Published 5/17/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת

Cite this Article

Copy Citation

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Amylopathy הוא מונח המתאר את הסינתזה חריגה והצטברות של בטא עמילואיד (Aβ) ברקמות עם זמן. Aβ הוא סימן היכר של מחלת אלצהיימר (AD), והוא נמצא בדמנציה לוי גוף, שררת גוף הכללה וangiopathy עמילואיד המוחי 1-4. Amylopathies לפתח בהדרגה עם זמן. מסיבה זו אורגניזמים פשוטים עם תוחלת חיים קצרות עשויים לעזור להבהיר היבטים מולקולריים של תנאים אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי ללמוד ניוון מוחיים Aβ בתיווך באמצעות elegans Caenorhabditis התולעת. לפיכך, אנו בונים תולעים מהונדסים על ידי הזרקת Aβ אנושי קידוד ה-DNA 42 לבלוטות מין סינסיציאלי של הרמפרודיטים בוגרים. קווי Transformant הם התייצבו על ידי שילוב מושרה mutagenesis. נמטודות הם גיל מסונכרן על ידי איסוף וזריעת הביצים שלהם. התפקוד של נוירונים המבטאים Aβ 42 נבדק במבחני התנהגות מתאימים (assay chemotaxisים). תרבויות עצביות העיקריות שמקורם בעוברים משמשות כדי להשלים נתונים התנהגותיים וכדי לבדוק את ההשפעות של neuroprotective תרכובות אנטי אפופטוטיים.

Introduction

בטא עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד של 36-43 חומצות אמינו שתקום לאחר מחשוף רציף של החלבון המקדים עמילואיד (APP) ועל ידי β secretases 1 γ. Secretase γ מעבד סוף C-המסוף של הפפטיד Aβ והוא אחראי עליה אורכים משתנים 5. הצורות הנפוצות ביותר של Aβ הן 40 Aβ וAβ 42, האחרון להיות קשור יותר בכינוי לתנאים פתולוגיים כגון 5 לספירה. בריכוזי Aβ טופס β גיליונות גבוהים שמצרף ליצירת סיבי עמילואיד 6. פיקדונות סיבים הם המרכיב העיקרי של פלאק סנילי סביב הנוירונים. שני לוחות ו oligomers Aβ diffusible, לא פלאק, הם חשבו מהווים צורות פתוגניים הבסיסיות של Aβ.

מעבדת מחקר של amylopathies העצבי הוא מסובך בשל העובדה כי תנאים אלה התקדמות עם זמן. לכן, זה importanלא לפתח חיה צייתנית גנטי דגמים-משלים לעכברים עם תוחלת חיים קצרה. מודלים אלה יכולים לשמש כדי להבהיר היבטים ספציפיים של amylopathies-בדרך כלל סלולרי ו, מולקולרי ומכוח הפשטות שלהם לעזור כדי ללכוד את המהות של הבעיה. תולעת Caenorhabditis elegans הנפילות היא קטגוריה זו. יש לו תוחלת חיים קצרה, ~ 20 ימים ובנוסף תהליכים תאיים בסיסיים, כולל רגולציה של ביטוי גנים, סחר בחלבון, קישוריות עצבית, synaptogenesis, איתות תא, ומותו הם דומים ל7 יונקים. תכונות ייחודיות של התולעת כוללות גנטיקה וחוסר מערכת כלי, המאפשר ללמוד באופן עצמאי נזק עצבי של נזק בכלי הדם רבי עוצמה. מצד השני, חוסר מוח מגביל את השימוש בג elegans ללימוד היבטים רבים של ניוון מוחיים. בנוסף, לא ניתן לבצע העתקה וזיהוי של הפצות אנטומיים של נגעים באורגניזם זה. מגבלה אחרתations כולל קושי להעריך את שני ההבדלים בביטוי גן פרופילים וירידת הערך של התנהגות מורכבת ותפקוד זיכרון. כאן אנו מתארים שיטות להפקת ג מודלים של amylopathies elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה של תולעים מהונדסים

  1. טרנספורמציה.
    1. הכן את רפידות הזרקה. מניחים ירידה של חמה, 2% מומסת במי agarose, על coverslip זכוכית. במהירות למקום coverslip שני על הירידה בקלילות וקש עליו. לאחר agarose הוא הגדילו, שקופיות coverslips זה מזה, ואופה coverslip-הכרית בתנור ואקום ב 80 ° CO / נ
    2. למשוך pipettes אנו משתמשים בחולץ סאטר P-97 כדי למשוך 1/0.5 מ"מ OD / מזהה ורוסיליקט נימים עם נימה. Pipettes מזויפים עם קצה סגור אשר נפרץ בשלב מאוחר יותר.
    3. הכן תערובת הזרקה. הפוך את תערובת ההזרקה המכילה את ה-DNA של עניין (20 ng / μl למבנה) בתוספת פלסמיד דנ"א הריק לריכוז סופי של 150 ng / μl. צנטריפוגה את תערובת ההזרקה כדי להסיר כל זיהום. שלב זה הוא קריטי משום שחומרים מזהמים להפחית את יעילות שינוי. העבר את 5 μl העליון (מזהמים ופסולת אחרים מצטברים בתחתית) לצינור טרי ל-Bדואר בשימוש בהזרקה.
    4. טען תמהיל הזרקה ידי קפילריות. התחתון של פיפטה הוא שקוע בתמהיל ההזרקה. בדרך כלל 0.5 μl מספיקים כדי להזריק 100 תולעים.
    5. טען פיפטה הזרקה. הכנס את פיפטה על בעל micromanipulator ולשבור אותו פתוח על ידי שפשוף הקצה שלה כנגד קצה להחליק את מכסה רכוב על שקופיות זכוכית או לחלופין נגד פסולת על כרית agarose. זהו צעד חיוני כמו טיפים נזק גדול מדי תולעת וסתומים טיפים קטנים בקלות רבה מדי. האיכות של הקצה השבור יכולה להישפט על ידי הצורה והכי חשוב על ידי קצב הזרימה. קצב הזרימה ניתן להעריך על ידי גודל הבועות זורמות מהקצה הפתוח השקוע בטיפת שמן 700 halocarbon של בתגובה ללחץ הזרקה.
    6. העבר את התולעים למשטח זריקה. מקום טיפת שמן halocarbon 700 על משטח זריקה ולהעביר כמה (1 או 2 למתחילים) תולעים לנפט. השתמש בתולעת להרים לדחוף את התולעים למטה על הכרית עדy לדבוק agarose. תולעים צריכים להיות מונחה בשורות עם צדדים הגחון פונים לאותו כיוון. הימנע מלגעת בראשו של התולעת. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים לא מצליח לדבוק בכרית, להחליף עם כרית טרי או להגדיל agarose עובי ו / או ריכוז.
    7. הכנס את פיפטה לתוך התולעת. על ידי הזזת הבמה, למקם את התולעת בפיפטה. מקם את פיפטה בליבה של בלוטת המין המרכזית היא כי הציטופלסמה שלה שותפים רבים גרעיני תאי נבט. זה מגדיל את הסיכוי להעביר דנ"א מוזרק לצאצאים רבים. פיפטה צריכה לשקר כמעט במקביל לתולעת (~ 15 ° -25 ° זווית). לדחוף אנכי קצה פיפטה במורד הגוף של התולעת עד שהעור הוא בדיכאון. לאחר מכן הקש בעדינות על מניפולטור כדי לגרום לכניסתו של טיפ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להזריק שתי בלוטות המין.
    8. להזריק את פתרון ה-DNA. תפעיל לחץ על פיפטה עד שמתנפח בלוטת המין. לעצור את הזרימה ולמשוך את תולעת פיפטה. בדוק את המחט לזרימה ולאחר מכן להעבירלתולעת הבאה וצעדי הזרקה חוזרת.
    9. לשחזר את התולעים: הוסף טיפה (~ 10 μl) של חיץ התאוששות בתולעים ודגירה עד התולעים להתחיל לשחות. הוסף נפח שווה של M9, לחכות עד שתולעים לחדש את החייה ולחזור כמה פעמים עד שהפתרון הוא בעיקר M9. בנפרד להעביר תולעים לצלחות זרע.
  2. אינטגרציה.
    1. הנח 40 בריאים, מדושנת, L4 תולעים לתוך צלחת טרי
    2. להקרין עם γ-ray עם 4,000 ראד עבור 40 דקות. העבר את התולעים מוקרנים (P0) בזרע טרי, צלחות OP50 (4 תולעים / צלחת). לחלופין ניתן מוקרנים תולעים עם מינון של 300 יובס J / 2 מ '.
    3. העבר 10-20 transformants F1 מכל צלחת לצלחות אישיות, לתייג את הצלחות עם P0 המקור המקביל.
    4. אחד מתוך 2-4 transformants F2 לכל F1 כדי צלחות נפרדות. בדקו את צאצאי F3 להעברת 100% משינוי הסמן. בדרך כלל, 1-3% של צאצאים מwil תולעת מוקרןיש לי אירוע אינטגרציה.
    5. הפוך מניות של שלושה או יותר קווי transformant עצמאיים.

2. מבחני התנהגות

  1. גיל סנכרון.
    1. לגדול תולעים ב+ 10 ס"מ צלחות NGM הסטנדרטי OP50 E. coli עד אוכלוסייה גדולה של מבוגרים הרה להולדת הוא הגיע (3-5 ימים).
    2. לאסוף את התולעים ב50 צינורות מ"ל פלקון על ידי השעיית אותם במאגר 1 מיליליטר M9.
    3. הוסף חיץ M9 5 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 450 במשך 3 דקות. בטל supernatant חזור על 3-4x.
    4. בסופו של צנטריפוגה שעברה, להסיר את supernatant ולהוסיף 10 כרכים של פתרון hypochlorite הבסיסי (0.5 M NaOH, hypochlorite 1% טריים המעורב) לתולעי pelleted לדגור על RT במשך ~ 10 דקות. תגובת תמוגה יכולה להיות פיקוח על ידי הצבת ירידה של תגובת תמוגה על coverslip ולבחון את התולעים מתחת למיקרוסקופ. כאשר כ -80% מתולעים שבורים יש להפסיק את התגובה.
    5. לעצור את תגובת תמוגה ידי AddinG אותו הנפח של ביצת חיץ סטרילי.
    6. לאסוף את הביצים (ופגרים) על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 5 דקות.
    7. לשטוף את הביצים עם חיץ סטרילי ביצה 2-3x.
    8. דגירה הביצים O / N במאגר וזרעם על צלחות NGM סטנדרטיות M9.
  2. assay chemotaxis
    1. להכין כמה חתיכות של אגר כ 0.5x0.5x0.5 ס"מ. אנחנו נפקיד את אגר בצלחת של 10 ס"מ וחתכנו את נתחים אגר משם.
    2. משרים את הנתח אגר בתמיסה המכילה attractant הרצוי (בלהרוות, ריכוזים קרובים להרוות) במשך שעה 2. משיכה אופיינית הן ליזין (0.5 מ '), ביוטין (0.2 מ').
    3. להפקיד נתח אגר בצלחת מבחן 10 ס"מ שבו המיקום של נקודת מבחן ונקודת שליטה סומנו (איור 1 א). לאפשר איזון והיווצרות O שיפוע / N (איור 1). הכן 5 צלחות עבור ניסוי בודד.
    4. לפני הניסוי להוסיף 10 μl של 20 מ"מ NaN 3 (anesthetic) לכל מקום.
    5. הנח 20 תולעי גיל מסונכרנים במרכז הצלחת. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 20 ° C.
    6. לאחר שעה 1, לספור את בעלי החיים על כתמי בדיקה / בקרה ולחשב את מדד chemotaxis, (CI) כדלקמן: משוואת 1 כאשר N, N ו-N בדיקת CNT., מציינים את המספר הכולל של בעלי חיים, מספר בעלי החיים במקום המבחן ומספר בעלי החיים במקום השליטה.

3. תרבית תאים העוברית ראשונית

  1. Lyse תולעים, כמתואר בגיל סנכרון.
  2. לעצור את תגובת תמוגה על ידי הוספת הנפח הזהה של חיץ ביצה וסטרילית צנטריפוגות ב XG 450 במשך 5 דקות. בעדינות להשליך supernatant נזהר שלא לאבד את ביצי pelleted. חזור על 2-3x או עד supernatant הוא ברור.
  3. Resuspend ביצי pelleted (ופגרים) במאגר ביצת סטרילי 2 מ"ל ולהוסיף 2 מ"ל של סוכרוז 60% סטרילי במאגר הביצה. מערבבים את הפתרון הזה עד ביצים resuspended לחלוטין (כפי שהם נוטים ליצור גושים בצנטריפוגה) ביד או באמצעות vortexing.
  4. צנטריפוגה ב XG 450 במשך 15 דקות.
  5. העברת supernatant (המכיל את הביצים) בזהירות לצינור סטרילי. בטל גלולה המכיל פגרים ואחרים תוצרי לוואי של תמוגה.
  6. הסר סוכרוז שיורית על ידי resuspending את הביצים בחיץ הביצה וcentrifuging ב 450 XG במשך 5 דקות. בעדינות לאסוף וזורקים supernatant. חזור על 3x.
  7. מתחת למכסת מנוע מינרית resuspend ביצי pelleted במאגר ביצת סטרילית המכיל U 1 / מיליליטר chitinase ב RT לעכל את קליפות ביצים. לאחר 30 דקות להתחיל לעקוב אחר התגובה (תחת מיקרוסקופ תרבות תא הפוך). כל אצווה של chitinase יש פעילות שונה במקצת. בדרך כלל עיכול יושלם בשעת 1.
  8. כאשר בערך 70-80% קליפות ביצים מתעכלות על ידי chitinase תוספת CM-15 (L-15 תא התרבות Medium המכיל 10% בסרום שור עוברי, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). לנתק את התאים באמצעות מזרק עם מד 27. סנן את ההשעיה התא עם 5.0 מיקרומטר לסנן להסיר עוברים שלמים, גושים של תאים וזחלים.
  9. גלולה ההשעיה התא ניתק על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בתרבית תאים בינונית-15 ס"מ.
  10. תאים ניתק צלחת על כיסוי זכוכית מצופה בעבר עם תלושים לקטינים בוטנים (0.1 מ"ג / מ"ל) מומסים במים. הערה: תאים חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל.
  11. יכולים להישמר תאים ב RT (16-20 ° C) באוויר במשך יותר מ 2 שבועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם הפרוטוקולים שלנו אנחנו לומדים את ההשפעות של 42 oligomer Aβ האנושי על תפקוד עצבי 8. Aβ בר הקידוד אנושי 42 ואת רצף הפפטיד האות המלאכותי הקידוד של אש וקטור pPD50.52 היה מוגבר ממבנה PCL12 9 באמצעות פריימרים שהציגו אתר endonuclease הגבלת 1 Sma בקצוות. הבר היה אז מוכנס לתוך מבנה המכיל רצף אמרגן 2,481 FLP-BP-6 בוקטור אש pPD95.75 בין Sma האתר הייחודי 1 10. תוך שימוש בטכניקות השינוי המתוארת בפרוטוקול 1 אנו נבנו תולעת מהונדסת מבטא Aβ 42 בתאי העצב (ASE זן FDX (ses25)) 8. כדי לסמן transformants חיובי השתמשנו בכתב GFP P gcy-5 :: שדווקא מניע את הביטוי של GFP בASE ימין (aser) 11 נוירון. תולעים להיצמד למשטח בגלל agarose היבשה סופגת את המים שלהם. לכן זה CRUחברתי שבעלי החיים מונחים על הכרית והזריקו הזריקה במהירות יחסית, משום שאחרת הם לייבש ולמות. אחוז צאצאי F1 שנושא מערך extrachromosomal transmissible עשוי להשתנות. ערכים אופייניים הם בטווח 3-7%. חשוב שתערובת ההזרקה (1.1.3) מכילה הומולוגיה ברצף ה-DNA הלא שיתוף עם קידוד ה-DNA המהונדס (בדרך כלל וקטור ריק) כי DNAs לעבור הומולוגי רקומבינציה אחד עם השני. עם זאת, אם ביטוי יתר של transgene הוא בעיה צריכה להיות בתוספת תערובת ההזרקה עם 50-100 ng / μl של הדנ"א הגנומי מתעכל עם 1 SCA. נוירונים ASE לזהות מים משיכה מסיס כגון ביוטין ולכן תפקידם ניתן להעריך במבחני התנהגות (assay chemotaxis, פרוטוקול 2 ו1A ו-1B דמויות) 12. בניסוי טיפוסי, בדקנו תולעי שבע יממה מבטאים P gcy-5 :: GFP לבד (DA1262 זן) או עם Aβ 42 (FDX (ses25)) עבורchemotaxis לביוטין. בתולעים צעירים (יום 3-4 ישן) את ההשפעות של 42 ביטוי Aβ הן צנועות אבל כבר להבחין (~ ירידה של 10% במדד chemotaxis, ראה נ"צ. 8). נציג תוצאות של ניסוי זה מוצגות ב1C 1D ודמויות. רוב DA1262 תולעים נמצאו ב, או בקרבת מקום, מקום attractant (איור 1 ג). בניגוד לכך רק כמה תולעים מבטאים Aβ 42 יכולים למצוא את מקום attractant (1D איור). בדקנו שהופצו ב5 צלחות / גנוטיפ מבחן קבלת למדד chemotaxis ביוטין 0.68 ± 0.09 ו0.12 ​​100 גנוטיפ חיות / ± 0.04 לDA1262 וFDX (ses25), בהתאמה. תולעים פעילים נאספו בנפרד והועברו למרכז צלחת הבדיקה. זה חשוב לא רק למהירות, אלא גם בעדינות להעביר את התולעים כי אחר הם עלולים להישאר פעילים במשך כמה דקות ולא מצליח לעקוב אחר attractant. בסופו של הניסוי אנו ממליצים לפקח תולעיםctivity ע"י הסתכלות בדרכיהם. אם רק כמה מסלולים נראים שאנחנו בדרך כלל זורקים את הצלחת.

GFP הקרינה בתאי עצב aser של FDX (ses25) תולעים נעלמת בתוך האחד עשרה הימים הראשונים לחייו (לא מוצג). הדבר מצביע על כך תאים אלה עוברים אפופטוזיס בשל נוכחותם של 42 Aβ. לכן אנו קובעים אם מעכב ספקטרום רחב של אפופטוזיס כגון caspase המעכב N-(2-Quinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorophenoxy) קטון תיל (Q-VD-Oph) 13 יכולים לעצור את האובדן של תאי aser . לשם כך אנחנו עובדים נוירונים בתרבית aser עיקריים מ -14 עוברים, אשר הוכנו כמתואר בפרוטוקול 3. נציג תמונות של נוירון aser בFDX (4 יום ישן) צעיר (ses25) תולעת יחד עם תמונות של נוירונים בתרבית מוצגות איורים 2A-C. תאים בתרבית aser היו קצרים ימים (איור 2 ד). כדגירה צפויה עם 0.3 מיקרוגרם / מ"ל ​​Q-VD-Oph טרי בתוספת יומית, ג ompletely עצר את האובדן של תאי עצב aser ניאון. כאשר עובד עם תאי עצב עיקריים בתרבות זה חשוב לשמור על צפיפות תאים מתאים. פרמטר זה בעיקר תלוי במספר התולעים המשמשים כדי לחלץ את הביצים. אנו מודדים את צפיפות תאים עם hemocytometer סטנדרטי ולטפל מסוימים כדי לשמור על תא צפיפות קבועה מתרבית תאים לתרבית תאים. בניסויים תרופתיים, כגון אלה שתוארו כאן עבדנו עם ~ 200,000 תאים / 2 ס"מ שהיה מתקבל על ידי קצירת ארבע צלחות ס"מ 10 מחוברות. תאים היו מצופה ב12 בארות של צלחת 24 באר. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב גם לנתק את התאים העובריים לפני הזריעה כפי שהם נוטים ליצור גושים. אנו משתמשים במזרק עם מחט מד 27 ואצולה לשאוב את ההשעיה הלוך ושוב כמה פעמים. זה בדרך כלל מספיק כדי לנתק את רוב התאים (במיוחד בהתחלה אנו ממליצים לבדוק את ההשעיה תחת מיקרוסקופ).

t "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 1
איור 1. assay chemotaxis. א צלחת chemotaxis נציג. כתמי attractant (ביוטין) ובקרה מסומנים בעיגול חלול ומלא. ב צלחת chemotaxis עמוסת חתיכת קוטר 0.5 סנטימטר של אגר תשמש להקמה הדרגתית של ביוטין. חתיכה אגר נחתכה מצלחת של 10 ס"מ באמצעות הצד העליון של התפלגות זכוכית פיפטה פסטר. ג נציג של תולעים סביב נקודת attractant. בדוגמה זו רוב DA1262 התולעים היו מסוגלים למקם את מקור attractant (ביוטין). ד כמו בג לFDX (ses25) תולעים. תולעים ביוטין, רגישים אלה הציגו הפצה פזורה ברחבי הצלחת ורק מעטים נמצאו בסמוך למקום attractant.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
איור 2. תרבות של ג תאים עובריים elegans. תמונת א פלואורסצנטי מיקרוסקופיה (תמונה משמאל) ואור בהיר (בתמונה מימין) שנלקחו מFDX (ses25) ראש תולעת מהונדס. תולעת זו מבטאת GFP בנוירון aser מונע על ידי-5 gcy האמרגן. תמונת האור בהירה ב 'של תרבות של FDX (ses25) תאים עובריים. בר סולם הוא 5 מיקרומטר. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ג FDX תרבותי (ses25) aser נוירון. תמונות צולמו עם מיקרוסקופ אולימפוס BX61 מצוידים במצלמה דיגיטלית. ניסוי נציג ד בודק את הכדאיות של גיל מסונכרן, נוירונים בתרבית, aser. תאים נלקחו מעוברי DA1262 (עיגולים חלולים) או (FDX ses25) עובר מתוחזק בהעדר / נוכחות של 300 ng / ml Q-VD-Oph (ריבועים חלולים ומלאים, בהתאמה). היעלמותו של ה-GFP הקרינה שימש כמדד לכדאיותו של תא עצב. לשעברperiment התחיל עם ~ 300 נוירונים aser ניאון. כדאיות מחושבת כ100 * (מספר תאי ניאון ביום X מחולק במספר תאי ניאון ביום 1). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מתארים גישה משולבת, ללמוד היבטים תאיים ומולקולריים של amylopathies באמצעות ג elegans. היתרונות של גישה זו כוללים: 1.) בעלות הנמוכה C.elegans נשמר בצלחת פטרי עם חיידקים נורמלי זורעים, בטמפרטורת חדר. 2) גנטיקה עוצמה. ניתן להשיג בבעלי חיים מהונדסים בכמה חודשים, ומגוון רחב של רצפי האמרגן זמין לנהוג ביטוי של הגן הרצוי בתאי עצב מסוימים. 3) פשוט, מאופיין היטב, מערכת עצבים. ג elegans בעל מערכת עצבים פשוטה להפליא (302 נוירונים). פשטות זו העניקה אפיון נרחב של מערכת העצבים של התולעת כולל משפחה של תאים, פונקציה / תפקיד ספציפי של כל נוירון והקשרים סינפטיים שלה. המגבלות של ג elegans כולל את גודלו הקטן של התאים, אשר מעכב את היישום של טכניקות סטנדרטיות ביוכימיות כגון אימונוהיסטוכימיה ועור עבה (ציפורן) שמבודד Neurons ליצור הסביבה החיצונית. לכן, גישות תרופתיות עשויות להיות של יעילות מוגבלת בג elegans. תרבויות של תאים ראשוניים מייצגות אסטרטגית תוקף באופן חלקי כדי לשפר את הבעיה הזו.

את השלבים הקריטיים בפרוטוקולי ניסוי אלו כוללים החל מכמויות גדולות של תולעים ומעקב אחר ההכנות כדי שלא תאבד את הביצים, וכו 'עוברים. היא גם חיונית כדי ללמוד כיצד להתמודד עם בעלי החיים במהלך הזרקה. שמירה על תולעים בכרית agarose ארוך מדי, ניקובם עם טפטפת או הזרקה גדולה מדי תמהיל DNA יכולה באופן בלתי הפיך לפגוע בהם. יעילות שינוי, שחזור וtransgene ביטוי עשוי להשתנות. יעילות קשורה לטוהר של תמהיל ההזרקה והרכבו (נוכחות ללא קידוד ה-DNA). מערכי extrachromosomal משתנים מחיה לחיה ולכן זה קריטי להקים לפחות 2-3 קווים, עצמאיים לtransgene. מצד השני, התוספת של מתעכלתהדנ"א הגנומי לתערובת מייצג אסטרטגיה חוקית כדי להפחית מהונדס יתר ביטוי. מבחני chemotaxis יחסית ללא בעיות. עם זאת, הוא חיוני כדי לשמור על עקביות במפל הריכוזים כדי להימנע מתוצאות שגויות. השתמש בפיסות אגר באותו הגודל, למשל לחתוך אותם עם פיפטה פסטר ולשמור על האיזון קבוע בזמן. אם בכלל, להסיר את הפתרון עודף עם מקלון צמר גפן.

לסיכום, אנו מספקים כאן דוגמה כיצד ניתן לנצל האורגניזם פשוט, צייתן גנטי כדי לחקור היבטים מולקולריים של amylopathies. את אותן טכניקות ניסיוניות יכולה להיות מיושמות על המחקר של חלבונים עצביים אחרים והדור של מודלים של בעלי החיים חדשים של מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12, (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17, (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9, (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12, (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3, (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61, (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32, (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12, (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8, (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, (4), 503-514 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats