تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ال

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

منذ عقود المشيمة البشرية كان يعتقد أن يكون حاجزا لا يمكن اختراقه بين الأم والطفل الذي لم يولد بعد. ومع ذلك، فإن اكتشاف العيوب الخلقية الثاليدومايد التي يسببها والعديد من الدراسات في وقت لاحق بعد ذلك أثبتت عكس ذلك. اليوم العديد من الاكسيوبيوتك الضارة مثل النيكوتين، وصفت الهيروين والميثادون أو المخدرات، وكذلك الملوثات البيئية للتغلب على هذا الحاجز. مع تزايد استخدام تكنولوجيا النانو، والمشيمة من المرجح أن تتلامس مع جزيئات رواية سواء عن قصد أو عن غير قصد من خلال التعرض في حالة التطبيقات الطبية فائقة الصغر المحتملة. لا يمكن استقراء البيانات من التجارب على الحيوانات إلى البشر لأن المشيمة هو الأكثر الجهاز الثدييات أنواع محددة 1. ولذلك، فإن فيفو السابقين المزدوجة إعادة تدوير نضح المشيمة البشرية، التي وضعتها Panigel وآخرون. في عام 1967 2 وتعديلها بشكل مستمر من قبل شنايدر وآخرون. في عام 1972 يمكن أن يكون بمثابة نموذج ممتاز رس دراسة نقل الاكسيوبيوتك أو جزيئات.

هنا، ونحن نركز على المزدوج فيفو السابقين إعادة تدوير الإنسان بروتوكول نضح المشيمة وزيادة تطويره للحصول على نتائج يمكن استنساخه.

تم الحصول على المشيمة بعد الموافقة المسبقة من الأمهات من حالات الحمل غير معقدة على المدى تمر الولادة القيصرية. تم مقنى الأوعية الجنين والأم من فلقة سليمة وperfused على الأقل لمدة خمس ساعات. كما جسيم نموذج تم إضافة جزيئات البوليستيرين fluorescently المسمى مع أحجام 80 و 500 نانومتر في القطر إلى الدائرة الأمهات. كانت قادرة على عبور حاجز المشيمة وتقديم نموذجا مثاليا للمادة التي يتم نقلها عبر المشيمة إلى الجنين في حين تم الإبقاء على الجسيمات نانومتر 500 في أنسجة المشيمة أو الدائرة الأمهات الجسيمات 80 نانومتر. الإنسان نموذج نضح المشيمة فيفو السابقين هي واحدة من عدد قليل من النماذج توفير معلومات موثوق بها حولسلوك نقل الاكسيوبيوتك في حاجز الأنسجة الهامة التي توفر البيانات التنبؤية والسريرية ذات الصلة.

Introduction

المشيمة هي جهاز معقد وهو المسؤول عن تبادل الأكسجين وثاني أكسيد الكربون، والمواد المغذية والنفايات والمنتجات، وفي الوقت نفسه قادرة على الحفاظ على اثنين من الدوائر دم الأم والجنين المتنامي فصلها عن بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمنع رفض الطفل من قبل النظام المناعي للأم وتفرز الهرمونات للحفاظ على الحمل. يتم تشكيل حاجز الخلوية من قبل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية التي تلتحم وتشكيل مخلى صحيح من دون أغشية الخلايا الجانبي 4،5. ويتم تنظيم المشيمة كله في العديد من النبتات، والتي تحتوي على واحد شجرة الزغابي الجنين وتمثل وحدة وظيفية واحدة من المشيمة.

تم تكثيف دراسة وظيفة حاجز المشيمة مع اكتشاف التشوهات التي يسببها الثاليدومايد في عام 1960. لأسباب واضحة الدراسات إزفاء مع النساء الحوامل لا يمكن أن يؤديها. ونتيجة لذلك، تم تطوير نماذج بديلة مختلف 6،7 فيفو السابقين التي وضعتها Panigel وزملاء العمل 2،3.

تتعرض العديد من النساء إلى الاكسيوبيوتك المختلفة مثل الأدوية أو ملوثات البيئة أثناء الحمل 8. بالنسبة لبعض الأدوية التي كانت تدار بالفعل بانتظام أثناء الحمل، في الدراسات المجراة يمكن أن يقوم بها مقارنة بين تركيز دم الأم مع أن في دم الحبل السري. ومع ذلك، وعموما ليس هناك سوى معلومات محدودة عن الدوائية والديناميكية في الجنين والتشوهات الخلقية من هذه المواد.

على سبيل المثال المواد الأفيونية مثل الهيروين عبور بسهولة حاجز المشيمة ويمكن أن يؤدي إلى تقييد النمو داخل الرحم، الولادة المبكرة أو الإجهاض العفوي 9،10. لذا، في حالة من الامتناع عن ممارسة الجنس في عداد المفقودين أثناء الحمل ينصح استبدال العلاج مع الميثادون. السابقينكشفت فيفو الإنسان نموذج نضح المشيمة أن نقل الميثادون في الدورة الدموية للجنين لا يكاد يذكر 11، الذي يرتبط بشكل جيد مع دم الحبل السري إلى الأمهات نسبة تركيز الدم تحسب بعد الولادة 12.

تكنولوجيا النانو هو حقل المتنامية خصوصا في مجال الطب. لذلك، تحت طبيعيا غرامة (<2.5 ميكرون في القطر) وجزيئات متناهية الصغر (<0.1 ميكرون في القطر) في أبخرة من حرائق الغابات، الانفجارات البركانية والغبار في الصحراء، والتعرض للمواد متناهية الصغر هندسيا (بعد واحد على الأقل <0.1 ميكرون 13 ) آخذ في الازدياد. هذا أثار تساؤلات حول إمكانية السمية للمواد متناهية الصغر هندسيا. على الرغم من أن ليس هناك خطر من الإنسان يمكن أن ثبت حتى الآن، وهناك دراسات تجريبية الرئيسية تشير إلى أن الجسيمات النانوية المهندسة يمكن أن يسبب الاستجابات البيولوجية الضارة مما يؤدي إلى نتائج السمية 14. في الآونة الأخيرة، أشارت بعض الدراسات إلى أن التعرض قبل الولادة لويرتبط تلوث الهواء لحاجة الجهاز التنفسي العالي والتهاب الشعب الهوائية في الأطفال حديثي الولادة والأطفال 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام جزيئات صغيرة مثل ناقلات المخدرات لعلاج على وجه التحديد إما الجنين أو الأم. وبالتالي، يصبح من الواضح أن هناك حاجة لدراسات واسعة من الاكسيوبيوتك أو المواد النانوية متميزة وقدرتهم على عبور الحاجز المشيمي. ويلخص نظرة عامة الفعلي على الدراسات الحالية على نفاذية المشيمة إلى المواد متناهية الصغر هندسيا في مينيزيس وآخرون 2011 17 و Buerki-Thurnherr وآخرون. 2012 7.

المزدوج فيفو السابقين إعادة تدوير الإنسان نموذج نضح المشيمة يوفر نظام للرقابة وموثوق بها لدراسة النقل المشيمة من الذاتية المختلفة ومركبات خارجية 3،11،12،18،19 ومجموعة واسعة من وظائف أخرى من المشيمة مثل الآليات المسؤولة عن تطوير الحالات المرضية مثل تسمم الحمل <سوب> 20-22. في هذا البروتوكول ونحن نركز بشكل رئيسي على اقامة والمناولة والطريقة التي تسمح للدراسة تراكم والآثار ومعدلات إزفاء من مجموعة واسعة من الاكسيوبيوتك أو النانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد نظام الارواء

  1. إعداد نظام نضح تتألف من حمام مائي، وغرفة نضح، عمودين للالأوكسجين، واثنين من مضخات ماصه، واثنين من الفخاخ فقاعة، واثنين من سخانات التدفق واحد استشعار الضغط (الشكل 1). ربط هذه المكونات مع أقسام الأنابيب تتكون من السيليكون والبولي فينيل كلوريد المواد وفقا للمخطط في الشكل 2. وأخيرا هناك نوعان من دوائر تمثل الدائرة الجنين والأم، على التوالي.
  2. بدوره على حمام مائي، وسخانات التدفق والتدفئة للغرفة نضح. وينبغي أن تكون درجة الحرارة 37 درجة مئوية.
  3. الاحماء المتوسطة نضح (NCTC-135 الأنسجة مستنبت المخفف 01:02 مع العازلة ايرل (6.8 جم / كلوريد الصوديوم L، 0.4 جم / لتر كلوريد البوتاسيوم، 0.14 جم / لتر فوسفات الصوديوم، 0.2 جم / لتر كبريتات المغنيسيوم، 0.2 غرام / L كلوريد الكالسيوم، 2 ز / L الجلوكوز) تستكمل مع الجلوكوز (1 غرام / لتر)، ديكستران 40 (10 جم / لتر)، مصل بقري الزلال (10 ز/ L)، الهيبارين الصوديوم (2،500 وحدة دولية / لتر)، أموكسيسيللين (250 ملغم / لتر) وبيكربونات الصوديوم (2.2 جم / لتر)؛ 7.4 درجة الحموضة) في حمام مائي.
  4. على التوالي شطف نظم الشرياني من الدائرة الجنين والأم مع أ) 200 مل من الماء المقطر، ب) 50 مل 1٪ هيدروكسيد الصوديوم، ج) 1٪ حامض الفوسفوريك ود) مرة أخرى 200 مل من الماء المقطر (معدل التدفق: 15 - 20 مل / دقيقة).
  5. الاتصال قنية الجنين (Ø 1.2 ملم، وينبغي أن ترفق إبرة حادة إلى مجموعة التسريب المجنح إبرة تعديل) إلى الأنبوب الشرياني الجنين.
  6. شطف نظم الشرياني من الدائرة الجنين والأم مع المتوسطة نضح حتى تحتوي على جميع الأنابيب المتوسطة (معدل التدفق: مل 15-20 / دقيقة). خلال هذه الخطوة تملأ الفخاخ فقاعة وإزالة جميع فقاعات المصب من الفخ. ثم توقف المضخات. من المهم حقا أن أنابيب الشرايين وارد دائما خالية من فقاعات، وإلا بعد القسطرة خصوصا في الأوعية الجنين غرامة يمكن أن تمزق.
  7. بدوره على تدفق الغاز. والاوكسيجين الدائرة الأمهات وايال 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء الاصطناعية والدائرة الجنين مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والنيتروجين 95٪.
  8. بدء التسجيل لاستشعار الضغط.

2. Cannulating المشيمة

  1. الحصول المشيمة سليمة من حالات الحمل غير معقدة الطويل بعد العملية القيصرية الأولية. موافقة خطية يجب أن تعطى (تم الحصول عليها في حالة دراساتنا) من قبل الأمهات قبل الولادة، وأنه الدراسة إلى أن تتم الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية (كان الحال في دراساتنا). وينبغي أن يتم السيطرة البصرية الأولى من قبل القابلات لضمان وجود المشيمة صحية وسليمة.
  2. كيفية تركيب الكانيولا من المشيمة هو خطوة حاسمة! خلال نضح كل اضطراب صغير في الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى تسرب بين الدورة الدموية للأم والجنين. المشيمة لابد من الحصول عليها في غضون 30 دقيقة بعد الولادة.
  3. حدد فلقة سليمة في المنطقة الهامشية من المشيمة دون انقطاع مرئية على الجانب الأمهات. في لوحة المشيمي،ربط كل الفروع المرتبطة من الشريان والوريد السري المنبع إلى الجانب القسطرة في وقت لاحق (نحو الحبل السري) باستخدام مواد خياطة الجروح الجراحية. جعل دائما وهما عقدة.
  4. يقني؛ يدخل القنية الشريان الجنين الأولى. الشرايين المشيمة الجنين هي دائما أصغر وأرق من الأوردة.
  5. جعل خياطة حول الشريان الجنين، ولكن لا ادراك التعادل على الفور. عقد السفينة مع ملقط، وقطع سفينة بعناية ووضع قنية الصغيرة (1.2 ملم Ø) في الشريان. ثم ربط الخيط (وهما عقدة).
  6. المضي قدما في الوريد الجنين بنفس الطريقة ولكن استخدام قنية أكبر (1.5-1.8 ملم Ø، وينبغي أن ترفق إبرة حادة إلى مجموعة التسريب المجنح إبرة تعديل).
  7. بدوره على مضخة الجنين (2 مل / دقيقة). إذا لم يكن هناك تسرب مرئية وينبثق الدم من الوريد قنية الجنين، ببطء زيادة تدفق تصل إلى 4 مل / دقيقة. مراقبة الضغط في الشريان الجنين، فإنه لا ينبغي أن يتجاوز 70 مم زئبق. إذا تسرب السائل خارج في الجنين أو زميلهrnal قنية اصلاحها مع آخر غرزة.
  8. وضع المشيمة على حامل الأنسجة مع الجانب الجنين صعودا وسحب غشاء المشيمة والأنسجة على المسامير. في النهاية يجب أن يكون فلقة perfused في وسط حفرة في حامل الأنسجة.
  9. استقرار الجزء حيث يحمل سوى غشاء المشيمة مع غشاء السيليكون (Ø 1 مم) أو بدلا من قطعتين parafilm.
  10. تجميع حامل الأنسجة كاملة، وتشديد الخناق وقطع الأنسجة المتدلية. يرجى ملاحظة أن الوريدي والشرياني حقنة عادية ليست مقروص لكن بدلا من ذلك يكمن في قنوات صغيرة من حامل الأنسجة.
  11. تحويل حامل الأنسجة رأسا على عقب، ووضعها في غرفة نضح وإضافة غطاء. الآن، ينبغي أن يكون الجانب الأمهات في الأعلى. تحقق دائما إذا كانت الدائرة الجنين لا تزال سليمة والمتوسطة يتدفق من الأنبوب الوريد الجنين.
  12. بدوره على مضخة الأمهات (12 مل / دقيقة). أعرض حادة حقنة عادية ثلاث (Ø 0.8 ملم) في اله نهاية الأنبوب الشريان الأمهات في الفضاء بين الزغابات عن طريق اختراق لوحة الساقطية. لإرجاع سائل الإرواء إلى الدائرة الأمهات وضع أنبوب واحد كما استنزاف الوريدي الذي يرتبط أيضا مع مضخة الأمهات إلى أدنى موقف في الجزء العلوي من غرفة نضح.
  13. الاتصال قنية الوريد الجنين لأنبوب الوريد الجنين.

3. تنفيذ المرحلة ما قبل التجريبية من والإرواء

  1. للسماح للأنسجة للتعافي من فترة نقص تروية بعد الولادة واخراج الدم في الفضاء بين الزغابات، وهي مرحلة ما قبل الفتح من 20 دقيقة هو ضروري. وهذا يعني الوريد الأم والجنين لا تؤدي إلى خزان يحتوي على الشرايين المتوسطة نضح. جمع تدفق الوريدي الجنين والأم في زجاجة وتخلص منه بعد مرحلة ما قبل.
  2. لتقييم سلامة نضح تنفيذ المرحلة ما قبل آخر من 20 دقيقة ولكن في دائرة مغلقة. استخدام اثنين من خزانات منفصلة مع نضح المتوسطةللدائرة الجنين والأم وإغلاق الدوائر التي تقود تدفق الوريدي الجنين مرة أخرى في الخزان الجنين وتدفق الوريدي الأمهات مرة أخرى في الخزان الأمهات.
  3. للتجربة نضح الرئيسية إعداد اثنين من قوارير مع 120 مل المتوسطة نضح (واحد للأم واحدة للخزان الجنين). إضافة رديولبلد 14 C-خافضات الحرارة (4 نانوكوري / مل؛ بمثابة مراقبة إيجابية؛ تنبيه: مادة مشعة) وfluorescently المسمى أجنبي بيولوجيا أو النانوية التي يريد واحدة لتحليل إلى الخزان الأمهات. مزيج سائل الإرواء الأمهات أيضا.
  4. تبدأ التجربة من خلال تبادل والمتوسطة نضح الخالص مع اثنين من قوارير مصنوعة (الخزانات الجنين والأم). إغلاق الدوائر التي تقود تدفق الوريدي الجنين مرة أخرى في الخزان الجنين وتدفق الوريدي الأمهات مرة أخرى في الخزان الأمهات.
  5. تواصل نضح لمدة 6 ساعة وأخذ عينات بانتظام. resuspend دائما المتوسطة في الجنين والأمالخزان قبل الانسحاب.
  6. السيطرة على الضغط في الشريان الجنين (يجب أن لا تتجاوز 70 مم زئبق)، ودرجة الحموضة في كل من الدوائر (يجب أن يكون في نطاق الفسيولوجية 7،2-7،4) وحجم كل من الخزانات (فقدان الجنين حجم يجب أن لا تتجاوز 4 مل / ساعة) خلال نضح . إذا لزم الأمر ضبط قيم الرقم الهيدروجيني باستخدام حامض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم.
  7. إذا كان فقدان وحدة التخزين في خزان الجنين يتجاوز 4 مل / ساعة هناك تسرب في الأنسجة واحد لديه لوقف نضح. معدل نجاح نضح لمدة 6 ساعة دون تسرب حوالي 15-20٪.
  8. وقف نضح بعد 6 ساعة. تتحول مضخات، حمام الماء، سخانات تدفق وتدفق الغاز.
  9. إزالة المشيمة من حامل الأنسجة، وقطع فلقة perfused (أكثر إشراقا من الأنسجة unperfused) وتزن عليه.
  10. أخذ عينات من unperfused (جزء من المشيمة التي قطعت في البداية؛ يمكن اتخاذها بالفعل خلال مرحلة ما قبل) والأنسجة perfused (كل منها حوالي 1 غرام) وتخزينها في -20 ° Cحتى التجانس أو في النيتروجين السائل لتحليلها لاحقا. إصلاح عينة أنسجة أخرى في 4٪ من الفورمالين لتقييم التشريحية المرضية. وينبغي أن تشمل العينات جميع طبقات من المشيمة.
  11. تنظيف أنابيب بعد نضح من قبل الشطف تباعا أنظمة الشرياني من الدائرة الجنين والأم مع أ) 200 مل من الماء المقطر، ب) 50 مل 1٪ هيدروكسيد الصوديوم، ج) 50 مل 1٪ حامض الفوسفوريك ود) مرة أخرى 200 مل من الماء المقطر (تدفق: مل 15-20 / دقيقة).

وصفت إجراءات العمل بأكمله من التجربة نضح المشيمة في الشكل 3.

4. تحليل العينات

  1. الطرد المركزي عينات سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 800 XG قبل التحليل لإزالة الكريات الحمراء المتبقية. اتخاذ طاف لإجراء مزيد من التحليل. يمكن ترك هذه العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ويمكن لتحليل إنتاج اللبتين وقوات حرس السواحل الهايتية يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  2. لتقييم نفاذيةالمشيمة تحليل C-14 خافضات الحرارة عن طريق التلألؤ السائل. مزيج 300 ميكرولتر من العينات الجنين والأم مع 3 مل كوكتيل التلألؤ والتدبير لمدة 5 دقائق في عداد بيتا.
  3. لتقييم نقل الجسيمات النانوية الفلورسنت أو أجنبي بيولوجيا من الفائدة قراءة مضان في 485 نانومتر الإثارة و 528 نانومتر الانبعاثات في القارئ صفيحة ميكروسكوبية (موجات المشار إليها هي لتحليل التسمية أخضر أصفر التي استخدمناها للالنانوية).
  4. لتحديد الجدوى من أنسجة المشيمة خلال قياس استهلاك الجلوكوز نضح وإنتاج اللاكتات في الدائرة الجنين والأم مع نظام الغاز في الدم الآلي. بالإضافة إلى ذلك، وتقييم إنتاج هرمونات المشيمة البشرية choriongonadotropin (قوات حرس السواحل الهايتية) واللبتين في عينات الأنسجة المتجانس وperfusates بواسطة المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 4A لمحات نضح من جزيئات البوليستيرين صغيرة (80 نانومتر) التي تم نقلها عبر المشيمة مقارنة مع جزيئات البوليستيرين أكبر (500 نانومتر) التي كانت لا ينقل لحجرة الجنين. كل نقطة بيانات يمثل تركيز الجسيمات يعني إلى نقطة زمنية معينة لا يقل عن 3 تجارب مستقلة. لالبوليستيرين النانوية نقل المشيمة هي التي تعتمد على حجم 19. بعد 3 ساعة من المشيمة نضح بالفعل تم نقل 20-30٪ من وأضاف في البداية 80 نانومتر جزيئات البوليستيرين من الأمهات إلى الدائرة الجنين، في حين أن 500 نانومتر جزيئات البوليستيرين لم تظهر في الدائرة الجنين حتى بعد 6 ساعة من نضح. ومع ذلك، فإن تركيز الأمهات من الجسيمات نانومتر 500 آخذ في التناقص. وأظهرت لقطات مضان في قسم النسيجي للأنسجة بعد نضح أن هذه الجزيئات تتراكم في الزوائد في المشيمة (لا تظهر البيانات). الشكل 4B 14 C-خافضات الحرارة. خافضات الحرارة مثل جزيء دهون صغيرة يتم توزيعها على حاجز المشيمة عن طريق نشر سلبية وبمثابة الرقابة على سلامة دوائر. بعد 4-6 ساعة من نضح التوازن بين تركيز خافضات الحرارة الجنين والأم يجب أن تبنى 23. لتقييم ومقارنة معدل النقل المشيمة من الاكسيوبيوتك عادة يتم عرض المخدرات تركيز (F / M) نسبة الجنين إلى الأم (الشكل 5).

من خلال تحليل هرمون اللاكتات والمشيمة (choriongonadotropin الإنسان واللبتين) الإنتاج، فضلا عن استهلاك الجلوكوز يمكن مراقبة سلامة وظائف أنسجة المشيمة خلال نضح (الشكل 6). ينبغي أن يكون دائما القيم لperfusions مع أجنبي بيولوجيا في نفس النطاق مثل القيم من نضح التحكم دون أجنبي بيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، histop يمكن أن يؤديها تقييم athological من أنسجة المشيمة perfused. ويمكن مقارنة مع أنسجة المشيمة غير perfused ثم تكشف التغيرات المرضية بسبب نضح (على سبيل المثال التلوث الجرثومي)، وبالتالي يمكن أن تكون بمثابة مقياس آخر لمراقبة الجودة.

ونشرت نتائج ممثلة أخرى تم الحصول عليها مع الجسم الحي المزدوجة إعادة تدوير الإنسان نموذج نضح المشيمة السابقين مؤخرا 11،19.

الشكل 1
الشكل 1. خارج الحي نضح المشيمة البشرية انشاء. 1) حمام الماء مع خزانات الأم والجنين، 2) غرفة نضح، 3) فخ فقاعة، 4) أعمدة مكساج، و5) سخان التدفق.

load/50401/50401fig2.jpg "/>
الشكل 2. توضيح تخطيطي لنموذج الإنسان خارج الحي نضح المشيمة FA: الشريان الجنين؛ FV:. الوريد الجنين؛ MA: الشريان الأمهات؛ MV: الوريد الأمهات؛ BT: فقاعة فخ؛ PS: استشعار الضغط

الشكل (3)
الشكل (3). إجراءات العمل من التجربة البشرية نضح المشيمة فيفو السابقين. بعد الولادة المشيمة لابد من مقنى في غضون 30 دقيقة. قبل ساعة المرحلة التجريبية 6 مع إعادة تدوير يجب إجراء ما قبل مرحلة والمنجزة قبل مرحلة مفتوحة لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل منهما.

الشكل 4
الشكل 4. ملامح نضح من جزيئات البوليستيرين و14 </ سوب> C-19 خافضات الحرارة. الملف الشخصي الإرواء من جزيئات البوليستيرين في أحجام 80 نانومتر (ن = 4) و 500 نيوتن متر (ن = 3). في البداية 25 ميكروغرام / مل الجسيمات و4.2 نانوكوري / مل 14 أضيفت C-خافضات الحرارة إلى الدائرة الأمهات. تم قياس كمية الجسيمات (A) و 14 C-خافضات الحرارة (B) في دوائر الأمهات (M، رموز الصلبة) والجنين (F، رموز فتح) بعد نقطة زمنية المشار إليه. المعروضة هي متوسط ​​تركيز ± SE. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الشكل 5. وكانت النسب بين التركيزات الجنين والأم من 14 C-خافضات الحرارة والبوليسترين حجم الجسيمات التي تعتمد على نقل جزيئات البوليستيرين عبر المشيمة البشرية 19. أحسبخاضعة للتنظيم بعد 180 دقيقة من المشيمة نضح. تمثل البيانات يعني ± SE لا يقل عن 3 تجارب مستقلة. عمود التحكم يصور perfusions دون الجزيئات ولكن مع 14 C-خافضات الحرارة. (* P <0.05 مقارنة مع 80 نانومتر القيمة الدفترية).

الشكل (6)
الشكل (6). بقاء أنسجة المشيمة خلال نضح 19. (A) استهلاك الجلوكوز وإنتاج اللاكتات في المشيمة perfused. عرض هو مجموع التغيرات في المحتوى الكلي في الدوائر (الجنين والأم) على مر الزمن مقسوما على الوزن من فلقة perfused. (B) صافي إنتاج تطبيع (مقسمة NP حسب المحتوى الأنسجة الأولية T0) من هرمونات المشيمة البشرية وchoriongonadotropin اللبتين. تمثل البيانات يعني ± SE من في Lالشرق 3 تجارب مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحت نضح إعادة تدوير مزدوج أظهر هنا، وهناك عدة تكوينات تجريبية أخرى ممكن اعتمادا على السؤال الذي لابد من الإجابة عليها. وتستخدم perfusions المشيمة مفتوحة خاصة عادة لتقييم التخليص المخدرات في تركيز ثابت للدولة 3. نضح اعادة توزيع مجموعة المتابعة يمكن تطبيقها أيضا لتأكيد النقل النشط للمواد داخلية أم خارجية. لهذا النهج نفس التركيز من أجنبي بيولوجيا لابد من إضافتها إلى الأمهات والدورة الدموية للجنين. يفترض أن هناك النقل النشط ضد تدرج التركيز، وتراكم مادة الاختبار في أي واحد من كل من دوائر ويمكن ملاحظة 24. من المذكرة، إضافة مادة الاختبار فقط إلى الدائرة الجنين هو أيضا ممكنا ويمكن أن تكشف عن آلية النقل عبر حاجز المشيمة من معين هذه المادة 25.

تطورت خلال بروتوكول تيمه ويمكن أن تختلف بين المجموعات البحثية المختلفة خاصة فيما يتعلق معدل التدفق، وتكوين المتوسطة نضح، شكل من أشكال الأوكسجين والتدفئة 26،27. خصوصا أن معدل تدفق يمكن أن تؤثر على الوقت الذي يحدث نقل بطريق المشيمة. للسيطرة على هذا، بالإضافة إلى وجود مركب إشارة نقلها بشكل سلبي مثل خافضات الحرارة هو المهم. معدل نقل للأجنبي بيولوجيا يمكن دائما مقارنة مع معدل نقل خافضات الحرارة (يجب أن يكون نسبة F / M أعلاه 0.75) 26. منذ يتم نقل خافضات الحرارة تقتصر أساسا من تدفق وتبادل سطح، هذه المقارنة يأخذ الاختلافات في تدفق وحجم فلقة perfused في الاعتبار والتي يمكن أن تختلف بين التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة FITC-ديكستران إلى الدائرة الجنين ليكون بمثابة الرقابة على سلامة حاجز 26. ويستخدم أيضا فقدان حجم الجنين كعلامة لسلامة الحاجز. عادة ما يكون فقدان الجنين السائل تصل إلى 4 يسمح مل / ساعة 28، ولكنإعادة يوجد حد المقبولة عموما.

ومن الواضح أن هناك بعض عيوب الإنسان طريقة نضح المشيمة فيفو السابقين مثل الاختلافات بين الفرد ونسبة نجاح منخفضة (15-20٪). وعلاوة على ذلك، يمكن لفترة نضح من 6 ساعة لا محاكاة العلاج من تعاطي المخدرات المزمن، وبالتالي لا يمكن استبعاد تماما على نقل أجنبي بيولوجيا بعد التعرض لفترة طويلة. قيود أخرى من هذا النموذج هو أن أساسا نقل بطريق المشيمة في الأجل يتم تقييم في حين أن معدل النقل في سن الحمل في وقت مبكر عندما يكون الحاجز هو أكثر سمكا لا يزال غير معروف. في الواقع، نضح من المشيمة الثلث الأول هو ممكن ولكن توافر هذه المشيمة محدودة نوعا ما. ومع ذلك، حتى الآن على فيفو طريقة نضح المشيمة السابق هو النموذج الوحيد لدراسة نقل الاكسيوبيوتك أو النانوية في مختلف أنسجة المشيمة البشري المنظم. بينما الديناميات السمية في نموذج نضح الإنسان فيفو السابقين يمكن تحليلها إلا في PLالأنسجة acental، يمكن أن التجارب على الحيوانات تقدم في الواقع أيضا معلومات حول الأجنة. رغم ذلك، بسبب الاختلافات التشريحية للحاجز المشيمي بين البشر والقوارض هذه النتائج لا يمكن استقراء للبشر 4،5. وهناك إمكانية أخرى للتحقيق في نقل بطريق المشيمة قد تكون نماذج ثقافة الخلية مثل cytotrophoblasts الأولية، خطوط الخلايا المشيمة، معزولة حويصلات غشاء البلازما أو إإكسبلنتس أنسجة المشيمة 29. النموذج الأكثر استخداما هو خط الخلية BEWO؛ وتستمد هذه الخلايا من المشيمة الحمل الخبيثة، ويمكن تشكيل أحادي الطبقة متموجة على نفاذية الغشاء، لذلك لا يمكن أن يؤديها دراسات النقل. نتائج دراسات النقل باستخدام نموذج الخلية BEWO تتطابق جيدا مع النتائج التي تم الحصول عليها في السابق فيفو نضح المشيمة البشرية 30. ومع ذلك، لدراسة تفاصيل نقل المخدرات (على سبيل المثال مساهمة بروتين النقل محددة) والتمثيل الغذائي، قد يكون نموذج الخلية BEWO مخام ممكنا في المقام الأول لأنه من الأسهل في التعامل معها وعرضة للتلاعب مثل التعبير عن النقل المعدلة وراثيا أو الإنزيمات، ولكن فيما يتعلق بالدراسات نقل المخدرات العامة هي مصداقية هذا النموذج محدودة. انها تفتقر الى تدفق الدم وسلامة أحادي الطبقة لابد من تقييمها بعناية نظرا لأنه يعتمد على عوامل عدة مثل ظروف زراعة الخلايا وزرع البذور كثافة ومدة التعرض والغشاء إدراج 6،29.

الاكسيوبيوتك مختلفة وأيضا النانوية ربط بروتينات البلازما المختلفة التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نقل بطريق المشيمة 31، وبالتالي النظر في ملزمة لبروتينات البلازما هو المهم. وسيلة نضح يحتوي على مصل بقري الزلال، وبروتين البلازما الأكثر شيوعا. مؤخرا، أظهرت الدراسة أن نسب نقل مختلف المواد التي تم الحصول عليها مع نموذج الإنسان نضح المشيمة فيفو السابقين تتطابق جيدا مع الجسم الحي في دم الحبل السري إلى الأمهاتنسب تركيز الدم عندما تم تعديل نسب نقل وفقا لمدى البلازما بروتين 12 ملزمة.

وعموما، فإن الجسم الحي نموذج نضح المشيمة السابقين هي طريقة صحيحة وموثوقة لدراسة النقل عبر المشيمة البشرية والتنبؤ في الجسم الحي مرور بطريق المشيمة من الاكسيوبيوتك والنانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

ويؤيد هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية، (المفدال برنامج 64، منح لا 4064-131232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics