DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

Bioengineering

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Summary

DNA折り紙は、DNA分子の自己集合をプログラムすることにより、正確なナノスケール物体を製造するための強力な方法である。ここでは、DNA折り紙、その後、所望の効果に中継生物手がかりを感知し、シフト形状によって対応できるロボットのロボットを設計するために利用することができる方法について説明します。

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Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268, doi:10.3791/50268 (2013).

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Abstract

核酸は驚くほど汎用性があります。記憶媒体としての本来の役割に加えて1、それらは並列計算2,3に利用することができる、と認識して結合する4,5分子または細胞標的を、化学反応触媒6,7、および生物学で算出されたレスポンスを生成するための生体情報システム8,9。重要なことに、核酸は、所望の効果を発揮させるために予め設定された応答に生物学的手がかりの検出を結ぶ単一のロボット内のすべてのこれらの顕著な特徴の統合を可能にし、2次元および3次元構造10-12に自己集合するようにプログラムすることができる。

核酸から作成形状が最初シーマン13で提案されており、このテーマに関するいくつかのバリエーションは、以来、様々な技術の11,12,14,15を使用して実現されている。しかし、最も重要なは、スキャフォールドと呼ばれるDNA折り紙、恐らくRothemundによって提案されたものです16。この技術では、長時間(> 7,000塩基)一本鎖DNA ' 足場'の折り畳み'は、ステープル'と呼ばれる短い相補鎖の数百によって所望の形状に向けられる。折り畳みは、温度ランプアニールにより行われる。この手法は、正常顕著精度と堅牢性を持つ2D形状の多様な配列の作成に実証された。 DNA折り紙は後でよく17,18として3Dに拡張されました。

現在の論文は、ダグラスらによって開発されたcaDNAno 2.0ソフトウェア19に焦点を当てます。 caDNAnoは多才な機能を備えた2Dおよび3D DNA折り紙形状の設計を可能にする堅牢な、ユーザーフレンドリーなCADツールです。設計プロセスは、それが比較的簡単かつ効率的に、DNA構造に体系的かつ正確な抽象化方式に依存する。

本稿では、DNA折り紙NAの設計を実証最近20に記載されているnorobot。このロボットは、タスクを実行するために、それが作動する感知リンクするという意味で、 "ロボット"である。我々は、様々な検出方式を構造体に統合することができます方法を説明し、どのように、これは望ましい効果に中継することができます。最後に設計された形状の機械的特性をシミュレートするためにキャンドゥ21を使用する。我々が議論する概念は、複数のタスクや設定に適合させることができる。

Protocol

我々は本論文で設計したロボットは、選択された標的細胞の表面上の受容体に結合することが可能な貨物Cを作ることによって、タンパク質Pに応答します。 。ロボットは、Cは 、受容体遮断薬であってもよく、図1に示され、成長因子などがあり、化学的にDNAオリゴヌクレオチドにリンクする方法は、その機能を破壊しないことが可能でなければなりません。ロボットには、2つの状態があります。非アクティブの場合、2の外部 '唇'上のDNAゲートは、ロボットがその中にロードされた貨物が安全に隔離されるように、閉じたままでいることを確認し、ハイブリダイズさせる。タンパク質Pの存在下で、ロボットが貨物を開き、公開することができるいくつかのメカニズムの一つ(後述)のいずれかの方法で開いた門。構造を設計するときは、ゲートは、それがそうすることを有効にすると、ロボットが閉じた状態、オープン状態に春に自体に近いのに十分柔軟でなければならないと考えています。 DNAの挙動をモデル化する熱力学的および機械的なコンポーネントを統合する構造が困難であり、実際のオブジェクトは、いくつかの改善を繰り返し必要になる場合があります。それにもかかわらず、ここでは上に構築することができ、一般的な作業モデルを用いた設計プロセス、に焦点を当てる。

注意

DNA折り紙の設計とフォールディングの過程をより包括的に理解するために、我々は非常にデザインインターフェイスにおけるDNAの抽象表現を説明ダグラスら19により元caDNAno紙を読むことをお勧め、それが実際の分子構造とどのように関連するか3DのDNAの形。本論文では、非常に明確な方法でcaDNAno表現とインタフェースを記述つのビデオチュートリアルが付属しています。さらに、当社はディーツと多くの重要な側面とキャンドゥ解析ツール21を含む折り畳み過程の詳細なプロトコルを記述する同僚で、より最近の論文を読むことをお勧めします。

TLE "> 1。caDNAno 2.0およびオートデスクマヤ2012のダウンロードとインストール

注:オートデスクソフトウェアは、学生や学術利用は無料です。以下の手順は、オートデスクでアカデミックアカウントの設定が含まれます。

  1. でアカデミックアカウントを作成http://students.autodesk.com/ 。アカウントの設定、電子メールを受信した後、アクティベーションリンクをクリックして、必要に応じてあなたの好みに記入。
  2. ダウンロードセンターからマヤ2012の無料版をダウンロードしてください。
  3. お使いのコンピュータにマヤ2012をインストールします。
  4. caDNAno 2.0をインストールする前に、一度Mayaを実行。
  5. からcaDNAno 2.0の最新バージョンをダウンロードしてインストールしhttp://cadnano.org/
  6. マヤ2012を実行します。 caDNAnoアイコンは、グラフィカル·ユーザー·インターフェースの右上隅に表示されるはずです。 caDNAnoに入るには、アイコンをクリックします。

2。 OUTL所望の形状及び足場ストランドパスINE

  1. Maya内部caDNAnoの設計インターフェースは3つのパネル(図2)が含まれています:
    1. 上部パネル:形状が最初に概説された格子ビュー、。このパネルには、二重らせんレベルのアクションを可能にした形状の断面図を提供しています。
    2. 底板:編集パネル、一塩基レベルのアクションを可能にします。
    3. 右のパネル:形状のマヤが生成し、リアルタイムの3Dモデル
  2. "ハニカム"アイコンをクリックします。トップパネルに格子の上と外でズームがそれぞれ、上下にスクロールマウスで行うことができます。
    caDNAnoは、2つの可能な設計格子、ハニカムと正方形を可能にし、正方格子は一般的にも22を使用することができるが、この論文では、ハニカムのレイアウトを使用します。
  3. 左側のパネルで、所望の形状の断面を描くことから始めます。
    各サークルには、二重らせんのDNAを表しています。 CHへ形状を構築するらせんをOOSE、単にそれらの中心(図3)を左クリックします。全体形状が概説されるまでらせんによってらせんを続行します。あるいはまた、形状がマウスの左ボタンを押して、連続的に形状の輪郭を描くことによって描くことができる。訴訟は、メニューを編集して、 "元に戻す"、またはキーボードショートカットCtrl + Z(PC)またはCMD + Zキー(Mac)でクリックすることで元に戻すことができます。
    この時点で、選択されたヘリックスが黄色に表示されます。同時に、下のパネルは、これらのヘリックスから成る形状の側面図を、表示されます。下部パネルでナンバリング螺旋はトップ1でナンバリングと一致している。
  4. 底面パネルを守ってください。行が二重螺旋の二本鎖であり、ベースを(図4)を表す各正方形で:各螺旋は正方形の二列で表されます。
    編集アクションが螺旋に沿って場所を取る場所オレンジ縦棒を決定します。グリッドに沿って基準位置は次のように表示されオレンジ色のバー上の数字。らせんフレームワークのデフォルトの長さは42拠点である。長さは編集パネルの右上隅にある灰色の矢印のアイコンのひとつをクリックし、拡張子の長さを(DNAヘリックスの2つの完全な回転に対応して21の倍数に選択することによって拡張することができ、その内の1つのターンは10.5にまたがる塩基)(図4)。グリッドが選択された矢印の方向に延在する。
  5. 形状全体の実際の足場ストランドパスをプロットするには、マウスボタンを押した最初の螺旋から開始し、彼らが最初にセクション2.3で選定されたのと同じ順序に続くすべてのヘリックスにわたって連続的に移動します。という点に注意してください。
    1. 今回選択ヘリックスは、オレンジ色に色を変更します。
    2. 下部パネルで、足場鎖断片を自動的に選択されたヘリックスで描画されます。
    3. 右側のパネルには、リアルタイムで構築された形状の3Dモデルが表示されます。これの終わりにプロセスは、足場鎖経路のドラフトは自動的に底板(図5)内に描画される。
  6. 足場のパスのすべての左端のエッジの周りに矩形を描画します。そう選択したエッジが赤(図6)が表示されますので注意してください。
  7. グリッドの左側にグループとして選択したエッジをドラッグすることで足場のパスを拡張します。パスが適切に拡張されるまで、右のエッジに対して、このプロセスを繰り返します。足場拡張子は、右のパネル(図7)で3次元形状を拡張することに注意してください。
  8. 残りの部分から分離されている足場パス部品を探し、それらを接続。我々の形状では、例えば、0-9フォーム孤立部分ヘリックス。らせん9は螺旋12(ヘリックス9​​と10の形状が隣接していないことに注意してください[トップ·パネル]ので、それらを接続することができません)に接続する必要があります。
  9. 接続するストランドにズームインし、使用して "選択"ツールは、1つ上の任意のポイントをクリックストランドの。青足場フラグメント沿っ任意のポイントをクリックすると、 'ブリッジ'アイコンはクロスオーバーが許可された位置を示す、ヘリックスの間に表示されます。これらの位置では、隣接するヘリックスの拠点は、ストランドがDNAを変形やねじれずに螺旋から螺旋にクロスオーバーすることができ、互いに直接に直面しています。各ブリッジのアイコンの横に表示される数字は、それがクロスオーバーに(図8)意志らせんの数を示します。
  10. クロスオーバーを作成するには、選択したブリッジのアイコンを左クリック。足場のクロスオーバーは、足場が螺旋から螺旋(図9)には、この時点で交差意味、生成されます。足場を横断するまで、すべてのらせんを、このプロセスを繰り返し、全体の形状をまたがる閉ループを作成し、形状の残りの部分から分離されない領域を残さない。
    クロスオーバーは、ソフトウェアの距離にまたがるように見えながら、実際には、彼らはどんなDNA塩基を含んでいないことに注意してください。物理的には、クロスオーバー"橋"は一緒に隣接するヘリックスから2拠点を結ぶDNA骨格の一リン酸単位を含む。
  11. 次のステップに移る前に、全体の足場が連続であり、それのどの部分が他人から分離されていないことを確認してください。

3。オープニングメカニズム軸を定義します。

説明ロボットはそのペイロードを公開する定義された生物学的な入力に応じて表示されます。オープニングには、2つの半分で、シェル状に起こる二つの軸のまわりで回転(ヘリックス0-29が半分を占めて、30から61は後半を構成するヘリックス)。軸はそれらの半分とのみに配置またはグリッドの左端に近い間の唯一のクロスオーバーであるヘリックス29-30と61-0の間のクロスオーバーによって形成される。右端は、ゲートストランド(後述)が含まれます。

  1. ヘリックス29-30の間の既存のクロスオーバーを消去します。クロスオーバーを消去するには、いずれかの鎖で "ニー"ポイントをクリックします。これは、クロスオーバーがされていた両方の鎖にニックを残します。縫い目ニックには、Shiftキーを押して、それぞれのニックネームをクリックします。
  2. グリッドの左端(図10)にできるだけ近いヘリックス29-30の間に新たなクロスオーバーを作成します。
  3. できるだけ近いグリッドの左端にヘリックス61と0の間に新たなクロスオーバーを作成します。

4。ペイロード添付サイトの定義

我々は足場ストランドパスをプロットが終了したら、我々は、ペイロードアタッチメント(ロード)のサイトを定義する必要があります。ロードサイトは一本鎖 '枝'としてのヘリックスを引き出さ実際主食ストランドにある。それは螺旋に沿って、この分岐は、それが所望の方向にも及ぶことを確認し、発生した場所が非常に正確に定義することが重要である。我々は任意に主食の拡張機能を定義した場合、負荷のサイトではなく内側のロボットの外側に発生する可能性があります。

Toが主食は、特定の方向にのみを拡張、我々は、本体から主食の分岐方向のためのガイドとして働く追加のらせんを、プロットしていることを確認します。所望の積載部位ステープルを延長した後、ガイドヘリックスを除去する。

  1. 私たちは、ロボットの内部側に面した4ローディングサイトを定義しましょう​​。ローディングサイトはヘリックス3、27、34、および58の外に分岐します。各サイトでは、トップパネルの内側(図11)が直面しているこれらのヘリックスに隣接螺旋をクリックします。これは、ボトムパネルのグリッドにヘリックスを追加します。まだこれらのヘリックスを二クリックしないでください。

5。ステープルズを追加し、編集

  1. "AutoStaple"をクリックします。ソフトウェアは自動的に様々な色の定番のシーケンス(図12)を追加しますステープルが右側のパネルで3D形状に追加されていることに注意してください。定番色は下と右パネルの一貫性があります。 additiでで、主食を示すインタフェースの左下のインジケータがあります。
    注:ステープルは、短すぎるまたは円形長すぎることはできません。ステープルのほとんどは、ここで生成されたこれらの基準を満たしていないと、編集しなければならない。それらを編集するための最初のステップは、(次の手順を参照)自動化されています。
  2. "AutoBreak"をクリックします。ダイアログボックスには、このアクションのためのユーザー定義パラメータを求め、(図13)が開きます:
    1. ターゲット長(BP):主食の予想長さ、可能であれば
    2. 最小長(BP):最小限の長さは、主食に許可
    3. 最大長(BP):最大長は、ステープルに許可
    4. 主食は、そのエッジとクロスの間または2つの陸橋の間に横断できる塩基対、最小限の数:XOVER(BP)にDIST MIN。
      デフォルトのパラメータを使用して、[OK]をクリックします。ソフトウェアは、(図1、その能力を最大限にするために、これらのパラメータに応じてステープルを解除されます4)。
  3. これらのヘリックスが開くようにロボットを分離可能にするために有効にするために、ヘリックス29-30と61-0の間のすべての主食クロスオーバーを消去します。主食陸橋の消去は、このアクションの結果として、短すぎる、または不合理になるステープルを修正するためのいくつかを手動で編集する必要があります。これを適切に行うには、次のセクションの指示に従ってください。
    無傷のセクション3.2および3.3で作成された足場の陸橋を残していることを確認してください。
  4. 例えば、ヘリックス29および30(図15)との間に左から最初の主食クロスオーバー(シアン、ブラックステープル)を検討してください。それが赤表示されるようにDELETEします(図16)打った後、それぞれのニーポイントまたはブリッジをクリックして、このクロスオーバーのブリッジの両方を消去します。
  5. 縫い目Shiftキーを押し、それらの間ニックネームをクリックすることにより、螺旋29上の2つのステープル。同様に、単一の主食(図17)に縫い目ストランド30上に3つのステープル。ステープルができます手動で端をクリックし、必要に応じてそれをドラッグすることによって、延長又は短縮すること。任意の主食を環状化しないように注意してください。 図18は、ステープル陸橋の完全な編集後ヘリックス29-30の間のギャップを示しています。ヘリックス0および61のためにこのプロセスを繰り返して、手動で各螺旋内のすべてのステープルを編集します。
  6. 彼らはさらに編集が必要な意味、太い線で描かれてステープルの位置を確認します。それぞれを調べ、必要に応じて修正してください。可能であれば、例えば、短すぎるステープルを消去し(図19)または拡張することができる。

6。ロードサイトとゲイツを作成

  1. トップパネルにロードサイトらせんをセカンドクリックして、エッジをクリックします(図20)、それは必要に応じてドラッグして下のパネルになり足場鎖フラグメントを拡張します。
  2. 手動Tに沿って所望の位置にオレンジ色の縦棒を配置することによって、これらの足場フラグメントにステープルを追加彼足場、Shiftキーを押しながらクリックすると、左側のパネルにあるガイドへリックス上に行く。これは、各螺旋における主食前駆体(図21)を追加します。
  3. クリックしてドラッグすることにより、全長と同様に主食前駆体を伸ばす。
  4. ガイド鎖(例えば、らせん62)とシャーシ(例えば、らせん3)との間で許可されたクロスオーバーの位置を示す、赤い橋のアイコンを探します。
  5. クロスオーバーを導入し、ブリッジアイコン(図22)をクリックするのが最も便利な場所を選択します。便利な場所は、シャーシ内の既存のステープルの最小限の編集を必要とします。
  6. ガイド螺旋(らせん62)では、ロードサイトの一部ではなく、所望の長さに参加する部分を短く主食部分を削除。所望の長さが異なる種類の貨物をロードするための特異性、および結合強度の両方を提供すべきである。一般的に、18量体尾は問題ないはずです。主食は、DRAのままを確認してくださいそれが完了するまで細い線でWN、そうでなければ、それを編集します。
  7. シャーシでは、必要に応じて変更ステープルを編集します。
  8. ガイド(らせん62)のみ主食拡張子を残して消去します。
  9. 繰り返しは、すべてのロードサイト(図23)のために6.4から6.8を繰り返します。

7。ゲートストランドの設計

ゲートストランドはヘリックスを29-30と61-0を結ぶ軸を除き、唯一のストランドです。軸線とは対照的に、ゲートストランドはクロスオーバーではない。むしろ、任意の生物学的な入力のためのセンサとして働く二本鎖セグメントを形成するためにハイブリダイズする。ゲート二重鎖が移動されると、全体のロボットはエントロピー軸とオープンを中心に展開することができます。

  1. ゲートストランドのための適切な位置を見つけます。これらはヘリックス29、30日にステープル、61、および0になります。
  2. 例えば、29-30ゲート領域を調べます。ヘリックスの上の29と30に隣接する便利な主食ストランドがありますゲートストランドとして使用することができるグリッドの右側。彼らは反対の方向に直面していることに注意してください。
  3. 形状の外でそれを拡張するために潜在的なゲート鎖の一方の端をクリックしてください。エッジが足場のクロスオーバーにわたって存在していれば、その選択は、唯一の "Stapの"(LES)がインターフェイスの上部右側にある "選択"ツールバーの "SCAF"(倍)をオフ]をクリックして、選択されていることを確認することによって単純化することができる。
  4. ゲートストランドを形成するために、両方のステープルを伸ばす。この拡張は、それ(図24)を必要とする場合、ステープルを編集します。ヘリックス0と61のゲートストランドのためにこれを繰り返します。
    センサーDNA( 例えば 、アプタマー)シーケンス完了ステップでゲート鎖配列に置き換えられますので、今のところ、実際の長さが問題ではないことに注意してください。

8。足場シーケンスを選択してください

  1. "配列"ツールをクリックします。足場鎖上のどこにカーソルを置き、クリックします。ダイアログボックスには、私たちを尋ねる開きます足場DNA源(図25)を選択します。
  2. ソースDNAを選択すると、大幅にロボットの大きさに依存します。足場鎖が〜7キロバイト長い場合、例えば、例えばM13mp18のssDNA(p7249)と、一般的に大きなDNA折り紙の形のために選択されたその拡張誘導体は(p7308など)は、フィット。設計された形状の足場は、選択されたソースよりも大幅に短い場合は、任意の主食にハイブリダイズされていない余分な足場鎖が折り畳まれた形状から突き出た一本鎖DNAのループを作成します。これは通常、比較的短いループのために少し問題を提起しながら、マルチkbの長いループが大幅にロボットのフォールディングおよび機能を妨げる可能性があります。従って、形状足場の長さに選択されたソースに合うことが重要である。

例えば、足場鎖が小さな形状を折るために必要な場合には、ダイアログボックスのプリセット源よりかなり短くなっている、カスタムシーケンス〜1,600塩基長であることができます足場として使用する。いくつかのソースが考えられる。例えば、M13mp18のは、所望の長さの断片を生成する特定の制限酵素で消化することができる。このようなソースを設計するNebCutter(で行うことができますhttp://tools.neb.com/NEBcutter2/ M13mp18のシーケンスを貼り付けて) NebCutter入力ウィンドウ、およびマッピング制限部位である。別のオプションは、New England Biolabs社から入手可能なphiX174ビリオンssDNAのHaeIIIダイジェストとして事前消化本鎖DNAを、使用することです。

  1. ダイアログボックスで、 "例えばM13mp18"をクリックしてください。選ばれたDNA配列は足場とボトムパネルの主食ストランドに追加されていることに注意してください。

9。博覧会スプレッドシートのようにRTステープルシーケンス

  1. 上部のツールバーの "エクスポート"をクリックして、主食リストの宛先ファイル名を選択します。 "保存"をクリックします。
  2. 先csvファイルを見つけて開きます。
  3. スプレッドシートには、DNA合成会社にそのまま送信することができます主食リストを示しています。最初の2列は、らせん番号と基準位置を示すカッコ内の数字を表す括弧外の数値で、開始と終了座標を表示。

10。門とロードシーケンスを割り当て

  1. 主食リストでは、いくつかのシーケンスが疑問符の文字列で始まるか、または終わることに気づくでしょう "???"これらの疑問符は足場鎖は、これらの具体的なステープルの領域とハイブリダイズしないので、それらは相補的な配列を割り当てることができないことを示す。これらは、実際には、ゲートストランドとロードサイトの我々は設計の拡張であり、従ってこれらは現在手動で割り当てる必要があります。 ゲート:
    1. ゲートは、ロボットがアクティブな状態に非アクティブに切り替えるとそのペイロードを公開しますその上に生物学的な入力の性質を決定。各単一のdsDNAゲートつの生物学的入力(またはそれ以上)に対する応答をエンコードすることができ、ロボットの活性化に必要な入力のプロファイルを定義することができるので。
      私たちはロボットの活性化を誘発する生物学的な手がかりは、伝染性の細菌の存在を示す可能性が制限酵素であることをこの例と仮定しましょう​​。
    2. 最初のゲートのssDNAストランドは彼らのヘリックスから出て分岐した直後にハイブリダイズしないことを検討してください。そうしないとゲートを設計することは折りたたみ時のハイブリダイゼーションを妨げる可能性があります。したがって、各支店は、スペーサー文字列で開始する必要があります。このシーケンスは、柔軟性を提供していますように我々は一般的に、スペーサー列としてポリ-Tを使用しています。
    3. また、目標制限座るを含む、ゲートハイブリダイゼーション領域の長さが20塩基であると仮定するその途中でのe。
    4. したがって、ゲートは次のようになります。
      [ヘリックス29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [ヘリックス30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      "....."足場鎖とハイブリダイズ主食地域を表し、したがって、それはすでに配列を有しており、変更するべきではありません。
      ランダム二重 "GTGAGTT"とその補数は制限部位の一部が開いていない確実に、かつ効果的な酵素によって消化を確保するために、いくつかの余分な拠点を提供しています。
      "x"は制限部位を示す。
      ランダム "GCTAGAG"とその補数が効率的に動作するように酵素のいくつかの余分な基盤を提供する二重ではなく、ゲートの鎖が良いロボットの閉鎖を確保​​するために十分な長さを確認します。
      ターゲットとして制限部位を選択する前に、ロボット全体の構造、ローディングサイトやゲート自体の他の部分がで消化されていないことを確認してください選択肢の酵素。この検査では、腸内細菌感染症の存在を示す可能性のある潜在的な酵素として、エンテロバクター·アグロメランスから分離NEBCutter 0カッターリスト(シーケンス全体をカットしていない酵素)強調EagI、。
    5. ゲートは今、この(黄色マークEagI制限部位)のようになります。
      [ヘリックス29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [ヘリックス30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      この設計は消化後、シーケンス"GTGAGTTCGGは"(T M = 32°C)ロボットを保持するのに十分な長さや熱力学的に安定していないことを前提としていますことに注意してはもう閉鎖した。この仮定は、ほとんどの場合、実験的に検証する必要がある。
    6. 第二のゲートは、ロボットが1つだけの酵素に応答するか、又は異なる部位で設計することができ、ロボットの特異性を増大する場合も同様とすることができる。以上の制限部位をにおいて、同じ鎖に付加することができるロボットの複雑性および特異性を折り目。
  2. ロードサイト:
    1. ロードサイトはユニバーサル配列であり得る。代替的に、装填部位は、モジュール性を減少させるしかし貨物の向き及び比率(貨物の種類ごと)の制御を向上させる独特な配列に基づくこ​​とができる。
    2. 最後に、ロードサイトオリゴヌクレオチドは、それらが任意のペイロードに共役することが可能な化学官能基を含むべきである:タンパク質、ナノ粒子などが主食方向に応じて、化学基が(5 'または3')正しい端部に取り付けられていることを確認します。

11。 CANDOでの結果をシミュレート

  1. ジョブ。JSONファイルとして保存された後、分析のためにCANDOにアップロードすることができる。 CANDOは溶液中21にその剛性と安定性を推定することができるDNA構造の有限要素法ベースのシミュレーションです。
  2. へ行くami.org /、 "ターゲット=" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
  3. "分析のためのcaDNAnoファイルを送信"し、すべての必要な情報を記入してください。
  4. CANDOでの分析は、通常15〜20分を要します。最後に、電子メールメッセージは、シミュレーション結果(図26)をダウンロードするためのリンクを提供し、私たちは分析が完了知ることができます。

12。注文DNAとロボットを折る

製品の十分な予測を示した設計プロセスが完了するとCANDO分析したら、セクション9-10に生成された短鎖リストを注文することができます。一般的には、主食のストランドは、特定の精製を必要としませんが、このようなゲートまたはロードサイトなどの特別な目的の鎖をHPLCにより精製することをお勧めします。

どちらかの原子間力によって折ら構造の可視化を含む製品のDNA順、すなわちフォールディング、精製および評価は、次の手順、顕微鏡(AFM)や透過型電子顕微鏡(TEM)、本論文の範囲外であり、これまでの報告17,18,20,21で見つけることができます。ここに設計されたロボットのTEM画像は、例えば(図27)のようになる。サンプル調製と染色はまったく同じように別の場所で21説明を行った。

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Representative Results

図1-25は、設計プロセスのステップバイステップを示すcaDNAno 2.0インターフェースのスクリーンショットです。形状の断面は、第一の足場鎖フラグメントおよび全体足場路(図7)の完了を自動的に加え、続いて、(図3)に概説した。ステープルストランドは自動的にユーザー定義のパラメータ(図14)、およびデバイスの所望の機能(図15-18)にステープルを適応することが手動で編集によると壊れて、(図12)が追加されます。 図23-24のロード方法について説明しサイトおよびゲートストランドを加え、編集される。最後に、 図27は、ここで設計されたモデルのTEM像を示す。

"/>
図1。caDNAno 2.0で設計され、オートデスクマヤ2012で生成された完成したロボットの3Dモデル、。

図2
図2。caDNAno 2.0/Autodeskマヤ2012の設計インターフェースのビュー。上部パネル:初期形状を概説するための格子パネル。底板:編集パネル。右のパネル:3Dモデルジェネレータは(セクション2.1を参照) より大きい数字を表示するには、ここをクリック

図3
図3トップPA上の図形の部分を描画ネル(セクション2.3を参照)。

図4
図4。caDNAno 2.0の下部(編集)パネル。グリッドに沿ってアクションが発生します編集どこオレンジ縦棒を決定します。右上のグレーの矢印は(セクション2.4を参照)のどちらかの側にグリッドを拡張するために使用されています。

図5
図5。トップパネルの初期輪郭(セクション2.5を参照)の後足場鎖のドラフトは大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

ogether.withinページ= "常に"> 図6
図6。すべての足場ストランドパスエッジを選択して(セクション2.7を参照してください)希望の長さへのパスを拡張する。

図7
図7は、編集アクションと一緒にリアルタイムでどのように3Dモデルの変更を示す下と右のパネルの一般的な見解は。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

8/50268fig8highres.jpg "/>
図8。ヘリックスの間にブルーブリッジアイコン(赤いアイコンが主食クロスオーバーを参照して、まだ示されていません、セクション2.9を参照)足場のクロスオーバーが許可されている位置を示す。

図9
図9選択のブリッジのアイコンをクリックして、新しい足場クロスオーバーの作成 ​​(セクション2.10を参照してください)。

図10
図10。ヘリックス29と30の間に軸(クロスオーバーできるだけ近いグリッドの左側に)(セクション3.2を参照)を作成する。


図11(セクション4.1を参照してください)ロードサイトの分岐を導くらせんを追加。

図12
図12 "AutoStaple"アクションの後の青写真。ボトムパネルと右側のパネルの主食色が一致している(セクション5.1を参照)。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図13
図13。その中に"AutoBreak"ダイアログボックスユーザーは、(セクション5.2を参照)AutoBreakパラメータを定義することができます。

図14
図14 "AutoBreak"アクション(セクション5.2を参照)した後の青写真はより大きい数字を表示するには、ここをクリック

図15
図15ステープルIのマニュアル編集螺旋29と30からクロスオーバー、削除されるべきであるステープルを配置。

5インチ "のfo:SRC =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
図16ステープルIIのマニュアル編集位置ステープルの間にブリッジを削除する。

図17
図17ステープルIIIのマニュアル編集断片化されたステープルに沿って縫合ニックを(セクション5.5を参照)。

図18
図18。ヘリックス29-30全く陸橋を示さない間に全体のギャップが(セクション5.5を参照)2をリンクします。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

= "jove_content" FO:キープtogether.withinページ= "常に"> 図19
図19。太線(彼らはあまりにも長い間、または円形の、どちらか短すぎる意味、セクション5.6を参照)に描かれたステープルのマニュアル編集。

図20
図20(セクション6.1を参照)分岐サイトをロードするためのガイドヘリックスの追加は大きな数字を表示するには、ここをクリックしてください

1highres.jpg "/>
図21。ガイドヘリックスに主食ストランドのマニュアルに加え、その分岐点は、(セクション6.2を参照)に配置することができますより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図22
図22。便利な場所にロボットシャーシ足場にローディングサイトのクロスオーバーをご紹介します(シャーシステープルの最小限の編集を必要とするもので、セクション6.5を参照してください)。

図23
図23番目に見られるように、ロードサイトステープルの眺め(セクション6.9を参照)は、もはや必要ありませんガイドらせんを、除去した後の電子ボトムパネル。

図24
図24ヘリックス29および30から、ゲートストランドとして使用されようとしている2つのステープルを拡張する。二本鎖は、ゲート重(7.4節を参照)を形成するために必須である反対の方向に直面することに注意してください。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図25
図25。足場シーケンス加算( "配列"ツール)対話あらかじめ定義された足場のいずれか一方を選択すること、または(セクション8.1を参照)カスタムシーケンスを挿入できるようにボックス、。

図26
デザインのCANDO分析の図26の結果は、ここで説明した。シミュレーションでは、要求された情報を提供し、様々なファイルを含む。zipアーカイブを生成します。ここRMSF(平方根変動を意味する)ファイル(。PNG)は、着色された "HeatMap4RMSF.txt"という名前の添付ファイルに詳述キーに従って、3視野角度からデザインのモデルを示す、描かれている。この場合には、最小RMSF(真っ青)は1.03 nmであり、95%RMSF(redest)は3.19程度である。モデル全体での色のグラデーションは 'フロントを引き起こして、ロボットの極性('前 'でゲート、'バック 'で軸)とヘリックス29-30と61-0に沿った接続ステープルが存在しないという事実に由来するバック '側はより多くを変動する'サイド。

図27
図27。この記事で設計したロボットのTEM像。サンプル調製と染色はまったく同じように別の場所で21説明を行った。

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Discussion

DNA折り紙は、ナノスケールでの任意の機能を正確に定義されたオブジェクトを作製することを可能にします。重要な次のステップは、これらのデザインに機能を統合するでしょう。多くのアプリケーションや課題が、この技術で対処できましたが、これらはDNAの自然環境を表すように、DNA折り紙から治療や科学のロボットを製造する際に特に興味がある。 DNAは既に遺伝情報記憶媒体などの細胞内分子機構とインタフェース。興味深いことに、ナノロボット、または別のマシンで折り畳まれたDNAは、まだ出力のシーケンスの一部として、ナノロボット崩壊後に所望のタンパク質の発現に中継することができ、建設材料、であることに加えて遺伝情報として機能することができます。

このホワイト·ペーパーで説明した例では、ロボットを動作させるために制限酵素を使用しています。 DNAロボットが責任れる際しかしながら、追加メカニズム入力へのdは、次のものがあります。

分子認識:我々は、最近20標的細胞上の表面にタンパク質分子を認識するDNAロボットのアプタマーベースのゲートを示した。アプタマーは、企業からのアウトソーシングなどSELEX 23などのメソッドを使用して、またはアプタマーデータベース(から使わ-in vitroで選択することができますhttp://aptamer.icmb.utexas.edu/ )。アプタマーが用いられる場合には、一緒にゲートを形成するアプタマーの相補鎖が、アプタマーのリガンドと相補鎖との変位との結合が容易になるミスマッチを含むように設計することができることを考慮することが重要である。これが不明であることができる仕組みが、アプタマーベースのゲートの感度と特異性は、どちらかの非常に厳しいが、非効率的なゲートを取得するには、二つの鎖の間のミスマッチの%を増加または減少させることによって調整され、または速くすることができますしかし漏れ1。

酵素切断:このために、ゲートは、それらがその酵素の基質を含有するように設計されるべきである。例えば、プロテアーゼの小ペプチド基質を両側からロボットは、酵素の非存在下で閉鎖し続けるゲートに繋留することができる。

リモートコントロール:DNA機に適用されていない潜在的なアプローチは、二本鎖DNAの融解24を誘導するために高周波電磁界に金ナノアンテナを用いている。これは、生体応答性のものに加えて、ユーザが操作スイッチを提供することができる。 DNA折り紙ロボットが設計し、作ることは比較的簡単であるが、それらは、治療プラットフォームとして、いくつかの技術的課題を提起。それはヌクレアーゼによる切断に対して非常に脆弱であるとしてDNAが薬物送達のための理想的な材料ではありません。また、免疫応答を沈殿させるかもしれない。生物におけるDNA折り紙オブジェクトの動作を徹底的に研究はn彼らの運命を定義し、それらが組織に集約しないことを確認してくださいまたは宿主ゲノムに統合するeeded。

要約すると、我々はcaDNAno、設計DNA折り紙の形状に簡単な、堅牢なCADツールを使用することを発表した。我々はこのような治療薬、エネルギー、メタマテリアル、教育などの分野で、DNA折り紙でアプリケーション主導の研究を見て開始したいと思っています。これらのすべての場所で​​、caDNAnoは解決策を実現する上で大きな影響を与えると予想される。将来的には、それは彼らがすべての互換性があるため、どのユーザーでも(または缶の部分)に置​​き換えることができ、工業と設計基準、なるかもしれない。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者は、非常に貴重な議論と助言、そして有用な議論や作業のためのバチェレラボのすべてのメンバーのS.ダグラスに感謝したい。この作業はバー宜蘭大学のナノテクノロジー&アドバンストマテリアルのライフサイエンスおよび研究所の教員からの補助金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autodesk Maya 2012 Autodesk A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software) (Open source) Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage) (Open source) Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  2. Adleman, L. M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science. 266, 1021-1024 (1994).
  3. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475, 368-372 (2011).
  4. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  5. Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin. Chem. 55, 813-822 (2009).
  6. Baskerville, S., Bartel, D. P. A ribozyme that ligates RNA to protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9154-9159 (2002).
  7. Bartel, D. P., Szostak, J. W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science. 261, 1411-1418 (1993).
  8. Benenson, Y., Gil, B., Ben-Dor, U., Adar, R., Shapiro, E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature. 429, 423-429 (2004).
  9. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333, 1307-1311 (2011).
  10. Rothemund, P. W., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2, e424 (2004).
  11. Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350, 631-633 (1991).
  12. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452, 198-201 (2008).
  13. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99, 237-247 (1982).
  14. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, 623-626 (2012).
  15. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
  16. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  17. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, 725-730 (2009).
  18. Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, 414-418 (2009).
  19. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
  20. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335, 831-834 (2012).
  21. Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8, 221-229 (1038).
  22. Ke, Y., et al. Multilayer DNA origami packed on a square lattice. Journal of the American Chemical Society. 131, 15903-15908 (2009).
  23. Mallikaratchy, P. Using aptamers evolved from cell-SELEX to engineer a molecular delivery platform. Chem. Commun. (Camb). 3056-3058 (2009).
  24. Hamad-Schifferli, K., Schwartz, J. J., Santos, A. T., Zhang, S., Jacobson, J. M. Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocrystal antenna. Nature. 415, 152-155 (2002).

Comments

2 Comments

  1. am a member of jove, so please allow me to watch this article(designing of bio-responsive robot from DNA origami)

    Reply
    Posted by: sushma m.
    January 13, 2014 - 1:10 AM
  2. Where can we find the .json Cadnano file for this robot?

    Reply
    Posted by: sam b.
    March 25, 2015 - 5:28 PM

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