从脐带血分离的前体B细胞亚群

Immunology and Infection
 

Summary

在这里,我们描述的协议子集的前体B细胞从脐带血中隔离开来。阿足够的数量和质量,可从细胞中提取核酸,并且用于在随后的实验,利用DNA或RNA。

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Almamun, M., Schnabel, J. L., Gater, S. T., Ning, J., Taylor, K. H. Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (74), e50402, doi:10.3791/50402 (2013).

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Abstract

脐带血造血祖细胞是高度浓缩在不同血统的承诺阶段。我们已经开发出了一个协议,用于在四个不同的分化阶段的B细胞前体隔离。由于基因的表达和表观遗传修饰发生在以组织特异性的方式,这是极为重要的,以便能够识别的基因组和表观基因的改变,可能会导致疾病的发展的组织​​和细胞类型来区分。此方法可适合于任何类型的细胞中存在的在任何阶段的分化脐带血。

该方法包括4个主要步骤。首先,单核细胞,通过密度梯度离心分离。二使用生物素共轭的抗体,该抗体识别和除去非从单核细胞中的B-细胞,B-细胞富集。第三次的B-细胞,荧光标记与特定于各个阶段的细胞表面蛋白的抗体B细胞的发育。最后,该荧光标记的细胞进行排序和个别人群中回收。将回收的细胞是下游核酸检测中要使用的足够的数量和质量。

Introduction

为了识别异常疾病的存在,这是非常重要的,我们用健康的组织或细胞受该疾病影响的组织或细胞类型相对应的。其中一个原因是,负责调控基因表达的表观遗传变异之间的组织类型是至关重要的细胞分化过程中正常的人类发展1,2。第二个原因是,异常的组织特异性基因的调控可能会造成严重的后果正常发展,并有助于包括癌症在内的多种疾病状态。因此,更好地了解造血干细胞的疾病,它涉及需要健康的造血干细胞的知识。

造血干细胞在骨髓中通过系统其特征在于,在细胞表面表达的变化的事件顺序所得的发展标记3。研究涉及成人学员如图,骨髓通常包含一个低的前体B细胞4,5;而涉及儿童参加的研究表明,B-细胞前体的比例是比较高的,在不到5岁6个人。血液相关的疾病和恶性肿瘤的治疗中被用作脐带血的造血干细胞的来源,是现成通过脐带血的银行,并且富集未成熟的B细胞和T细胞的7,它的靶细胞的多种疾病,包括白血病和淋巴瘤。

前体B细胞在骨髓中已被广泛的QTL 8,9和由成不同的子集,可以用于分类,这些细胞的特定的细胞表面标志物的存在下,可以定义。正常的B细胞分化开始与最早的原B细胞在骨髓中和最终在不成熟或幼稚的B细胞通过一系列的阶段所得。据车ZELM和他的同事10其特征在于,原B细胞的CD34的存在,和在第2阶段的过渡到(预BI)CD19获取。第3阶段(前BII)细胞不再表达CD34和,开始表达胞质IgM抗体。最后,第4阶段(未成熟的B细胞)的定义性特征是表面IgM的表达。在该协议中描述的排序策略首先描述由Caldwell和他的同事6和包括只有3细胞表面标志物,从而大大降低了复杂性和成本进行细胞分选实验使用。在他们的工作中,CD45和B细胞分化的阶段之间的关系成立。他们观察到的B细胞在骨髓中显示可变的CD45的表达水平的。具体而言,细胞表达高水平的CD45细胞表达表面IgM(未成熟的B-细胞)相对应,这些表达的CD45的中间电平相对应的细胞表达cytoplasmic IgM的(预BII细胞),和那些表达低水平的CD45对应的细胞不表达细胞质的IgM(预BI细胞)。该协议使用的策略开发人员,Caldwell和他的同事们6隔离子集的前体B细胞从脐带血中( 图1),可以用在需要高品质的核酸,如甲基化的CpG岛恢复测定的下游检测(MIRA )11和定量实时PCR测定。的方法,采用使用磁珠耗尽所有非B细胞从脐带血中的初步分离,并要求只有3个抗体(CD34,CD19和CD45)染色。所回收的细胞代表B细胞分化的4个阶段:1)的CD34 + CD19 +(晚亲B和早期预BI)的2)的CD34 - CD19 +,CD45低 (晚期预BI); 3)CD34 - ,CD19 +,CD45 MED(预-BII)和4)的CD34 - ,CD19 + CD45 (未成熟的B-细胞)。

Protocol

1。脐血单个核细胞分离

  1. 准备EDTA的PBS缓冲液中添加5毫升牛血清白蛋白(BSA)的储备溶液至95毫升漂洗缓冲液(1:20稀释)。德加的缓冲和保持缓冲区冰。 重要提示:未脱气缓冲隔离时,可能会导致在不到最佳的效果CD19 + B细胞,因为气泡会阻止隔离柱。
  2. 准备50毫升锥形管密度梯度离心法。确定所需的处理的脐带血管的数目(1管可以处理血8毫升),并在每个管中加入15毫升的Ficoll-Paque联合PLUS。
  3. 用24毫升的DPBS(1X),并仔细层稀释脐血混合物在每个50 ml锥形管的顶部,用Ficoll-Paque联合PLUS稀释8毫升脐带血。不要混合血液和帕克的Ficoll-PLUS。 重要提示:为了避免混合脐带血和帕克的Ficoll-PLUS,保持在45度角的管层的血液混合物缓慢。
  4. 在20℃下离心40分钟,在400×g离心单核细胞(MNC)将保持在等离子体的Ficoll-Paque联合PLUS接口,而粒细胞和红细胞的沉积物由于更高的密度的Ficoll-Paque PLUS的渗透压。出版商7 5 ml圆底使用的钢管,在与该样本ID,日期,和下面的第3部分:
标签 目的
1 未染色的未染色流式细胞仪检测细胞正常化
2 7AAD 要确定在流式细胞仪的可行性
3 + + + + 包含将被排序的细胞
4 34 + 为了收集CD34 + / CD19 +(晚B - 提前预BI)细胞
5 45 为了收集CD34 - / CD19 + / CD45 (BI)细胞
6 45 MED 为了收集CD34 - / CD19 + / CD45 MED细胞(前BII)
7 45 为了收集CD34 - / CD19 + / CD45 (未成熟的B细胞)

外套管4,5,6,和7与2%FBS和所有的管子放置在冰上。

  1. 吸上的等离子层,仔细,避免与单核细胞层接触。使用10毫升玻璃吸管小心转移到一个新的50毫升锥形管中的单核细胞层。的单核细胞从三个管结合成一个单一的50毫升的试管一起。
  2. 填充管,PBS,轻轻混匀,在300 XG离心10分钟,20°C。小心吸出上清液,不干扰细胞沉淀。重复1倍。在第一次洗涤后,悬浮颗粒,并转移到一个单一的50毫升锥形管。
  3. 轻轻重悬细胞沉淀,在200μl的PBS中。删除1微升的细胞悬液,加入1毫升的PBS在1.5 ml离心管中,并预留计数(计数细胞后,将50 ml细胞悬浮液在离心机中)。用PBS填充管,并在200×g离心15分钟以除去血小板离心。完全去除上清,不干扰细胞沉淀。

2。改进的B-细胞使用MACS分离的单个核细胞的分离

  1. 从1.7步为160μl冷(4℃),EDTA-PBS缓冲液重悬沉淀。
  2. 加入40μlB-CLL生物素的抗体鸡尾酒。移液管拌匀,于4℃孵育10分钟
  3. 洗涤细胞 - 加1毫升冷(4℃),EDTA-PBS缓冲液,每10万个单元格(单元格NU人數确定步骤1.7)中,并在300×g离心10分钟,离心。完全吸取上清,然后在320微升冷(4℃)EDTA的PBS缓冲液中重悬细胞沉淀。
  4. 加入80微升抗生物素微球,搅拌均匀,于4℃孵育15分钟
  5. 洗涤细胞 - 添加1ml冷的(4℃)EDTA的PBS缓冲液,每10万个细胞,在300×g离心10分钟离心。在低温(4℃)EDTA-PBS缓冲液500μL重悬到100万个细胞。根据细胞数的比例缓冲液体积。
  6. 准备MACS柱和MACS分离器在离心过程中(步骤2.5)。一个LS柱放置在磁场的MACS分离器中,加入3毫升冷的(4℃)EDTA的PBS缓冲液中,在色谱柱上,并允许在缓冲区中的通过柱滴落。使用一个插座,以赶上流过。丢弃流过。
  7. 栏下方放置一个50毫升锥形管和移液到柱上的细胞悬浮液。允许未标记的细胞滴通过省h的色谱柱并进入50毫升锥形管。重要信息:这些将用于抗体标记的细胞分选的细胞。不要丢弃流过。为了恢复所有的细胞从步骤2.5,添加额外的1毫升的冷(4℃)EDTA的PBS缓冲液中的锥形管的壁。轻轻混匀列上移液剩余的细胞悬浮液。重复1倍。收集在锥形管中使用的标记的细胞通过柱后,继续到步骤2.8。
  8. 填充的锥形管,含有未标记细胞在300×g离心10分钟(用PBS)和离心机。小心地取出,而不会干扰细胞沉淀,取上清液。加入200μl的EDTA-PBS缓冲液中,并轻轻悬浮细胞。

3。抗体标记细胞分选和准备

  1. 管标记为“未染色的”(步骤1.4)的细胞悬浮液,并放入吸液1微升。加入500μlEDTA的PBS缓冲液,并在冰上储存管。
  2. 加入20微升每种抗体(CD19,CD34和CD45)每百万个细胞的到其它细胞悬浮液。充分混匀,并放置在黑暗中30分钟,在RT管。 CD抗体是光敏感的,完整的步骤2-4关灯。
  3. 抗体孵育30分钟后,吸取40微升细胞悬浮液,并将其放置到管标记为“7AAD”。到管中并离心,在500×g离心2分钟,加入1毫升的PBS。除去上清液,加入100μl的结合缓冲液中重悬细胞。加入7微升7AAD(7 - 氨基放线菌素D),并在黑暗中孵育10分钟,在RT。在孵育10分钟完成步骤3.4。
  4. 加入PBS中含有剩余的细胞标记的抗体与CD的管的顶部。离心管中于500×g离心3分钟。除去上清液,加入500μlEDTA的PBS缓冲液中重悬细胞沉淀。的整个体积的细胞悬浮液转移到管中,标记为“+ + +”。要恢复所有的细胞悬浮液中西元一个额外1毫升EDTA-PBS缓冲液的50毫升锥形管和管转移到标有“+ + +”。
  5. 孵化后(步骤3.3),加入300μl结合缓冲液到7AAD管。 “不染”,“7AAD”和“+ + +”样本和“34 +”,“45低 ”,“45 MED”和“45 ”管准备流式细胞仪检测。

4。使用的MoFlo XDP流式细胞仪细胞分选

  1. SET-UP MoFlo排序:对准激光器,稳定液滴流,确定截止延时。
  2. 准备根据制造商的说明使用Invitrogen ABC鼠标磁珠试剂盒(或类似)的单一色彩补偿控制。运行单一颜色控制,调整荧光通道的电压,以获得最佳分离阳性和阴性的人群。设置补偿系数,适用于收集协议的补偿参数。重新建立补偿系数每一次得到一个新的大量的抗体。
  3. 创建协议包括如在图2中示出的图。
  4. 运行未染色的样品,正向和侧向散射光的设置电压和增益,并确定负荧光人口。由于DNA恢复目标的排序,应设置阈值低(≤1%),因此,DNA的碎片不会污染回收的样本。 *确保在任何时候,生活被上运行的MoFlo的人体细胞的气溶胶疏散系统正在运行。
  5. 运行一个小的分量+ + +样品(约50,000个事件),设置的门控策略( 图2)。由于B-细胞的祖细胞不分散等同于成熟的B细胞,背栅非门CD19 + / CD34 +人口,到SSC和FSC情节的,以确保淋巴细胞门,包括潜在的原B细胞。从这个示例还设置负的荧光人口为7AAD。
  6. 运行的7AAD的的样本,以确定样品的可行性。只有细胞的样品具有高生存能力的排序一开始(≥95%),死亡的细胞会弄脏不分青红皂白地和可能污染排序人群。
  7. 设置排序的决定,收集四个群体:CD19 + / CD34 +,CD19 + / CD34 - / CD45 ; CD19 + / CD34 - / CD45 MED和CD19 + / CD34 - / CD45 很高的 。包括在排序的决定的所有人群的的淋巴细胞和双峰歧视门。
  8. 在分拣小费为防止堵塞,过滤器+ + +示例通过40μm紧接排序和重新过滤,排序,如果没有聚合发生在样本期间之前的细胞过滤网。
  9. 分类的细胞到涂覆有2%FBS的在PBS中,在冷却的或冰的包装管夹持器的收集管(步骤1.4)。
  10. 排序后立即完成后,提取DNA。

Representative Results

样品之间变异的细胞排序( 表1)的成功起到了重要作用。具有良好的成功率的样品污染的碎片有低的水平( 图3A)和成功率差的样品具有高的水平的污染的碎片( 图3B)。样品之间的变化可以在一定程度上控制,如果脐带血样本收集在24小时内装运(O / N优先)。

排序的流动从每个前体B-细胞亚群细胞是足够的数量和质量来执行核酸隔离。分离的DNA是高品质的,并可以用在下游分析。我们经常在MIRA 11利用该DNA甲基化后的DNA( 图4),以丰富。

造血干细胞储存设施数据 差排序
工作血容量抗凝血剂(毫升) 110 104
白血细胞[10 3个 /μl] 8.68 11.19
淋巴细胞[10 3个 /μl] 3.88 3.76
淋巴细胞(%) 44.70 33.6
红血细胞[10 6个/μl] 3.65 3.05
内部数据
后细胞数的Ficoll-Paque 206 M 309米
MACS分离后的细胞数 22 M 16.5米
“事件总数的计数(MoFlo XDP) 30.57中号 19.97中号
存活率(%) 98.00 98.00
细胞的淋巴细胞门(%) 17.00 50.00
CD19 + / CD34 +
总细胞数 10959 48316
事件总数的百分比 0.04 0.24
效率 88% 88%
CD19 + / CD34 - / CD45
总细胞数 16619 26941
事件总数的百分比 0.05 0.13
效率 89% 87%
CD19 + / CD34 - / CD45 MED
总细胞数 469745 507540
事件总数的百分比 1.54 2.54
效率 89% 89%
CD19 + / CD34 - / CD45 很高的
总细胞数 1896062 2047142
事件总数的百分比 6.2 10.25
效率 91% 90%

表1中。代表性的细胞排列的统计数据。行1-5提供脐带血设施的计数。其余行是在我们的实验室中收集的数据。可怜的排序含有高含量的碎片和细胞的淋巴细胞门的比例很低。

图1
FiguRE 1。处理程序的流程图。脐带血单核细胞分离使用的Ficoll-Paque联合加。包括一个额外的洗涤步骤,以除去污染的血小板。 B-细胞,分离出单核细胞,使用的MACS人B-细胞分离试剂盒(B-CLL)。此步骤中使用生物素标记的单克隆抗体(CD2,CD4,CD36,CD11b和抗-IgE和CD235a),以除去所有非B细胞。回收的B-细胞标记CD19-APC,CD34-PE,CD45-FITC抗体,然后排序使用的MoFlo XDP流式细胞仪检测,恢复前体B细胞亚群:CD19 + / CD34 +,CD19 + / CD34 - / CD45 CD19 + / CD34 - / CD45 MED,和CD19 + / CD34 - / CD45 很高的

图2
图2。门控策略,识别和排序弹出ulations红色箭头表示的栅极被施加到随后的情节。 R4,R5,R6和R7的门显示的排序条件种群。a)远期-侧散点图示出富集淋巴细胞群。 R1,淋巴细胞门。b)高度与宽度的前散点图确定单个细胞与双峰。 R2,单细胞的大门。 三)CD19-APC阳性细胞分为CD34-PE阴性和阳性的人群。 R3,CD19 + / CD34 -门; R4,CD19 + / CD34 +门表示所需的排序人口D)CD19 + / CD34 -细胞分为三种稍微不同的CD45-FITC人口的。 R5和R6,CD19 + / CD34 - / CD45 ,CD19 + / CD34 - / CD45,分别MED人群。 R7,因为细胞中的CD19 + / CD34 - / CD45 人口数量,这种门仅包括的人口的一部分。所有细胞这一人口不进行下游分析需要收集。

图3
图3:A)水平低,污染柱富集后的碎片。 R1,淋巴细胞门。b)高柱富集后的碎屑污染水平。

图4
图4。富集的前体B-细胞的子集。)经声波处理的前体B细胞亚群的分离的DNA是被甲基化了的DNA的高品质。对于图书馆建设中的DNA进行超声处理的平均200-600个基点。第1道:Promega公司的100 bp的阶梯(目录#G2101);泳道2:分离出CD19 + / CD34 +细胞的总DNA,泳道3:总DNA分离出CD19 + - / CD45 细胞;四巷:100 ng的DNA分离出CD19 + / CD34 - / CD45 MED细胞;弄5号100 ng的DNA分离出CD19 + / CD34 - / CD45细胞。 DNA的超声处理使用Diagenode Bioruptor高温共9分钟(30秒,30秒OFF)。 DNA是柱纯化,并可视化,在1%琼脂糖凝胶电泳,用SYBR绿色核酸凝胶染色。 二)MIRA使用ActivMotif MethylCollector超试剂盒,PCR与SLC25A37(1-6)和APC1(7-12)后,进行确认富集的甲基化DNA。 1 - 7:声波处理的基因组DNA(没有MIRA),2&8:MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3和第9:MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 DNA; 4和10:MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 MED DNA; 5 - 11:MIRA CD19 + / CD34 - / CD45 DNA ; 6和12:水的控制。高等扩增SLC25A37确认被甲基化了的DNA的富集的子集的前体B细胞。

Discussion

用的协议的成功的影响最大的因素是存在污染的碎片。如果请求的帘线血库的血液从它重要的是,有血液采集后尽快装运尽可能。此外,样品被归类为淋巴细胞增多含有较高数量的淋巴细胞;然而,这些样品不具有足够数目的前体B细胞,不应该使用。为了增加获得足够数量的细胞,我们建议至少85毫升脐带血开始的每一个的前体的子集的概率。

重要的是要注意,不像成人外周血分离时,分馏脐带血单核层往往是与红血细胞12污染。该协议包括一个额外的清洗步骤,以去除污染的血小板。协议描述了从脐带血单核分离建议,包括裂解步骤TØ删除不需要的红细胞。我们不建议这一步,因为它产生污染的碎片和的单元格进行排序的成功有负面影响。

为了减少数量的细胞,通过流式细胞术来加以区分,它是必要的执行之前的B-细胞富集细胞分拣。的协议,伴随着B-细胞分离试剂盒(B-CLL),由美天旎生物技术公司,提供优化的外周血,并建议使用10μL的B-CLL生物素的抗体鸡尾酒每10万个细胞。此步骤使用抗CD2(T细胞,NK细胞),CD4(T细胞),细胞CD11b(粒细胞,单核细胞,巨噬细胞),CD16(NK细胞,巨噬细胞,肥大细胞),CD36(血小板),CD235a(红系细胞)耗尽非B细胞从脐带血。重要的是要使用所述的试剂盒,而不是B细胞分离试剂盒II,因为前者套件包含CD43的抗体,它是存在于原B细胞。在我们的运timization这个协议,我们发现,共有40微升的B-CLL生物素的抗体鸡尾酒足以产生阳性细胞的排序结果。此外,我们发现,使用B-CLL的生物素抗体鸡尾酒低至5微升的单元格进行排序产生了不利的影响。因此,我们强烈建议您使用40μL的B-CLL生物素的抗体鸡尾酒单核细胞数在175-250万美元之间。如果开始的较低或较高的细胞数,可能有必要相应缩放试剂。

有许多相互矛盾的出版物描述的标记,可用于区分B-细胞的亚群的。大多数的差异可以通过以下说明的事实,即分化是一个持续的过程中,细胞表面标志物的存在或不存在下在渐进的方式,而不是在一个全有或全无的方式发生。在这个协议中的CD34 - / CD19 +和CD45 +的强度水平(低,中,高)的表达被用来区分预BI,预-BII和未成熟的B细胞的CD45的表达水平对应于分化6的进展增加。前B细胞已被有些人所描述的是CD19 + / CD34 + 13,而另一些则表明,前B细胞CD19 - / CD34 +前BI细胞CD19 + / CD34 + 9,10。基于这些差异,我们已指定为已故亲B细胞/的早期预BI细胞CD19 + / CD34 +细胞。重要的是要注意,这种策略的开发是为了隔离前体B细胞,对应于受疾病的急性淋巴细胞白血病细胞的子集。但是,也有多个分类策略取决于感兴趣的细胞亚型,也可以采用。

抗体 - 荧光染料的组合的选择应基于可用的细胞分选仪的能力。作为一个属升规则,应使用面板中最亮的荧光标记人口最少的抗原,反之亦然。在双染人群,尤其是罕见的事件,如检测,双重歧视( 图2B)是一个非常重要的部分,门控策略。这可确保双阳性的事件是真正的单一的细胞与抗体和不只是两个单染色的细胞附着到另一个染色。

高速,4路细胞分选必然创建环境受控气溶胶。因此,人类活细胞分选应非常谨慎。发布的安全和净化的指引,应审查和执行排序前14。批准之前可能需要从生物安全委员会或其等值排序。排序后的适当的去污,漂白剂,应添加至终浓度为10%到废液容器。硅milarly,所有的样品管以及在邻近地区的所有表面应彻底清洁,新鲜的10%的漂白粉溶液。

总之,这个协议提供了一个获得难得的前体B细胞的人口和战略进行修改,以隔离罕见的人口存在于脐带血造血干细胞和未成熟的T细胞。最近,未成熟的B细胞已被确定外周血中的个人与先进的艾滋病毒15。因此,这种方法的实用程序延伸超出血液癌症的研究。最后,我们还尚未执行的流上的排序条件的细胞的RNA的隔离,但是,这种方法应该是适应的警告,在细胞分选的细胞应直接进入三唑或等效RNA兼容的解决方案,如RLT排序从RNeasy试剂​​盒可通过Qiagen公司。

Disclosures

作者没有透露。

Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院(NCI R00 CA132784)KT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
LS Column MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Multi Stand MACS Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator MACS Miltenyi Biotec 130-042-302
B-Cell Isolation Kit (B CLL) MACS Miltenyi Biotec 130-093-660
Fetal Bovine Serum ATLANTA Biologicals S11195
Microcentrifuge tube (1.5 ml) MIDSCI SS1500
BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) BD Biosciences 559763
DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 BD Biosciences 555415
DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 BD Biosciences 560941
CD45 FITC BD Biosciences 347463
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
MACS BSA Stock Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-376
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352058
BD Falcon 50 ml Tube BD Biosciences 352098
PuraFlow Sheath Fluid, 8X Beckman Coulter CY30230
FlowCheck Alignment beads Beckman Coulter 6605359
Ultra Rainbow Alignment beads Spherotech URFP-30-2
ViroSafe Aerosol Evacuation Filter Beckman Coulter ML01330
ABC Mouse bead kit Invitrogen A-10344
40 μm cell strainer Fisher Scientific 22363547
Fisher Scientific Hemocytometer Fisher Scientific 267110
Microscope
accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge Fisher Scientific 13-100-516
MoFlo XDP flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
Aerosol Evacuation Unit Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. Hi All,
    I am unable to open the video file in China. Can you kindly send the video to me? Thanks.

    Reply
    Posted by: Boping Y.
    April 16, 2013 - 6:00 PM

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