Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare colture disperse per l'imaging a lungo termine delle oscillazioni nei reporter di fluorescenza dell'espressione genica ciclica in singole cellule isolate dall'orologio di segmentazione del pesce zebra. Ciò si ottiene sezionando prima il presoderma o il tessuto PSM da embrioni transgenici di zebrafish. Successivamente, il pezzo più posteriore del PSM, il bocciolo della coda viene sezionato da più embrioni e i pezzi vengono raggruppati nella tripsina.

Quindi i pezzi di gemma della coda vengono dispersi manualmente con una pipetta generando una sospensione cellulare. Infine, la sospensione cellulare viene piastrata su piastre di coltura rivestite di fibronectina per l'imaging a lungo termine. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano molteplici oscillazioni di intensità nel tempo da singole cellule PSM attraverso la microscopia time-lapse a fluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'ibridazione in C 2 dell'espressione genica nel tessuto PSM, è che il nostro reporter di fluorescenza consente il monitoraggio in tempo reale della dinamica delle oscillazioni nell'orologio di segmentazione a livello di singole cellule. Questo metodo può fornire informazioni uniche all'orologio di segmentazione, ma può anche essere utilizzato in altri sistemi come l'organogenesi o i modelli di malattia dove può fornirci informazioni sul comportamento a livello di singola cellula, dove le linee transgeniche appropriate sono disponibili il giorno prima della dissezione. Ottenere embrioni da un incrocio di pere zebrafish eterozigoti per l'allele transgenico.

Allevare gli embrioni in E tre terreno senza blu di metilene a 28 gradi Celsius fino allo stadio di scudo circa sei ore dopo la fecondazione o HPF trasferire gli embrioni in E tre terreno senza blu di metilene a 20 gradi Celsius durante la notte a 20 gradi Celsius. Gli embrioni formeranno un acaro all'ora una volta raggiunto lo stadio del germoglio caudale all'inizio del protocollo di dissezione la mattina seguente, gli embrioni dovrebbero essere tra le cinque e le otto, quindi potrebbero essere in fase dopo aver assemblato gli strumenti per la dissezione. Coprire un piatto di imaging con fondo di vetro con un substrato di fibronectina.

Lasciare il piatto sul banco per rivestirlo durante la dissezione sotto uno stereomicroscopio fluorescente. Identificare gli embrioni transgenici esaminando il presoderma o il PSM. Per l'espressione YFP.

La fluorescenza dovrebbe essere visibile nella regione dall'ultimo acaro formato fino al bocciolo della coda. Seleziona gli embrioni con il segnale più luminoso. Il 25% della prole dovrebbe essere costituito da embrioni omozigoti portatori di due copie del transgene utilizzando la luce trasmessa come riferimento posizionale.

Per distinguere l'autofluorescenza, trasferire gli embrioni positivi in una piastra di Petri di plastica separata contenente terreno E tre senza blu di metilene. Per preparare gli embrioni per la dissezione con un cannocchiale da dissezione utilizzando una pinza fine, rimuovere con cura il corion da ciascun embrione nel mezzo E tre. Assicurati di non danneggiare l'embrione o di non distruggere la cellula di quercia.

Riempire una piastra di dissezione rivestita con protezione cilindrica con terreno L 15 con siero utilizzando una pinza o un altro strumento piatto. Rimuovere eventuali bolle d'aria dalla superficie della protezione S utilizzando una pipetta di vetro lucidata a fuoco. Trasferire gli embrioni rivestiti nella piastra di dissezione e con gli strumenti a filo, spostare tutti gli embrioni da un lato.

Successivamente, nel piccolo pozzetto praticato nello strato di sarda all'interno della piastra di dissezione, orientare un singolo embrione sul lato laterale. Quindi, utilizzando il micro bisturi, tagliare l'embrione e la cellula vitellino appena anteriormente al cervello posteriore e attraverso il polo ventrale dell'embrione. Rimuovere il pezzo anteriore dell'embrione dal pozzetto spostandolo verso il lato del piatto.

E poi usa gli strumenti a filo per raschiare via i granuli di tuorlo rimanenti dalla sezione posteriore, incluso il PSM. Quindi, appiattisci e orienta il PSM con l'estremità anteriore rivolta verso l'esterno e la parte posteriore rivolta in avanti. Se lo strato sottile di ectoderma non si è staccato a questo punto, usa gli strumenti a filo per staccarlo dalla parte superiore del tessuto PSM usando il micro bisturi, taglia la punta più posteriore del PSM oltre l'estremità del cordone o il bocciolo della coda lontano dal resto del tessuto.

Sposta il pezzo del bocciolo della coda in un angolo del piatto lontano dall'area di dissezione e usa gli strumenti a filo per rimuovere eventuali detriti e tessuto embrionale indesiderato dalla piscina del campo di dissezione. Pezzi di gemme di coda da più embrioni a seconda di quante cellule saranno necessarie per l'esperimento. In media, un singolo pezzo di tessuto del germoglio della coda produce 1000 cellule.

Riempi un piatto di plastica vuoto da 35 millimetri con un piccolo volume di tripsin EDTA e utilizzando la pipetta di vetro lucidato a fuoco. Trasferisci i pezzi di bocciolo della coda nel piatto. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente mentre il tessuto è in incubazione nella tripsina, aggiungere milli Q di acqua alla soluzione di fibronectina uno nella piastra di imaging con fondo di vetro.

Rimuovere la soluzione e lavare dal bicchiere tre volte con acqua Milli Q. Utilizzare l'aspirazione per rimuovere ogni lavaggio e assicurarsi che il piatto sia completamente asciutto. Per visualizzare i pezzi di bocciolo della coda, pipettare 100 microlitri di L 15 con siero in un piatto di imaging.

Utilizzando una punta in gel rivestita, trasferire i pezzi di bocciolo della coda in un volume il più piccolo possibile di tripsina EDTA nella piastra di imaging. Pipettare i pezzi su e giù più volte per romperli e sospendere le cellule nel terreno. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria.

Lasciare che le cellule si depositino sul vetro rivestito di fibronectina per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere alle cellule un piccolo volume di ulteriore terreno L 15 con siero. Prima di iniziare l'imaging.

Prestare attenzione a non distruggere le celle stabilizzate. Per visualizzare le celle. Inizia posizionando il piatto nella camera climatica del microscopio time-lapse.

Impostare la temperatura desiderata e lasciare che la parabola si equilibri per almeno 30 minuti prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine. Una temperatura stabile è essenziale per misurazioni accurate del periodo. In singole cellule PSM acquisiscono immagini fluorescenti di prova per verificare tale esposizione.

Tempo e guadagno. Fornisce un'ampia gamma dinamica di intensità senza saturazione per garantire un buon rapporto segnale/rumore. Una tipica immagine a fluorescenza acquisita da cellule disperse generate dalle nostre linee.

L'utilizzo di questo protocollo richiede 400 millisecondi e 40 millisecondi per un'immagine a luce trasmessa con una telecamera E-M-C-C-D che opera a un guadagno EM di 85. Inoltre, anche il guadagno del preamplificatore e la velocità di lettura dalla telecamera sono essenziali per massimizzare il segnale rispetto al rumore utilizzando il canale di luce trasmessa, scegliere un campo di celle per l'acquisizione time-lapse. Esegui un protocollo di acquisizione time-lapse acquisendo una luce trasmessa e un'immagine a fluorescenza per campo con un intervallo di due minuti che catturerà le dinamiche temporali senza fotosbiancamento o induzione di tossicità nelle cellule.

Per elaborare i filmati time-lapse, aprire un file e dividere la luce trasmessa e i fotogrammi fluorescenti per creare due pile di immagini. Per tracciare una singola cellula nel canale della luce trasmessa, scegliere una regione circolare di interesse o ROI attorno a una cellula che era ancora sana al termine della registrazione. Questo non si muove al di fuori del campo e non entra in contatto con altre cellule.

Salva un ROI ogni pochi fotogrammi nel ROI manager e monitora la cella fino all'ultimo fotogramma. Seleziona lo stack fluorescente e con le ROI salvate, utilizza il plug-in INTERPOLATOR del cerchio personalizzato e la macro per misurare l'intensità della cella tracciata nel tempo. Controllare la traccia di output per la macro se cattura qualitativamente le caratteristiche del time-lapse di fluorescenza.

Esportare i valori in un foglio di lavoro di Excel. Salvare l'elenco ROI per la cella. Qui sono mostrate immagini rappresentative di una singola cella PSM in una registrazione time lapse di 10 ore.

Il transgene qui utilizzato genera un reporter il cui ciclo di produzione e degradazione avviene con dinamiche e livelli di espressione simili alla proteina terminale del gene endogeno nell'embrione utilizzando condizioni di imaging standard con terreno L 15 contenente il 10% di siero fetale bovino. Troviamo che le celle PSM possono produrre da due a sette picchi con la media e la deviazione standard di tre picchi più o meno uno. Il numero di picco mediano e il percentile del 25% sono due picchi, mentre il percentile del 75% è di tre picchi.

Utilizzando il nostro monitoraggio e analisi semi-automatizzati, possiamo generare rapidamente l'intensità della fluorescenza nel tempo per le singole celle PSM. Queste tracce grezze possono quindi essere utilizzate per effettuare misurazioni quantitative delle proprietà delle cellule PSM oscillanti, come l'ampiezza della frequenza, il numero di cicli e la tempistica dei picchi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'aggiunta di molecole di segnalazione o inibitori, per rispondere alla domanda su come l'oscillatore a singola cellula risponde ai fattori presenti all'esterno nell'embrione. Speriamo che questa tecnica consenta ai ricercatori nel campo della cementogenesi di studiare il comportamento delle singole cellule dell'orologio di segmentazione in un modo semplice che allontani le cellule dalla complessità delle interazioni cellulari e dei fattori a livello tissutale che rendono questo lavoro molto difficile nell'embrione intatto.