ETT

Published 5/17/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver metoder för att studera aspekter av amylopathies i masken

Cite this Article

Copy Citation

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Amylopathy är en term som beskriver onormal syntes och ackumulation av amyloid beta (beta) i vävnader med tiden. Ap är ett kännetecken för Alzheimers sjukdom (AD) och finns i Lewy body demens, inklusionskroppsmyosit och cerebral amyloid angiopati 1-4. Amylopathies utvecklas gradvis med tiden. Av denna anledning enkla organismer med korta livslängder kan bidra till att belysa molekylära aspekter av dessa villkor. Här beskriver vi experimentella protokoll för att studera Ap-medierad neurodegeneration använder Caenorhabditis elegans. Därför konstruerar vi transgena maskarna genom att injicera DNA som kodar för humant Ap 42 in i syncytiala könskörtlarna av vuxna hermafroditer. Transformantlinjer stabiliseras genom en mutagenes-inducerad integration. Har åldern synkroniseras genom att samla och sådd sina ägg Nematoder. Funktionen av nervceller som uttrycker Ap 42 testas i opportuna beteendemässiga analyser (kemotaxianalyss). Primära neuronala kulturer erhållna från embryon utgör komplement beteendemässiga data och för att testa de nervskyddande effekterna av anti-apoptotiska föreningar.

Introduction

Amyloid beta (A-beta) är en peptid med 36-43 aminosyror som bildas efter sekventiell klyvning av amyloid prekursorprotein (APP) genom β och sekretaser γ 1. Den γ secretase bearbetar C-terminala änden av Ap-peptid och ansvarar för dess olika längd 5. De vanligaste formerna av Ap är AP 40 och AP 42, den senare vanligen förknippas med patologiska tillstånd såsom AD 5. Vid höga koncentrationer Ap bildar β-ark som samlas för att skapa amyloidfibriller 6. Fibriller insättningar är den viktigaste komponenten i senila plack omgivande nervceller. Både plack och diffunderbara, icke-plack oligomerer Ap, tros vara underliggande patogena former av Ap.

Laboratory studie av neuronala amylopathies kompliceras av det faktum att dessa villkor framsteg med tiden. Därför är det important för att utveckla genetiskt foglig djurmodeller-komplementär till möss-med kort livslängd. Dessa modeller kan användas för att belysa specifika aspekter av amylopathies-typisk cell-och molekylär-och i kraft av sin enkelhet, hjälpa till att fånga essensen av problemet. Masken Caenorhabditis elegans falls är denna kategori. Den har en kort livslängd, ~ 20 dagar och dessutom grundläggande cellulära processer, inklusive reglering av genuttryck, protein trafficking, nervkopplingar, synaptogenes, cellsignalering, och döden liknar däggdjurs 7. Unika egenskaper för masken inkluderar kraftfulla genetik och brist på ett fartyg, som gör det möjligt att studera neuronal skada oberoende av kärlskador. Å andra sidan, begränsar bristen på en hjärna användningen av C. elegans för att studera många aspekter av neurodegeneration. Dessutom kan reproduktionen och identifiering av anatomiska fördelningar av lesioner inte utföras i denna organism. Övriga gränsvärdensamheten inkluderar svårigheten att bedöma både skillnader i genuttrycksprofilerna och nedskrivning av komplexa beteende och minnesfunktion. Här beskriver vi metoder för att generera C. elegans modeller av amylopathies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Konstruktion av transgena maskarna

  1. Transformation.
    1. Förbered injektion pads. Placera en droppe av varm, 2% agaros löst i vatten, på ett täckglas. Placera snabbt ett andra täckglas på drop och knacka lätt det. Efter att agarosen stelnat, slide täckglas isär, och baka täckglas-pad i en vakuumugn vid 80 ° CO / N.
    2. Dra pipetter. Vi använder en Sutter P-97 avdragare för att dra 1/0.5 mm YD / ID borosilikatglas kapillärer med glödtråd. Pipetter är smidda med stängd spets som bryts öppen i ett senare skede.
    3. Förbered injektion mix. Utför injektionen blandning innehållande det intressanta DNA (20 ng / | il per konstrukt) plus tom plasmid-DNA till en slutlig koncentration av 150 ng / | il. Centrifugera injektionen blandningen för att avlägsna sådana föroreningar. Detta steg är avgörande eftersom föroreningar minskar transformationseffektivitet. Överför den övre 5 ^ il (skräp och annan smuts samlas i botten) till ett nytt rör till be används i injektion.
    4. Ladda injektion mix av kapillärkraften. Botten av pipetten är nedsänkt i injektionen blanda. Typiskt 0,5 pl är tillräckliga för att injicera 100 maskar.
    5. Ladda injektionspipetten. Sätt i pipetten på innehavaren av mikromanipulator och bryta det öppet genom att gnida sin spets mot kanten av ett täckglas monterat på en glasskiva eller alternativt mot skräp på agaros pad. Detta är ett viktigt steg som alltför stora tips skada masken och alltför små tips är lätt igensatta. Kvaliteten av det brustna spets kan bedömas av formen och viktigast med flödeshastigheten. Flödeshastigheten kan bedömas genom storleken på de bubblor flyter från den öppna spetsen nedsänkt i en droppe Halocarbon 700 olja som svar på ett insprutningstryck.
    6. Överför maskar injektion pad. Placera en droppe av 700 Halocarbon olja på en injektion pad och överföra flera (1 eller 2 för nybörjare) maskar till oljan. Använd en mask plocka driva maskar ner på kudden tillsy ansluta sig till agaros. Worms bör vara orienterade i rader med ventrala sidorna vända åt samma håll. Undvik att röra mask huvud. Om efter flera försök maskarna inte följer av plattan, byta med en färsk pad eller öka agaros tjocklek och / eller koncentration.
    7. Sätt i pipetten i masken. Genom att flytta scenen, placera masken under pipetten. Placera pipetten i den centrala kärnan av gonad eftersom dess cytoplasma delas av många bakterie cellkärnor. Detta ökar sannolikheten för att leverera injicerat DNA till många avkomma. Pipetten bör ligga nästan parallellt med masken (~ 15 ° -25 ° vinkel). Skjut vertikalt spetsen på pipetten ner masken kropp tills huden är deprimerad. Sedan försiktigt knacka på roboten för att inducera spetsens insättning. För bästa resultat injicera både gonader.
    8. Injicera DNA lösningen. Sätt press på pipetten tills gonad sväller. Stoppa flödet och dra masken bort pipetten. Testa nålen för flödet och sedan flyttatill nästa masken och upprepa steg injektion.
    9. Recover maskarna: Lägg en droppe (~ 10 l) av återvinning buffert på maskar och inkubera tills maskarna börjar simma. Tillsätt en motsvarande volym av M9, vänta tills maskar återuppta simning och upprepa flera gånger tills lösningen är oftast M9. Individuellt överföra maskar till seedade plattor.
  2. Integration.
    1. Placera 40 friska, välnärda, L4 maskar i en färsk platta
    2. Bestråla med γ-ray med 4.000 rads för 40 min. Överför bestrålade maskar (P0) i fräscha, OP50 seedade plattor (4 maskar / platta). Worms kan alternativt bestrålas med en dos av 300 J / m 2 UVs.
    3. Överför 10-20 F1 transformanter från varje platta till individuella plattor, märka plattorna med motsvarande P0 ursprung.
    4. Single ut 2-4 F2 transformanter för varje F1 till separata plattor. Kontrollera F3 avkomman till 100% transmission av transformationsmarkör. Typiskt 1-3% av avkomma från en bestrålad mask tilJag har en integration evenemang.
    5. De lager av tre eller flera oberoende transformantlinjer.

2. Beteendemässiga analyser

  1. Age-synkronisering.
    1. Odla maskar i standard 10 cm NGM plattor + OP50 E. coli tills en stor population av dräktiga vuxna uppnås (3-5 dagar).
    2. Samla maskar i 50 ml Falcon rör genom att suspendera dem i 1 ml M9 buffert.
    3. Tillsätt 5 ml M9-buffert och centrifugera vid 450 xg under 3 min. Kassera supernatanten. Upprepa 3-4x.
    4. Vid slutet av den sista centrifugeringen, avlägsna supernatanten och tillsätt 10 volymer basisk hypoklorit-lösning (0,5 M NaOH, 1% hypoklorit färskblandat) till de pelleterade maskar. Inkubera vid rumstemperatur under ~ 10 min. Den lys Reaktionen kan följas genom att placera en droppe av lys-reaktion på ett täckglas och pröva de maskar under ett mikroskop. När ungefär 80% av maskar bryts reaktionen bör stoppas.
    5. Stoppa lys reaktionen genom adding samma volym sterilt ägg buffert.
    6. Samla ägg (och slaktkroppar) genom centrifugering vid 450 xg under 5 minuter.
    7. Tvätta äggen med steril ägg buffert 2-3x.
    8. Inkubera ägg O / N i M9 buffert och utsäde dem på vanliga NGM plattor.
  2. Kemotaxi-analys.
    1. Förbered flera bitar av agar ungefär 0.5x0.5x0.5 cm. Vi deponera agar i en 10-cm platta och vi skär agar bitar därifrån.
    2. Blötlägg agar bit i en lösning innehållande den önskade lockmedel (vid mättande, nära-mättande koncentrationer) under 2 timmar. Typiska lockmedel är lysin (0,5 M), biotin (0,2 M).
    3. Deposition en agar bit i en 10 cm testplatta i vilket placeringen av ett test plats och en kontrollfläcken har markerats (Figur 1A). Tillåt ekvilibrering och bildning av en gradient O / N (Figur 1B). Bered fem plattor för ett enda experiment.
    4. Före experimentet tillsätt 10 ul 20 mM NaN3 (Anesthetic) till varje fläck.
    5. Placera 20 ålder-synkroniserade maskar i mitten av plattan. Placera plattan i inkubatorn vid 20 ° C.
    6. Efter 1 timme, räkna djuren på provet / kontrollen fläckar och beräkna kemotaxis index (CI) som följer: Ekvation 1 där N, N testar och N Cnt., ange det totala antalet djur, antal djur i testet plats och antalet djur i kontrollgruppen plats.

Tre. Primär embryonala Cell Culture

  1. Lyse maskar som beskrivs i ålder-synkronisering.
  2. Stoppa lys reaktionen genom tillsats av samma volym av steril ägg buffert och centrifugera vid 450 xg under 5 min. Försiktigt kassera supernatanten var noga med att inte förlora pelleterade ägg. Upprepa 2-3x eller tills supernatanten är klar.
  3. Resuspendera pelleterat ägg (och kadaver) I 2 ml sterilt ägg buffert och tillsätt 2 ml steril 60% sackaros i ägget buffert. Blanda denna lösning tills äggen är helt suspenderas (eftersom de tenderar att bilda klumpar enligt centrifugering) för hand eller genom skakning.
  4. Centrifugera vid 450 x g i 15 min.
  5. Försiktigt överföra supernatanten (innehållande ägg) till ett sterilt rör. Kasta pellet som innehåller slaktkroppar och andra biprodukter från lys.
  6. Avlägsna återstående sackaros genom återsuspendering äggen i ägg buffert och centrifugering vid 450 xg under 5 min. Försiktigt samla in och kassera supernatanten. Upprepa 3x.
  7. Under ett laminärt huva återsuspendera pelleterade ägg i steril ägg innehållande 1 U / ml chitinas vid RT för att smälta äggskal. Efter 30 min börjar övervaka reaktionen (under ett inverterat cellkultur mikroskop). Varje sats av chitinas har en något annorlunda aktivitet. Typiskt matsmältningen är klar i 1 timme.
  8. När ungefär 70-80% äggskal klyvs av kitinas add CM-15 (L-15 cellodling Medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin). Dissociera celler med användning av en spruta med en 27 gauge. Filtrera cellsuspensionen med en 5,0 ìm filter för att avlägsna intakta embryon, klumpar av celler och larver.
  9. Pellet den dissocierade cellsuspensionen genom centrifugering vid 450 xg under 15 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i CM-15 cellodlingsmedium.
  10. Plate dissocierade celler på glas täckglas tidigare belagts med jordnötssås lektin (0,1 mg / ml) löst i vatten Anmärkning:. Celler måste följa underlaget för att differentiera.
  11. Celler kan upprätthållas vid RT (16-20 ° C) i luft under mer än två veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med våra protokoll vi studera effekterna av humant Ap 42 oligomer på neuronal funktion 8. Ett fragment som kodar för humant Ap 42 och den artificiella signalpeptiden kodande sekvensen av Fire vektor pPD50.52 amplifierades från konstrukt PCL12 9 med användning av primrar som introducerade ett Smal ett restriktionsendonukleasställe i ändarna. Fragmentet infogades sedan i en konstruktion innehållande en 2481-bp flp-6 promotorsekvensen i pPD95.75 Fire vektorn mellan det unika Sma 1-stället 10. Använda transformationstekniker beskrivs i protokoll 1 vi konstruerat en transgen mask uttrycker Ap 42 i ASE neuroner (FDX (ses25) stam) 8. För att markera positiva transformanter vi använde P gcy-5 :: GFP reporter som specifikt driver GFP uttryck i ASE höger (ASER) neuron 11. Worms fastnar på dynan, eftersom den torra agaros absorberar deras vatten. Därför är det crusiella att djuren placeras på injektionen pad och injiceras relativt snabbt, eftersom de annars kommer att torka ut och dö. Procentandelen F1 avkomma som bär en överförbar extrakromosomal array kan variera. Typiska värden är inom 3-7% intervallet. Det är viktigt att injektionen mix (1.1.3) innehåller icke-kodande DNA-homologi delar sekvens med den transgena DNA (vanligtvis tom vektor), eftersom DNA genomgår homolog rekombination med varandra. Men om överuttryck av transgenen är ett problem injektionen mix bör kompletteras med 50-100 ng / il av genom-DNA digererades med Sca 1. ASE nervceller upptäcka vattenlösliga lockmedel såsom biotin och därmed deras funktion kan bedömas beteendemässiga analyser (kemotaxianalys, protokoll 2 och figurerna 1A och 1B) 12. I ett typiskt experiment, testade vi sju dagar gamla maskar som uttrycker P gcy-5 :: GFP enbart (DA1262 stam) eller med A-beta 42 (FDX (ses25)) förkemotaxi till biotin. I unga maskar (3-4 dagar gamla) effekterna av Ap 42 uttryck är blygsamt men redan detekterbar (~ 10% minskning av kemotaxi index, se ref. 8). Representativa resultat av detta experiment visas i Figurerna 1C och 1D. Mest DA1262 maskar hittades i, eller i närheten, det lockmedel plats (Figur 1C). Däremot bara några maskar som uttrycker Ap 42 kunde hitta lockmedel plats (figur 1D). Vi testade 100 djur / genotyp fördelade på 5 testplattorna / genotyp erhålla en chemotaxis index för biotin 0,68 ± 0,09 och 0,12 ± 0,04 för DA1262 och FDX (ses25), respektive. Aktiva maskar var individuellt plockades och överfördes till mitten av testplattan. Det är viktigt att inte bara snabbt, men också försiktigt överföra maskar eftersom de annars kan förbli inaktiva i flera minuter och misslyckas med att spåra lockmedel. Vid slutet av experimentet föreslår vi övervaka maskar enctivity genom att titta på deras vägar. Om endast ett fåtal spår syns vi kasta brukar plattan.

GFP-fluorescens i ASER neuronerna i FDX (ses25) maskar försvinner inom de första elva dagar i livet (ej visad). Detta tyder på att dessa celler genomgå apoptos på grund av närvaron av Ap 42. Därför har vi bestämt huruvida ett brett spektrum hämmare av apoptos såsom caspase hämmare N-(2-kinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorfenoxi) metylketon (Q-VD-OPh) 13 kunde stoppa förlusten av Aser celler . För detta ändamål har vi sysselsatt odlade primära ASER neuroner från embryon 14, som framställdes såsom beskrivits i protokoll 3. Representativa bilder av en ASER neuron i en ung (4 dagar gamla) FDX (ses25) mask tillsammans med bilder av nervceller i kultur visas i figurerna 2A-C. Odlade ASER celler var kortlivat (Figur 2D). Som väntat inkubation med 0,3 ng / ml Q-VD-OPh kompletterade nyligen dagligen, c ompletely stoppat förlusten av fluorescerande ASER neuroner. Vid arbete med primära neuroner i odling är det viktigt att upprätthålla en lämplig celldensitet. Denna parameter beror huvudsakligen på antalet maskar som används för att extrahera äggen. Vi mäter cell densitet med en standard hemocytometer och särskilt se till att upprätthålla cell densitet konstant från cellkultur till cellodling. För farmakologiska experiment såsom de som beskrivits här har vi arbetat med ~ 200.000 celler / cm 2 som erhölls genom att skörda fyra sammanflytande 10 cm plattor. Celler ströks ut i 12 brunnar i en 24-brunnar. För bästa resultat är det också viktigt att skilja de embryonala cellerna innan sådd eftersom de tenderar att bilda klumpar. Vi använder en spruta med en 27 gauge nål och herrskap aspirera fjädring fram och tillbaka ett par gånger. Detta är i allmänhet tillräckligt för att separera de flesta celler (speciellt i början föreslår vi att kontrollera suspension i mikroskop).

t "fo: keep-together.within-sida =" alltid "> Figur 1
Figur 1. Kemotaxianalys. A. representant chemotaxis platta. Lockmedel (biotin) och kontroll fläckar är markerade med en ihålig och en fylld cirkel. B. En kemotaxi platta laddad med en 0,5-cm diameter stycke av agar användes för att fastställa en gradient av biotin. Stycket av agar skars ut från en 10-cm platta via det översta sidan av ett glas pasteurpipett. C. representativ fördelning av maskar runt lockmedel plats. I detta exempel huvuddelen av DA1262 maskar kunde lokalisera källan till lockbete (biotin). D. Som i C. för FDX (ses25) maskar. Dessa biotin-okänsliga maskar uppvisade en spridd fördelning runt plattan och bara ett fåtal hittades nära lockmedel plats.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Figur 2. Kultur av C. elegans embryonala celler. A. Fluorescensmikroskopi bilden (vänster bild) och starkt ljus (höger bild) tagen från en FDX (ses25) transgena mask huvud. Denna mask uttrycker GFP i ASER neuron drivs av gcy-5-promotorn. B. Starkt ljus bild av en kultur av FDX (ses25) embryonala celler. Skala bar är 5 um. C. Fluorescensmikroskopi bilden av en odlad FDX (ses25) ASER neuron. Bilder tagna med en Olympus BX61 mikroskop utrustat med en digital kamera. Testa livskraft odlade, ålder-synkroniserade, Aser nervceller D. representant experiment. Celler erhölls från DA1262 embryon (ofyllda cirklar) eller FDX (ses25) embryon upprätthålls i frånvaro / närvaro av 300 ng / ml Q-VD-Oph (ihåliga och fyllda kvadrater, respektive). Försvinnandet av GFP fluorescens användes som ett mått på en neuron lönsamhet. The experiment började med ~ 300 fluorescerande ASER neuroner. Viabilitet beräknades som 100 * (antal fluorescerande celler på dag X dividerat med antalet fluorescerande celler vid dag 1). Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en kombinerad metod för att studera cellulära och molekylära aspekter av amylopathies med C. elegans. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är:. 1) låg kostnad C.elegans bibehålls i normal Petriskål ympades med bakterier, vid rumstemperatur. 2) Kraftfulla genetik. Transgena djur kan erhållas på några månader och ett brett spektrum av promotorsekvenser är tillgänglig för att driva uttryck av den önskade genen i specifika neuroner. 3) Enkel, väldefinierad, nervsystem. C. elegans besitter ett anmärkningsvärt enkel nervsystem (302 neuroner). Denna enkelhet har gett omfattande karakterisering av masken nervsystem inklusive cellsläktträd, specifik funktion / roll varje neuron och dess synapsförbindelser. Begränsningarna av C. elegans inkluderar den ringa storleken hos cellerna, vilket hindrar tillämpning av standardiserade biokemiska tekniker såsom immunohistokemi och en tjock hud (ytterhuden) som isolerar neuRons bildar den yttre miljön. Därför kan farmakologiska metoder vara av begränsad effekt i C. elegans. Kulturer av primära celler representerar en giltig strategi för att delvis lindra detta problem.

De kritiska stegen i dessa experimentella protokoll inkluderar börjar med stora mängder av maskar och övervaka förberedelserna för att inte förlora ägg, embryon osv. Det är också viktigt att lära sig att hantera djuren under injektion. Hålla maskar i agaros pad för länge, stansning dem med en stor pipett eller injicera för mycket DNA mix kan allvarligt skada dem. Transformation effektivitet, reproducerbarhet och transgenexpression kan variera. Effektivitet är relaterad till renheten hos injektionen blanda och dess sammansättning (förekomst av icke-kodande DNA). Extrakromosomal matriser varierar från djur till djur därför är det viktigt att etablera minst 2-3, oberoende linjer per transgen. Å andra sidan, tillsats av smältgenomisk DNA till mixen är en giltig strategi för att minska transgen överuttryck. Chemotaxis analyser är relativt problemfri. Emellertid är det viktigt att upprätthålla konsekvens i koncentrationsgradienten för att undvika felaktiga resultat. Använd bitar av agar av samma storlek-till exempel skär dem med en Pasteur-pipett-och upprätthålla jämvikt tidskonstant. Om något, ta bort överflödig lösning med en bomullspinne.

Sammanfattningsvis, här ger vi ett exempel på hur en enkel, genetiskt tractable organism kan utnyttjas för att undersöka molekylära aspekter amylopathies. Samma experimentella tekniker kan tillämpas på studier av andra neuronala proteiner och till generering av nya djurmodeller för sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12, (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17, (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9, (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12, (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3, (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61, (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32, (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12, (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8, (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, (4), 503-514 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats