozisyonları gösteren, heliksler arasında görülür. Bu pozisyonlarda, komşu heliksler üsleri iplikçikler DNA deforme veya bükmeden sarmal gelen sarmal geçmeyi sağlayan, birbirleriyle doğrudan karşı karşıya. Her köprü simgesinin yanında görünen numara için geçit olacak sarmal sayısı (Şekil 8) gösterir.
  10. Geçitler oluşturmak için, tercih edilen köprü simgesini tıklatın bıraktı. Bir iskele geçit (Şekil 9) iskele sarmal gelen sarmal bu noktada geçer, yani oluşturulur. Bu işlemi iskele erişir tüm heliksler ve tüm şekli yayılan kapalı bir döngü oluşturur, şeklin geri kalanından izole olursa bölgelerde bırakarak kadar.
    Geçitler yazılım bir mesafe span görünür iken, gerçekte herhangi bir DNA baz içermez unutmayın. Fiziksel olarak, çapraz"Köprü" birlikte bitişik helezonlar gelen, iki taban bağlayan DNA omurgasının yalnızca bir fosfat birimi içerir.
  11. Bir sonraki adıma geçmeden önce, tüm iskele sürekli olduğunu ve hiçbir kısmı diğerlerinden izole olduğundan emin olun.

3. Açılış Mekanizması Eksen tanımlayın

Açıklanan robot kendi yükü ortaya çıkarmak için belirli bir biyolojik giriş yanıt olarak açılır. Açılış (, heliksler 0-29 yarısı oluşturan 30-61 ikinci yarısında oluşturan heliksler) iki yarısı ile, bir kabuk gibi bir şekilde gerçekleşir iki eksen etrafında döner. Eksenleri bu yarıları arasındaki tek geçitler ve ızgara sol kenarına sadece ya da yakın konumlandırılmış heliksler 29-30 ve 61-0 arasında geçitler oluşur. Sağ kenar kapısı iplikçikler (aşağıda ele) içerir.

  1. Heliksler 29-30 arasındaki mevcut çapraz silin. Geçit silmek için, ya iplikçik olarak "diz" noktasını tıklatın.Bu geçit olarak kullanılan hem teller bir nick bırakır. Dikiş nickler için, SHIFT tuşuna basın ve her nick tıklayın.
  2. Mümkün olduğunca yakın ızgara (Şekil 10) sol kenarına heliksler 29-30 arasında yeni bir geçit oluşturun.
  3. Mümkün olduğunca yakın ızgaranın sol kenarına heliksler 61 ve 0 arasında yeni bir geçit oluşturun.

4. Yükü Eklenti Siteler tanımlayın

Biz iskele iplikçik yolu komplo bitirdikten sonra, biz yük eki (yükleme) siteleri tanımlamanız gerekir. Yükleme siteleri tek sarmallı 'şube' olarak heliksler dışında uzatmak aslında elyaf lifler bulunmaktadır. Bu sarmal birlikte bu dallanma istenilen yöne uzanır emin olmak için, meydana geldiği çok hassas tanımlamak önemlidir. Biz keyfi elyaf uzantıları tanımlarsanız, yükleme siteleri yerine iç kısmı robotun dış tarafında ortaya çıkabilir.

Tbir elyaf sadece, biz ana gövdeden elyaf dallanma yönlü için rehber olarak hizmet veren ek bir sarmal, arsa belirli bir yöne uzanır emin olun o. İstenilen yükleme sitesi elyaf uzanan sonra, kılavuz sarmal kaldırılır.

  1. Bize robotun iç tarafına doğru bakan 4 yükleme siteleri tanımlayalım. Yükleme siteleri heliksler 3, 27, 34 ve 58 dışında şube olacaktır. Her site için, üst panel iç yan (Şekil 11) karşı karşıya bu heliksler hemen bitişik sarmal tıklayın. Bu alt panelinde şebekeye heliksler katacak. Henüz bu heliksler ikinci tıklamayın.

5. Staples Ekle ve Düzenle

  1. "AutoStaple" tıklayın. Yazılım otomatik olarak çeşitli renklerde elyaf dizileri (Şekil 12) ekleyecektir. Zımba sağ panelinde 3D ​​şekli eklenmiştir unutmayın. Zımba renkleri alt ve sağ paneller için tutarlıdır. Additi yılındaüzerinde, bir elyaf gösterir arayüz, sol alt köşesinde bir gösterge yoktur.
    Not: zımba, çok kısa veya dairesel çok uzun olamaz. Zımba çoğu burada üretilen bu kriterlere uymayan ve düzenlenmesi gerekir. Bunları düzenleme ilk adım (sonraki adıma bakın) otomatik olarak yapılır.
  2. "Durdurucu" tıklayın. Bir iletişim kutusu Bu eylem için kullanıcı tanımlı parametreler isteyen, (Şekil 13) açılacaktır:
    1. Hedef uzunluğu (bp): elyaf beklenen süresini mümkünse
    2. Min uzunluğu (bp): minimum uzunluk bir elyaf için izin
    3. Maksimum uzunluğu (bp): maksimum uzunluğu bir elyaf için izin
    4. Bir elyaf kenarından ve bir crossover arasında veya iki geçitler arasında geçiş yapabilirsiniz baz çiftlerinin az sayıda: Xover (bp) için dist Min.
      Varsayılan parametrelerini kullanın, Tamam 'ı tıklatın. Yazılım (Şekil 1 kabiliyetini en iyi şekilde, bu parametrelere göre zımba kıracak4).
  3. Bu heliksler açmak için robot ayırmak ve etkinleştirmek sağlamak için, heliksler 29-30 ve 61-0 arasındaki tüm zımba geçitler silin. Elyaf geçitler silinmesi çok kısa ya da bu eylemi sonucunda mantıksız olmak doğru zımba için bazı manuel düzenleme gerektirecektir. Düzgün Bunu yapmak için, aşağıdaki bölümlerde verilen talimatları izleyin.
    Sağlam bölüm 3.2 ve 3.3 'te oluşturulan iskele geçitler bıraktığınızdan emin olun.
  4. Örneğin, heliksler 29 ve 30 (Şekil 15) arasındaki soldan birinci elyaf geçiş (mavi ve siyah zımba) düşünün. Kırmızı görünmesi SİL (Şekil 16) isabet sonra, her diz noktası veya köprü tıklayarak bu geçit köprüleri de silin.
  5. Aralarında SHIFT tuşuna ve nick tıklayarak sarmal 29 dikiş iki zımba. Benzer şekilde, dikiş tek bir zımba (Şekil 17) için iplikçik 30 üç zımba. Staples yapabilirsinizelle bir kenar tıklayarak ve istediğiniz gibi sürükleyerek uzatılabilir veya kısaltılabilir. Herhangi bir elyaf sirküler dikkat edin. Şekil 18 elyaf geçitler tam düzenleme sonra heliksler 29-30 arasındaki boşluğu gösterir. Heliksler 0 ve 61 için bu işlemi tekrarlayın ve el ile her sarmal tüm zımba düzenleyin.
  6. Onlar daha fazla düzenleme gerektirir, yani kalın bir çizgi ile çizilmiş zımba bulun. Her biri inceleyin ve gerekirse düzeltin. Örneğin, çok kısa zımba silinir (Şekil 19) veya mümkünse uzatılabilir.

6. Yükleme Siteleri ve kapılar oluşturun

  1. Üst paneldeki yükleme sitesi heliksler İkinci tıklatın ve bir kenar tıklayarak ve o kadar (Şekil 20) istenen sürükleyerek alt panelinde çıkan iskele iplikçik parçaları uzatmak.
  2. El t boyunca istenilen konumda turuncu dikey çubuk yerleştirerek bu iskele parçaları için zımba ekleyino iskele, SHIFT tutarak ve tıklayarak, sol paneldeki kılavuz heliksler üzerinden gidiyor. Bu, her sarmal bir elyaf habercisi (Şekil 21) ekleyecektir.
  3. Tıklayıp sürükleyerek tam uzunlukta yanı için zımba öncüleri uzatın.
  4. Kılavuz teli (örneğin, sarmal 62) ve taşıyıcı (örneğin, sarmal 3) arasında izin geçit pozisyonları gösteren, kırmızı köprü simgeleri bulun.
  5. Bir crossover tanıtmak ve köprü simgesi (Şekil 22) tıklayın için en uygun yeri seçin. Uygun bir yerde şasi mevcut zımba az düzenleme gerektirir.
  6. Kılavuz zincirindeki (sarmal 62), yükleme sitenin bir parçası değildir elyaf bölümü silin, ve istenilen uzunlukta katılan kısmı kısaltın. İstenen uzunlukta yük farklı yükleme için özgünlük ve bağlanma kuvvetini de sağlamalıdır. Tipik olarak, bir 18-mer kuyruk ince olmalıdır. Zımba dra kalır emin olunbu kadar ince bir çizgi ile wn, aksi takdirde düzenleyin.
  7. Şasi, gerektiği gibi değişti zımba düzenleyin.
  8. Kılavuz (sarmal 62) sadece elyaf uzatma bırakarak silin.
  9. Tekrar tüm yükleme siteleri (Şekil 23) için 6,4-6,8 adımları.

7. Gate Tellerinin Tasarımı

Kapı teller heliksler 29-30 ve 61-0 bağlayan, eksen dışında, tek iplikçikler vardır. Eksenler aksine, kapı ipliklerini geçitler değildir. Daha çok, tercih edilen biyolojik girişi için sensör olarak hizmet veren bir çift zincirli segmenti oluşturmak için melezleşir. Kapının dubleks yerinden sonra, tüm robot entropically eksenleri ve açık etrafında olabilir.

  1. Kapısı teller için doğru konuma bulun. Bu heliksler 29, 30, 61, ve 0 üzerinde zımba olacak.
  2. Örneğin, 29-30 kapısı bölgesi inceleyin. Heliksler üzerinde 29 ve 30 yan uygun elyaf ipliklerini vardırKapı ipliklerini olarak kullanılabilir ızgara sağ tarafında. Onlar zıt yönlerde karşı karşıya unutmayın.
  3. Şeklin dışında genişletmek için potansiyel kapı ipliklerini birinin kenarına tıklayın. Kenarında bir iskele geçit üzerinde yer alıyorsa, kendi seçim sadece "Stap" (les) arayüzünün sağ üst tarafındaki "Seçilebilir" araç çubuğundaki "Scaf" (kat) kapalı tıklayarak, seçilebilir emin yaparak basitleştirilmiş olabilir .
  4. Kapının ipliklerini oluşturmak için her iki zımba uzatın. Bu uzantısı (Şekil 24) gerektiriyorsa zımba düzenleyin. Heliksler 0 ve 61 kapısı ipliklerini için bu işlemi tekrarlayın.
    Sensör DNA (örneğin aptamer) dizi tamamlanması aşamasında kapı iplikçik dizileri yerini alacak çünkü şimdilik, gerçek uzunluğu, önemli değil unutmayın.

8. İskele Sıra seçin

  1. "Sıra" aracını tıklatın. Iskele iplikçik üzerinde herhangi bir yere imleci yerleştirin ve tıklayın. Bir iletişim kutusu için bize soran açılacaktıriskele DNA kaynağı (Şekil 25) seçin.
  2. Kaynak DNA seçimi büyük ölçüde robot boyutuna bağlıdır. Örneğin, M13mp18 ssDNA (p7249) ve onun genişletilmiş türevleri (p7308 vb) genellikle iskele iplikçik ~ 7 kb uzun zaman uygun, büyük DNA origami şekilleri için seçim olmuştur ki. Tasarlanan şeklin iskele seçilen kaynak çok daha kısa ise, herhangi bir elyaf için melezleşmiştir değildir aşırı iskele iplikçik katlanmış şekli çıkıntılı ssDNA bir döngü yaratacaktır. Bu genellikle nispeten kısa döngüler için küçük bir sorun teşkil ederken, çok kb uzun döngüler büyük ölçüde robot katlama ve işlevine engel olabilir. Bu nedenle şekil iskele uzunluğu için seçilen kaynak uyacak şekilde önemlidir.

Örneğin, iskele iplikçik iletişim kutusunda önceden kaynakları çok daha kısadır ~ 1.600 üsleri uzun küçük bir şekli, kat için gerekli, özel bir dizi olabiliriskelesi olarak da kullanılır. Çeşitli kaynaklar olarak kabul edilebilir. Örneğin, M13mp18 arzu edilen uzunlukta bir fragmanı üreten, belirli bir sınırlama enzimi ile sindirildi edilebilir. Böyle bir kaynağı tasarımı NebCutter (yapılabilir http://tools.neb.com/NEBcutter2/ M13mp18 dizisi yapıştırarak) NebCutter giriş penceresi ve haritalama kısıtlama siteleri. Başka bir seçenek New England Biolabs edinilebilir gibi phiX174 virion ssDNA HaeIII özet olarak önceden sindirilmiş ssDNA, kullanmaktır.

  1. Iletişim kutusunda, "M13mp18" butonuna tıklayınız. Seçilen DNA dizisi iskele ve alt panelinde elyaf ipliklerini eklenmiştir unutmayın.

9. Expobir elektronik tablo olarak rt Zımba Dizi

  1. Üst araç çubuğunda "Export" tıklatın ve elyaf listesi için bir hedef dosya adı seçin. "Kaydet" butonuna tıklayınız.
  2. Hedef. Csv dosyasını bulun ve açın.
  3. Tablo bir DNA sentez şirkete olarak gönderilebilir Zımba listesini gösterir. İlk iki sütun tabanı konumu belirten köşeli ayraçlar içinde sarmal numarası ve ifade eden parantez dışındaki sayı ile, başlangıç ​​ve bitiş koordinatlarını görüntüler.

10. Kapı ve Yükleme Diziler atama

  1. Zımba listesinde, bazı dizileri başlamak ya da soru işaretleri bir dizi ile son göreceksiniz "???". Bu soru işaretleri hiçbir iskele iplikçik bu özel elyaf bölgeleri ile hibridleyen yana, onlar tamamlayıcı dizileri atanamaz olduğunu göstermek. Bunlar aslında kapısı teller ve yükleme siteleri için biz tasarlanmış uzantıları ve bu nedenle bu artık el tayin edilmesi gerekir. Gate:
    1. Kapıları robot etkin duruma inaktif geçiş ve yük gösterecektir bunun üzerine biyolojik giriş niteliği belirler. Her bir tek dsDNA geçidi bir tane biyolojik girişi (veya daha fazlası) yanıt kodlamak, robot aktivasyonu için gerekli girdilerin bir profil tanımlanmıştır, böylece.
      Bizi robot aktivasyon tetikleyen biyolojik işaret bulaşıcı bakterilerin varlığına işaret olabilir bir kısıtlama enzim olduğunu bu örnek için varsayalım.
    2. Önce kapı ssDNA ipliklerini kendi heliksler dışında dallanma hemen sonra melezleşme olmadığını düşünün. Kapının Tasarımı aksi katlama sırasında hibridizasyon engel olabilir. Bu nedenle, her dal bir ayırıcı dize ile başlamalıdır. Bu dizi esneklik sağlar Biz genellikle, ara dizeleri olarak poli-T kullanın.
    3. Ayrıca, kapı hibridizasyon bölgenin uzunluğu hedef kısıtlama oturmak içeren 20 baz olduğunu varsayalımOrtasında örn.
    4. Bu nedenle kapısı şöyle olabilir:
      [Helezon 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helezon 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      "....." iskele iplikçik ile hibridleyen Zımba bölge göstermek, bu nedenle zaten bir dizi vardır ve değiştirilmemelidir.
      Rastgele çift yönlü "GTGAGTT" ve tamamlayıcı kısıtlama sitesi kısmen açık değil sağlar, ve enzim tarafından etkin sindirim sağlamak için bazı ekstra üsleri sağlar.
      "X", kısıtlama alanı gösterir.
      Rastgele çift yönlü "GCTAGAG" ve tamamlayıcı verimli çalışması için enzim için bazı ekstra üsleri sağlamak, aynı zamanda emin kapısı iplikçik iyi bir robot kapatma sağlamak için yeterince uzun yapar.
      Bir hedef olarak bir kısıtlama sitesi seçmeden önce, tüm robot yapısı, yükleme siteleri ve kapı kendisinin diğer kısmı tarafından sindirilir değil emin olunseçim enzim. Bu incelemede, NEBCutter 0-kesici listesi (tüm dizi kesmeyin enzimler) bir enterobakteriyel bulaşıcı varlığını gösterebilir potansiyel bir enzim olarak Enterobacter Pantoea agglomerans izole vurgulanmış Eagl,,.
    5. Kapı şimdi bu (sarı işaretleri Eagl kısıtlama sitesi) gibi görünüyor:
      [Helezon 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helezon 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Bu tasarım varsayar unutmayın sindirim sonra, sıra "GTGAGTTCGG" (T m = 32 ° C) robot artık kapalı tutmak için yeterince uzun ya da termodinamik olarak kararlı değildir. Bu varsayım büyük olasılıkla deneysel olarak doğrulanması gerekir.
    6. İkinci kapı robot sadece bir enzim yanıt vereceğini, ya da farklı bir site ile dizayn edilebilir, robot artan özgüllüğü bu durumda aynı olabilir. Daha fazla kısıtlama siteleri, aynı şerit üzerine eklenebilir robot karmaşıklığı ve özgünlüğü katlama.
  2. Yükleme siteleri:
    1. Yükleme yeri evrensel bir dizisi olabilir. Alternatif olarak, yükleme siteleri modülerlik azaltmak ama kargo yönlendirme ve oranları (kargo farklı türleri için) üzerinde kontrol artıracak benzersiz dizileri, dayalı olabilir.
    2. Elyaf yönüne göre, kimyasal grubu doğru sonuna (5 'ya da 3') üzerine monte edilmiş olduğundan emin olun proteini nanoparçacık vb: Son olarak, yükleme yeri oligonükleotitler bunların herhangi bir yük ile eşlenik sağlayan bir kimyasal fonksiyonel grup içermelidir .

11. Cando içinde Sonuçlar simüle

  1. Işi. Json dosyası olarak kaydedildikten sonra, bu analiz için Cando yüklenebilir. Cando çözüm 21 yılında sertlik ve kararlılık tahmin edebilir DNA yapısının bir sonlu elemanlar tabanlı simülasyon olduğunu.
  2. Gitami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
  3. "Analizi için bir caDNAno dosya Gönder" ve gerekli tüm bilgileri doldurmak tıklayın.
  4. Cando Analiz genellikle 15-20 dakika kadar sürer. Sonunda, bir e-posta iletisi bize analiz simülasyon sonuçları (Şekil 26) indirmek için bir bağlantı sağlayan, tamamlandığında bildirir.

12. Amacıyla DNA ve Katlama Robot

Bir kez dizayn işlemi tamamlandıktan ve cando analizi, ürün tatmin edici tahmini, 9-10 sipariş edilebilir bölümlerinde üretilen elyaf teli listesini gösterir. Tipik olarak, elyaf ipliklerini özellikle arıtma gerektirmeyen, ancak, bu tür kapıları veya yükleme siteleri gibi özel amaçlı teller HPLC tavsiye edilir.

Ya atomik zorla katlanmış yapısı görselleştirme dahil olmak üzere ürünün adımlar aşağıdaki DNA için, yani katlama, arıtma ve değerlendirme,mikroskobu (AFM) veya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) bu yazının kapsamı dışındadır ve daha önceki raporlarda 17,18,20,21 bulunabilir. Burada tasarlanan robot bir TEM görüntüsü bir örnek (Şekil 27) olarak getirilir. Örnek hazırlama ve boyama tam olarak başka bir yerde 21 tarif gerçekleştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1-25 tasarım süreci adım adım gösteren caDNAno 2.0 arayüzü ekran vardır. Şeklinin kesiti birinci iskele iplikçik parçaları ve bütün iskele yolu (Şekil 7) tamamlanması için otomatik ilave edildi ve ardından, (Şekil 3) vurgulanmıştır. Zımba teller otomatik olarak, (Şekil 12) eklenen kullanıcı tanımlı parametreleri (Şekil 14) göre kırık ve cihazın istenen fonksiyonu (Şekil 15-18) için zımba uyum elle düzenlenebilir. Şekil 23-24 yükleme nasıl tarif edilir site ve kapı lifler eklenir ve düzenlenir. Son olarak, Şekil 27, burada tasarlanmıştır modelinin bir TEM görüntüsü gösterilmektedir.

"/>
Şekil 1. CaDNAno 2.0 tarafından tasarlanan ve Autodesk Maya 2012 tarafından üretilen bitmiş robot bir 3 boyutlu model,.

Şekil 2,
Şekil 2.. CaDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 tasarım arayüzü bir görünüm. Üst panel: ilk şekli özetleyen için kafes paneli. Alt panel: düzenleme paneli. Sağ paneli:. 3D model jeneratör (bölüm 2.1) büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3. Üst pa üzerindeki şeklin bölümünde Çizimnel (bkz. Bölüm 2.3).

Şekil 4,
Şekil 4. CaDNAno 2.0 alt (düzenleme) paneli. Birlikte ızgara düzenleme eylemler gerçekleşir nereye turuncu dikey çubuk belirler. Sağ üst köşesinde gri oklar (bkz. Bölüm 2.4) her iki tarafına ızgara genişletmek için kullanılır.

Şekil 5,
Şekil 5. Üst paneldeki ilk anahat (bölüm 2.5) sonra iskele iplikçik taslağı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

ogether.within-page = "her zaman"> Şekil 6,
Şekil 6. Tüm iskele iplikçik yolu kenarları seçme ve (bölüm 2.7) istenilen uzunlukta yolunu uzanan.

Şekil 7
Şekil 7. Düzenleme eylemleri ile birlikte gerçek zamanlı olarak nasıl 3 boyutlu model değişiklikleri gösteren alt ve sağ panelleri genel bir bakış. daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

8/50268fig8highres.jpg "/>
Şekil 8. Heliksler arasındaki köprü mavi simgeler (kırmızı simgeler elyaf geçitler bakın ve henüz gösterilmez, bölüm 2.9 'a bakın) iskele geçitler izin verilen pozisyonları göstermektedir.

Şekil 9,
Şekil 9. Yeni inşaat iskelesi oluşturma (Bölüm 2.10 bakınız) tercih köprü simgelerini tıklayarak geçitler.

Şekil 10
Şekil 10. Heliksler 29 ve 30 (bkz. Bölüm 3.2) arasında bir eksen (bir geçit ızgara sol tarafında mümkün olduğunca yakın) oluşturma.


Şekil 11. (Bkz. bölüm 4.1) yükleme siteleri dallanma rehberlik heliksler ekleme.

Şekil 12
12 Şekil. "AutoStaple" eylem sonra planı. Alt panel ve sağ panelde elyaf renkleri uyumludur (bkz. Bölüm 5.1). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 13
13 Şekil. "Durdurucu" diyalog kutusu Kullanıcı (bkz. bölüm 5.2) durdurucu parametreleri tanımlayabilirsiniz.

Şekil 14
Şekil 14. "Durdurucu" eylem sonra planı (bkz. bölüm 5.2). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 15
Şekil 15 zımba I Manuel düzenleme:. Sarmal 29 ve 30 üzerinde çapraz ve silinmelidir zımba bulmak.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Şekil 16 zımba II Manuel düzenleme:. Bulunan zımba arasındaki köprü silme.

Şekil 17
Şekil 17 zımba III Manuel düzenleme:. Parçalanmış zımba birlikte dikiş rumuz (bkz. Bölüm 5.5).

Şekil 18
Şekil 18. Heliksler 29-30 hiçbir geçitler gösteren arasındaki tüm boşluğu (bkz. Bölüm 5.5) iki bağlantı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "her zaman"> Şekil 19
Şekil 19. Kalın bir çizgi (onlar çok uzun veya dairesel, ya çok kısa gösteren, bkz. Bölüm 5.6) çizilen zımba Manuel düzenleme.

Şekil 20
Şekil 20. Sitesi dallanma (bkz. Bölüm 6.1) yükleme için rehber heliksler ekleme. daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

1highres.jpg "/>
Şekil 21. Kılavuz heliksler için elyaf ipliklerini Manuel yanı sıra, çok dallanma noktaları (bkz. Bölüm 6.2) bulunabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 22
Şekil 22. (Şasi zımba az düzenleme gerektiren bir, bölüm 6.5) elverişli bir konumda robot şasi iskele için bir yükleme sitesi çapraz Tanıtımı.

Şekil 23
Th görüldüğü gibi Şekil 23. Yükleme sitesi zımba göster(bölüm 6.9 bakınız) artık gerekli olan kılavuz heliksler, çıkardıktan sonra e alt panel.

Şekil 24
Şekil 24. Heliksler 29 ve 30, kapı iplikçikler olarak kullanılmak üzere gidiyoruz iki zımba, uzatılması. Iki iplikçikler kapısı çift yönlü (bölüm 7.4) oluşumu için zorunludur ters yönde, karşı karşıya unutmayın. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 25
Şekil 25. Iskele dizisi ek ("Seq" aracı) diyalogönceden tanımlanmış iskeleleri birini ya seçmek için, veya (bölüm 8.1) özel bir dizi eklemek için izin kutusu,.

Şekil 26
Tasarım Cando analizi Şekil 26. Sonuçları burada açıklanan. Simülasyon istenen bilgileri sağlayan çeşitli dosyaları içeren bir. Zip arşivi oluşturur. İşte RMSF (karekök dalgalanma ortalama) dosyaları (. Png) renkli "HeatMap4RMSF.txt" adlı ekteki dosyada ayrıntılı anahtarına göre, 3 bakış açılardan tasarım bir model gösteren tasvir edilmektedir. Bu durumda, en az RMSF (bluest) 1.03 nm ve% 95 RMSF (redest) 3.19 nm'dir. Modeli arasında renk degrade 'ön neden robotun kutup (' ön 'in kapıları,' geri 'eksen) ve heliksler 29-30 ve 61-0 birlikte bağlantılı bir zımba olduğu gerçeğinden kaynaklanmaktadır geri 'tarafında daha fazla dalgalanma'yan.

Şekil 27
Şekil 27. Bu makalede tasarlanan robot TEM görüntüsü. Örnek hazırlama ve boyama tam olarak başka bir yerde 21 tarif gerçekleştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA origami bize nano de keyfi özellikleri ile doğru tanımlanmış nesneleri imal sağlar. Önemli bir sonraki adım bu tasarımlar içine fonksiyonunun entegrasyonu olacaktır. Birçok uygulama ve zorlukları bu teknoloji ile ele alınabilir ise bu DNA doğal bir ortam temsil olarak, DNA origami gelen tedavi ve bilimsel robotlar imalatı özel bir ilgi vardır. DNA zaten bir genetik bilgi depolama ortamı olarak hücrelerde moleküler makine arayüzler. İlginç bir şekilde, bir nanorobot ya da başka bir makine içinde katlanmış DNA çıkışı yine bir dizi parçaları olarak, nanorobot parçalanmasından sonra arzu edilen bir proteinin ifadesi için geçirilebilir bir inşaat malzemesi, olmanın yanı sıra, genetik bilgi olarak hizmet edebilir.

Bu yazıda ele alınan örnekte, robotu çalıştırmak için bir kısıtlama enzim kullanın. DNA robotlar sorumluluğu hangi Ancak, ek mekanizmalargirişlerine d aşağıdakileri içerir.

Moleküler tanıma: son zamanlarda hedef hücreler 20 yüzeyinde protein molekülleri tanımak DNA robotları için aptamer tabanlı kapıları gösterdi. Aptamers şirketlerin dış kaynaklı, ya da aptamer veritabanı (den kullanılan bu tür SELEX 23 gibi yöntemler kullanarak-in vitro seçilebilir http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Aptamerlerinin kullanıldığı zaman, bu arada kapı oluşturan aptamer, tamamlayıcı şerit, aptamer olan en ligand ve tamamlayıcı şeride deplasman bağlayıcı kolaylaştıracak uyumsuzlukları, içerecek şekilde dizayn edilebilir dikkate alınması önemlidir. Izin mekanizması bu bilinmemekle beraber, bir aptamer tabanlı kapısının duyarlılık ve özgüllük ya çok sıkı ama verimsiz kapısı, ya da bir hızlı almak için, iki iplikçikler arasındaki uyumsuzluğu% artan ya da azalan tarafından ayarlanabilirama sızdıran bir.

Enzimatik bölünme: Bunun için, kapıları, bu enzimin alt tabaka içeren bu tür tasarlanmış olmalıdır. Örneğin, bir proteaz, bir küçük peptid alt tabaka her iki taraftan da robot enzimin yokluğunda kapalı tutacak kapısı, gergin edilebilir.

Uzaktan kumanda: DNA makinelerine uygulanmamıştır potansiyel bir yaklaşım dsDNA erime 24 ikna etmek için bir yüksek frekanslı elektromanyetik alan bir altın nanokristal anten kullanıyor. Bu biyo-duyarlı olanlara ek olarak, bir kullanıcı tarafından çalıştırılan şalter sağlayabilir. DNA origami robotlar tasarlamak ve yapmak oldukça basit olmasına rağmen, bir tedavi platform olarak birçok teknik zorluklar oluşturmaktadır. Bu nükleazlar tarafından bölünme karşı oldukça hassas olduğu gibi DNA ilaç dağıtım için ideal bir malzeme değildir. Ayrıca, bir bağışıklık tepkisi çökeltmek olabilir. Bir organizmanın DNA origami nesnelerin davranışını detaylı bir şekilde çalışma nkaderlerine tanımlamak ve dokularda toplam yok ya da ev sahibi genomuna entegre emin olmak için eeded.

Özetle, biz caDNAno, tasarımı DNA origami şekilleri için basit, güçlü CAD aracın kullanımı sundu. Biz tedavi, enerji, metamalzemeler, ve eğitim gibi alanlarda, DNA origami uygulama odaklı araştırma görmeye başlamak istiyoruz. Tüm bu yerlerde, caDNAno çözümleri fark üzerinde önemli bir etkiye sahip olması bekleniyor. Gelecekte, bu hepsi uyumlu olduğu için herhangi bir kullanıcı tarafından (veya can parçaları) değiştirilebilir bir sanayi ve tasarım standardı, hale gelebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar son derece değerli tartışmalar ve tavsiyeler ve yararlı tartışmalar ve iş için Bachelet laboratuvar tüm üyeleri için S. Douglas teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Bar-Ilan Üniversitesi Nanoteknoloji ve kırılgan malzemelerin Yaşam Bilimleri ve Enstitüsü Fakültesi'nden hibe tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autodesk Maya 2012 Autodesk A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software) (Open source) Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage) (Open source) Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  2. Adleman, L. M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science. 266, 1021-1024 (1994).
  3. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475, 368-372 (2011).
  4. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  5. Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin. Chem. 55, 813-822 (2009).
  6. Baskerville, S., Bartel, D. P. A ribozyme that ligates RNA to protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9154-9159 (2002).
  7. Bartel, D. P., Szostak, J. W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science. 261, 1411-1418 (1993).
  8. Benenson, Y., Gil, B., Ben-Dor, U., Adar, R., Shapiro, E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature. 429, 423-429 (2004).
  9. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333, 1307-1311 (2011).
  10. Rothemund, P. W., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2, e424 (2004).
  11. Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350, 631-633 (1991).
  12. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452, 198-201 (2008).
  13. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99, 237-247 (1982).
  14. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, 623-626 (2012).
  15. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
  16. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  17. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, 725-730 (2009).
  18. Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, 414-418 (2009).
  19. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
  20. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335, 831-834 (2012).
  21. Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8, 221-229 (1038).
  22. Ke, Y., et al. Multilayer DNA origami packed on a square lattice. Journal of the American Chemical Society. 131, 15903-15908 (2009).
  23. Mallikaratchy, P. Using aptamers evolved from cell-SELEX to engineer a molecular delivery platform. Chem. Commun. (Camb). 3056-3058 (2009).
  24. Hamad-Schifferli, K., Schwartz, J. J., Santos, A. T., Zhang, S., Jacobson, J. M. Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocrystal antenna. Nature. 415, 152-155 (2002).

Comments

2 Comments

  1. am a member of jove, so please allow me to watch this article(designing of bio-responsive robot from DNA origami)

    Reply
    Posted by: sushma m.
    January 13, 2014 - 1:10 AM
  2. Where can we find the .json Cadnano file for this robot?

    Reply
    Posted by: sam b.
    March 25, 2015 - 5:28 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics