Måling av spenningen slipper Under Laser Induced Axon Lesion å evaluere aksonal feste til overflaten på Piconewton og Millisekund Oppløsning

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi målte spenningen utgivelsen i en axon som ble delvis lesioned med en laser dissector ved samtidig kraft spektroskopi måling utført på en optisk fanget probe overholdt membran av axon. Den utviklet eksperimentelle protokollen vurderer axon vedheft til kultur underlaget.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dannelsen av funksjonelle forbindelser i et u neuronal nettverk er påvirket av ytre signaler. Den neurite veksten i utviklingsland nevroner er underlagt kjemiske og mekaniske signaler, og de mekanismer som det sanser og reagerer på mekaniske signaler er dårlig forstått. Belyse hvilken rolle krefter i celle modning vil gjøre utformingen av stillas som kan fremme celle vedheft og cytoskeletal kobling til underlaget, og dermed forbedre kapasiteten på ulike nevrale typer å regenerere etter skade.

Her beskriver vi en metode for å søke samtidige kraft spektroskopi målinger under laser indusert celle lesjon. Vi måler spenning utgivelse i delvis lesioned axon ved samtidig interferometrisk sporing av en optisk fanget probe overholdt membran av axon. Vår eksperimentelle protokollen oppdager spenningen utgivelsen med piconewton følsomhet, og den dynamiske av spenningen ble utløst vedmillisekund tidsoppløsning. Derfor gir det en høy oppløsning metode for å studere hvordan den mekaniske koplingen mellom cellene og substrater kan bli modulert ved farmakologisk behandling og / eller ved forskjellige mekaniske egenskaper av substratet.

Introduction

Optisk mikroskopi er en av de mindre invasiv avbildning system tilgjengelig for å observere levende celler. Med utnyttelse av effekter som stråling trykket (som optisk pinsett 1), eller høy-energi foton flux (som i laser dissector 2), ble denne teknologien utvidet til nano-manipulasjon. Den optiske imaging system møblerer en presis kontroll for å visualisere og manipulere sub mobilnettet mål tre. Samtidig, takket være nøyaktig kalibrering av den leverte laser makt, optiske verktøy oppnå enten myke eller invasiv prøve manipulasjon med enestående reproduserbarhet.

Flere laboratorier integrert, i den samme eksperimentelle oppsettet, optiske pinsetter og laser dissector for å avsmelte organeller 4, for å smelte sammen forskjellige celler 5, eller for å stimulere cellene av optisk drevet last 6,7. Mens optiske pinsett, etter kalibrering av den optiske stivhet, tillatekontroll av anvendt kraft til cellen på en piconewton skala, kan laser disseksjon systemer modulerer optisk manipulasjon, som spenner fra membran foto-poration til ablasjon av single organeller eller disseksjon av sub-cellulære strukturer. Men stoler laser disseksjon kalibrering på en kvalitativ vurdering av foretakets av optisk manipulasjon med hensyn til energien som leveres til prøven, hovedsakelig basert på bildeanalyse illustrerer morfologiske forandringer forårsaket i prøven 8.. I presenterte metoden, viser vi hvordan du utfører kraft spektroskopi måling under laser axonal disseksjon av et utviklingsland nervecellen, å kvantifisere, på piconewton skala, styrken produsert av en endret likevekt i cytoskeleton strukturen i en sub-mobilnettet kupé ni. Dyrkede nerveceller holder seg til underlaget, og polarisere under utvikling. Polariseringen fasen oppstår i løpet av de første fem dagene i vitro. På trinn to av polarisering, en av extruding neurites blir lengre, og det vil differensiere til å bli den axon 10. Aksonal forlengelse som reaksjon på tauekraft på veksten kjegle har tidligere blitt modellert ved Dennerl modell 11.. Nylig har denne modellen blitt utvidet 12 til å omfatte rollen som neurite vedheft til de ekstracellulære matrix underlag. Dette biophysical modell, foreslo etter eksperimentelle observasjonene 13, viste at å trekke styrkene på vekst kjegle, som forplanter seg langs neurite, er modulert av fokale sammenvoksninger til underlaget. Likeledes produserer aksonal lesjon en lokal frigjøring av spenning som forplanter seg mot cellens legeme. Således foreslo vi at måle slik frigjøres strekket i en posisjon langs axon mellom lesjon og cellen soma gir muligheten til å vurdere den dempende utfallet av upåvirkede fokal adhesjon.

Vi kalibrerer den nødvendige energien fotonet-flux av laser dissector å kontrollere omfanget av påført aksonal SKADERe, fra komplett transection til delvis lesjon. Etter kalibrering, gjentok vi delvis lesjon til axons av flere differensierende nevroner og utviklet protokollen for å kvantifisere avspenning, og dermed fått en kvantitativ parameter å anslå vedheft av axon til underlaget 14.

I dette arbeidet, beskriver vi i detalj utviklet protokoll, som representerer en presis eksperimentell prosedyre for å evaluere og sammenligne med piconewton følsomhet nerveskaden heft til underlaget i ulike eksperimentelle forhold som kjemisk behandling 14, eller ulike typer cellekultur støtte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Optisk Setup

Hele optiske systemet ble beskrevet tidligere 15. Kort fortalt er den optiske pinsett-system basert på en ytterbium kontinuerlig bølge (CW) fiber-laser som drives ved 1064 nm (IPG Laser GmbH). En romlig lys modulator (SLM) (LCOS-SLM, modell X10468-07 - Hamamatsu) varierer fasen av innkommende IR laserstråle for å styre plasseringen av fangst fokus flekk på kultur tallerken med datagenererte hologrammer. Den fritt tilgjengelige Blue-pinsett programvare (web link på utstyr tabell) genereres hologrammer projisert på romlig lys modulator. Interferometeret for kraft spektroskopi målinger var basert på en fire-kvadrant fotodiode (QPD, S5980 med C5460SPL 6041 bord - Hamamatsu) og en fotodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

Laseren disseksjon kilden var en pulserende sub-nanosekund UV Nd: YAG laser på 355 nm (PNV-001525-040, Powerchip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). En Akustooptisk modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm smeltet silica-AA-Opto-elektronisk) kontrollerte kraften i UV laser levert til prøven.

Den holografiske optiske pinsett og laser mikro-dissector ble integrert på en modifisert opprettstående mikroskop (BX51 - Olympus) er utstyrt med en 60X, 0,9 NA vann dypping objective.The stadium av mikroskopet er sammensatt av en tre-akse lineær likestrømsmotor mikroposisjonering Systemet (M-126.CG1, Physics-instruments) som bærer et separat tre-akset piezoelektrisk nano-posisjonering trinn (P-733.3DD, Physics-Instruments) for å kombinere grov bevegelse av prøven med den sub-nanometer oppløsning av den piezo- stadium. Mikroskopet trinns system var utstyrt med to kontroll looper synergisk handle for å opprettholde fangst fokus sted til rett stilling, avhengig av valgt driftsfunksjonen (posisjon eller kraft klemme, statisk eller dynamisk) 16. Spesielt virker en intern feedback loop på et piezoelektrisk stadium, for å holde vulsten på en utvalgted avstand fra fellen sentrum. Den andre ytre sløyfe kontrollerer posisjonen til den motoriserte trinn å utnytte regionen utspent av den piezo-aktuator på et større areal enn dets tilgjengelige slaglengde 17.. Når den piezo-stadiet når grensen av tilgjengelig slag i en retning, beveger den ytre sløyfe mikro stadium i motsatt retning, og dermed den piezo gjenvinner mot sin sentrale stilling fordi det sporer fanget vulsten festet til prøven. Når piezo-scenen når den sentrale posisjonen sin gang rekkevidde, stanset mikro scenen. Ytterligere detaljer ved systemet er angitt i Guiggiani et al 16,17.

Et Peltier-enhet (QE1 resistiv oppvarming med TC-344B tokanals varmeapparat - Warner Instruments) styrer temperaturen av cellekulturen under mikroskopet (37 ° C). I kulturen, ble pH og fuktighet opprettholdes på fysiologiske forhold ved å lufte en spesialdesignede polydimetylsiloksansiloxane (PDMS) hylse (integrere mikroskop objektiv) med fuktet carbogen (95% O 2, 5% CO 2).

2. Cell Culture Forberedelse

Alle de eksperimentelle protokoller ble godkjent av det italienske Ministry of Health. Primærkulturer ble innhentet fra hippocampi av mus (C57Bl6J, Charles River) på embryonale dag 18 (E18).

  1. Neuroner ble platet ut ved en konsentrasjon på 25.000 celler / ml på glassbunn petriskåler (P35G-0-14-C - matek Corporation). Den lave konsentrasjonen av dyrkede celler er nødvendig for å unngå dannelse av et tett nettverk som allerede i de første dager in vitro. Ved den nevnte celle konsentrasjon, er sannsynligheten for å finne isolerte celler med lengre neurite ikke er koblet til andre celler er mye høyere.

3. Bead Coating

  1. Polymer Mikrosfærene (Ø 4 mikrometer, COOH-terminert-Bangs Laboratories, produkt kode PC05N/6700) ble belagt med poly-D-lysin ved å følge prosedyren beskrevet i polyLink Protein Coupling Kit (Polysciences, produktkode 19539). Perlene ble belagt med det samme molekyl som brukes til å dekke kulturen støtte og tjeneste celler adhesjon.

4. Velg Isolert Neuron. Løsne en perle fra kultur substrat Trap og overfør Ved siden av Neuron

  1. Sett kultur petriskål på mikroskopet scenen. Etter å ha satt fokus på prøven ved scenen bevegelse, korrigere posisjonen til opplysende målet kondensator å sette Kohler-belysning. Justere belysning optikk for å sette Kolher-belysning tilstand er nødvendig for å bedre den lyse feltet bildekvalitet. Ved hjelp av tilsvarende justering forhold, er det også nødvendig å maksimere IR laser oppsamlingsvirkningsgraden (gjennom objektiv kondensator), fra den spredende fanget probe, for å utføre sin interferometrisk sporing av QPD og PD.
  2. Pipetter noen få mL av det belagte mikrosfærene stamløsning itil kultur parabolen. Mikrokuler vil sette inn og holder seg til den kulturen underlaget. Antallet pl injisert inn i kulturen rett avhenger av mikrosfæren konsentrasjonen av stamløsningen. Den ideelle tilstanden er å ha mellom ett og to mikrosfærer per avbildning synsfelt. Når for mange mikrosfærer legges til kultur fatet, kan de allerede feste tilfeldig til de dyrkede nerveceller.
  3. Beveg deg rundt i kulturen fatet, søker etter en isolert nervecellen med en lengre neurite (axon), og lagre posisjonen til mikroskopet scenen.
  4. Beveg deg rundt og søke etter en perle overholdt kulturen støtte.
  5. Slå på IR fangst laser. På dette stadiet, er ingen hologrammer projiseres på SLM, og plasseringen av IR laser spot sammenfaller med UV laser spot posisjon. Sett aksialstilling av IR flekk 2-3 mikrometer ovenfor kulturen bæreflate, ved mikroskop stadium bevegelse.
  6. Sett UV-laser strøm levert til prøven til mindre enn 1 μW. DenUV laser dissector tidligere er kalibrert 14:
    5-6 μW glasset støtte er ablated
    4 μW en neuronal tilkobling er helt dissekert
    2,5 μW en neurite er delvis lesioned
    <1 μW en sjokkbølge som blir produsert i kultur tallerken. Den optiske sjokkbølge er sterk nok til å løsne fra vulsten glasset støtte.
  7. Slå på UV laser, og samtidig la IR laser på, og flytt UV sted ovenfor levd perle av mikroskop scenen bevegelse. De perle løsner fra overflaten, og det er fanget av IR laser. Deretter slår du av UV laser.
  8. Flytt fanget perle flere mikrometer over glass-støtte (20-30 mikrometer). Løfting av vulsten til denne stilling vil hindre den fra å kontakte andre celler mens den blir beveget mot den tidligere valgt neuron. Ta med perle til den tidligere lagrede scenen posisjon. Satt scenen hastighet til en lav verdi (10 mikrometer / sek) så dra væske kraft ikke overstiger den optiske fellenping kraft.

5. Flytt Trap posisjon i forhold til Laser Dissector Spot og Axon posisjon ved Computer Generated Hologram, og kalibrere den optiske pinsetter Stivhet

  1. Flytt perle mot glasset støtte til å visualisere axon. Vulsten holdes over cellen for å unngå kontakt med den (omtrent 5 mikrometer ovenfor glasset støtte).
  2. Beveg mikroskop stadium å bevege UV fokus flekk på midten av bredden av aksonene. Lagre gjeldende scenen posisjon.
  3. Flytt IR fokus spotposisjon av datagenerert hologram. I dette trinn blir den scene stanset i den stilling som er valgt i det foregående trinn. Når datamaskinen generert hologrammet blir projisert på SLM, blir fanget vulsten beveget med hensyn til aksonene. Vi beveger IR laserpunktet å ha den innfangede vulsten justert på midten av neurite, med UV-laser flekk sentrert på den samme neurite også. IR-spot og dermed fanget perle er plassert langs neurite5-10 mikrometer unna UV sted. Vi flytte plasseringen av IR med hensyn til UV-flekk, avhengig av neurite geometri. I tilfelle de optiske pinsett ikke er utstyrt med et SLM-system, kan posisjonen varieres ved å vippe speil, optiske eller akustiske avvisere, på IR optiske bane. IR laser spot kan plasseres 5-10 mikrometer unna UV sted å unngå optisk samspill av dissekere strålen med fanget sonde, som kunne påvirke sin Brownske bevegelser og endre kraft spektroskopi spor.
  4. Etter å definere nye IR flekk posisjon med hensyn til UV-flekk og axon stilling, flyttes trinn å posisjonere den innfangede vulsten bort fra axon og unngå kollisjon med den. Beveg den aksiale posisjon av den innfangede bead til omtrent 2 mikrometer over dekselet glass.
  5. Juster QPD å sentrere interferensstriper på det: x og y QPD differensielle signalene er nuller når QPD er sentrert. Erverve 5 sek av den Brownske bevegelser av den innfangede vulsten ved den interferometer, ved 50 kHz samplingsfrekvens. Skaff stivhet (pN / nm) og følsomhet (V / nm) av den optiske fellen ved effektspekteret metode 18.

6. Fest Bead til Axon. Utfør Axotomy og samtidig Force Measurement

  1. Hev fanget perle posisjon omtrent fire mikrometer over cover glass, og flytt den til den tidligere lagrede scenen posisjon (se trinn 3.2).
  2. Flytt fanget perle ned mot axon til det berører neurite. Kollisjonen mellom fanget vulsten og axon overvåkes av z QPD signal å detektere forskyvning av vulsten fanget i aksiell retning.
  3. Vent 10 sek med den fanget perle presset mot axon å favorisere sin vedheft til neurite membran.
  4. Beveg mikro fasen for å fortrenge den innfangede vulsten fra axon, og derved bekrefte dets adhesjon til cellemembranen. Hvis vulsten overholdt, unnslipper det fra den optiske fellen.
  5. Flytt tilbake laser felle på overholdt perleog slå på kraft-klemme sløyfe med kraft tilstand lik null. På en slik måte, de piezo-trinns repositions perle, som er festet til celle, på det optiske sentrum felle. Hvis systemet ikke har en feedback loop kontroll, kan laser felle posisjon bli beveget av mikroskopet scenen til sentrum den på overholdt probe. I midten av fellen er nådd når de QPD signaler er de samme som når vulsten er fanget og ikke følges til cellen (x-og y-signaler QPD lik null, og z QPD signal gir samme spenning summen av de fire kvadranter som når vulsten er fanget langt fra en hvilken som helst overflate).
  6. Still et kraft-klemme tilstand på z-aksen, posisjonering trapping laseren litt over midten av perlen (ca. 100 nm), for å generere en forspenning på det adherte fanget sonde. Dersom systemet ikke er utstyrt med en styrke-klemmen kontroll, kan den optiske felle stilling heves opp i trinn på 25 nm ved mikroskopet stadium. Z QPD signal tillater overvåking. Bruk derfor this signal for å angi posisjonen av laser-felle med hensyn til det adherte sonde. Slike pre-ring er nødvendig for å avføle belastningen på membranen etter den axonal lesjon, og den derav følgende reduksjon av Brownske bevegelser av det adherte sonde. En lignende metode er blitt foreslått for å måle frigjøring av spenning i en membran tjore ved videobilledutstyr 19..
  7. Utkobling kraft-klemme tilbakemelding for å måle kraften på det adherte sonden i den stilling-klemmen tilstand (den piezo-fasen er sperret).
  8. Begynn samtidig opptak av de fangede probe posisjoner gjennom interferometeret (20 kHz samplingsfrekvens), og den celle i løpet av laser axotomy time-lapse lys-felt avbildning (20 Hz bildefrekvens).
  9. Slå på UV laser til å levere laser pulser til en lesjon blir synlig på bildet av aksonet (Vanligvis 200-400 optiske pulser er nødvendig Energy per puls:. 25. NJ), deretter slå av UV laser.
  10. Fortsette opptaket ved interferometeret for ca 3 kmN, til x, y og z QPD spor når et platå.

7. Kvantifisere Total avspenning

  1. Konverter de innspilte QPD spor (i volt) etter den kalibrerte følsomhet av det optiske felle, for å oppnå de respektive spor i nanometer.
  2. Filtrer den x, y-og z-forskyvning spor ved en høypassfilter med avskåret ved 10 Hz.
  3. Beregn den totale varians av de filtrerte spor som representerer den Brownske bevegelse av fanget limstrengen. Beregn variansen på 25 ms skritt for overlappende tidsvinduer på 500 ms (10 000 datapunkter) 20. Høypass-filtrering av spor utelukker endringene av Brownske bevegelser på grunn av membranen svingninger eller kortikale aktin bevegelse. Den Brownske bevegelser av vulsten er redusert ved de optiske styrker og vedheft styrker på cellemembranen. Når membranen spennes på grunn av frigjøring av spenningen dens viskositet økes, og dermed den Brownske bevegelser av vulsten, detektert umiddeldelbart etter axotomy, begynner å avta.
  4. Definer t0: begynnelsen av reduksjonen av den Brownske bevegelser variansen, etter levering av UV-laser-energi. Tiden øyeblikkelig t0 angir begynnelsen av membranen belastning.
  5. Definer t1: slutten av reduksjonen av den Brownske bevegelser variansen (når det når et platå). Tiden øyeblikkelig t1 indikerer slutten av membranen belastning.
  6. Utfør video sporing av rusk eller en ripe på dekkglass støtte, for å måle enhver avdrift av prøven i løpet av dynamometer. Å spore partikkel på glasset støtte, må vi først bruke terskler til de lyse-feltet bilder, for å få en bunke med binære bilder med partikkel i hvitt på svart bakgrunn. Deretter kan vi spore partikkel sentrum av masse med sub-piksel nøyaktighet (ved hjelp av freeware ImageJ programvare).
  7. Trekk fra den målte drift fra slagvolum QPD spor. Multiplisere drift-korrigerte QPD spor av de respektive kalibrert optisk stivhet (k x, k z) for å få fx, Fy, Fz spor i piconewtons.
  8. Beregne den totale styrken spor som F tot = √ (Fx ​​2 + Fy 2 + Fz 2).
  9. Beregne den totale frigjøring av kraft mellom t0 og t1 som F utgitt = F tot (t1) - F tot (t0). Kraften måles ved t0 har til å bli trukket fordi det er på grunn av den forskyvning av sonden fra fellen sentrum, når bead fester seg til neurite.
  10. Beregn neurite kontaktflaten mellom fanget perle og UV laser spot posisjon: på den lyse feltet image måle de lange (L) og korte (D) akser av neurite mellom fanget perle og UV laser spot posisjon. Axon kontaktflaten er en axon = L x D.
  11. Normalisere totalt sluppet kraft F utgitt av axon kontaktområdet En axon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellen genererer veigrep på underlaget ved dets fokale sammenvoksninger. Kraft generert av cytoskeletal elementene er i likevekt med den motvirkende kraft av kulturen substrat. Etter laser indusert lesjon i neurite, er noen av de finitt cytoskjelettet kabler forstyrret og deres likevekt spenningen blir frigjort fordi motstridende kraft av underlaget vedheft er eliminert. Den frigjorte spenning er delvis fordeles på upåvirket fokal adhesjon, og perlen festet til cellemembranen, som ble holdt i en optisk felle, måler den del av en slik frigjøring ikke motvirkes av cytoskeletal elementer forankring cellen til substratet (se skjematisk figur 1) .

Vi rapporterer, i figur 2, er et representativt resultat av den ovenfor beskrevne eksperimentelle protokoll. Den neuron, i figur 2a til venstre panel, presenterer en lengre neurite, som identifiserer axon av den differensierende neuron. I figur 2a høyre panelet, er den samme nervecellen vises etter indusert axonal lesjon (angitt med en hvit pil). Figur 2b viser de registrerte perle fortrengning spor i x-, y-og z-retningene. Figur 2c rapporterer video sporing av en ripe på glasset støtte, for å ta hensyn til og eliminere scenen doren under målingen.

I figur 3a, på venstre panel, viser vi den lesioned neurite, og den hvite linjen oppstrøms lesjon stedet, der vi beregner kymograph av neurite diameter under avspenning måling. På høyre panel er kymograph, viser hvordan neurite diameter litt øker umiddelbart etter lesjon, og deretter blir tynnere grunnet frigjøring av spenning mot cellens soma. I figur 3b kvantifisere vi kymograph resultat. Den neurite vises klarere i forhold til bakgrunnen, siden vi posisjonerte attached perle i fokus midt i målet, og derfor axon er litt ute av fokus. Faktisk, ved å rapportere summen av pixel intensiteter langs kymograph linjen på hver ramme av time-lapse video-opptak, får vi et estimat på neurite diameter under utgivelsen av spenning. På panelet 3c, avdekker den totale variansen av det vedlagte limstrengen under avspenning, beregnet på grunnlag av de spor som er registrert av interferometeret (i figur 2b) etter høypass-filtrering ved 10 Hz grensefrekvens. Man registrerer at variansen øker med neurite diameter under oppsamling av materiale oppstrøms for lesjon på. Deretter begynner avviket å redusere (i t0 i figur 3c) når membranen er spent, og den neurite diameteren avtar også. Variansen nedgang når et platå (ved T1 i figur 3c), når spenningen slipper opphører. Etter t1, begynner Brownske bevegelser for å øke fordiav membranen avslapping muligens på grunn av exocytose 21 (se figur 3c).

I figur 4a, indikerer den hvite boksen estimering av neurite kontaktområdet En axon med kulturen støtte. En axon beregnes mellom UV-laser spotposisjon og sentrum av den innfangede sonde. Figur 4b rapporter amplituden spor av den totale frigjøres kraften F utgitt oppnådd etter å multiplisere drivhull korrigerte QPD forskyvning spor (i figur 2b) av de respektive kalibrert optisk felle stivhet (k x, k y, k z). Vi beregner forskjellen mellom kraft målt på tidspunktet t1 og t0 (ΔpN i figur 4b), og deretter vi deler av A axon, for å få spenningen utgitt i form av pN / mikrometer to.

Ved å gjenta den samme protokollen på ulike nerveceller i utvalget, kan vi startesesjoner av eksperimenter på flere kulturer behandlet med kjemiske faktorer eller belagt på forskjellige bærere, og endelig sammenligne den gjennomsnittlige verdien oppnådd i de forskjellige eksperimentelle betingelser. I figur 5, viser vi utgivelsen av spenning etter aksonal skade er dempet av fokale sammenvoksninger på underlaget, og dermed en høyere spenning utgivelse verdi betyr en axon mindre levd opp til underlaget. Fordi vi indusere en delvis, og ikke fullstendig, lesjon av axon, undersøkte vi avhengighet av den målte spenningen slipper på den totale energien som leveres, og på den neurite kontaktflaten mellom lesjon og den fangede vulsten. Vi søkte å ødelegge mer cytoskeletal elementer ved å levere et høyere antall lyspulser, og dermed indusere en høyere frigivelse av spenning. Ellers med økt neurite kontaktområdet, forventet vi å måle en lavere mengde spenning utgivelse. I figur 5, viser vi at avhengigheten av de to nevnte parametre erikke klart. Derfor utledet vi at den induserte delvis lesjon (med den tidligere kalibrert lav energi per puls, se protokoll trinn 4.5), er relatert til den dimensjon av ablasjon sted 8, som ikke varierer ved bruk av den samme mikroskopobjektivlinsehuset og samme energi per puls ved prøven. Videre er det faktum at frigjøring av spenningen ikke er korrelert til kontaktområdet ikke overraskende, fordi det er velkjent at slike parametre ikke representerer et godt estimat på celleadhesjonen til underlaget, som fokal adhesjon opptar bare 1% av basale overflaten 22.

Figur 1
Figur 1. Grafisk fremstilling av forstyrret cytoskeleton likevekt under laser axotomy. En celle overholder et substrat av fokale sammenvoksninger. Blå piler specify veigrep generert av cytoskeletal elementer (angitt med fjærer). Lys-blå pilene viser den motvirkende kreftene som genereres av den stive kultur underlaget. I en forenklet scenario, før lesjon, er cytoskeletal og substrat krefter sammen og likevekt. Etter laser-indusert lesjon i neurite, er sammenhengene mellom noen fjærer og underlaget forstyrret. Således er underlaget ikke lenger motvirker strekningsgrad på den cytoskletal element. Det innestengte vulsten, festet til membranen, spor retning av de frigitte cytoskjelett krefter.

Figur 2
Figur 2. Interferometrisk sporing av et fanget limstreng, festet til membranen ifølge axon fra et hippocampus nevron under laser-indusert lesjon. (A) mørkefelt bilder ervervet under ablasjon av en axon. Før lesjon på venstre panel. Etter lesjon på høyre panel. En poly-D-lysin belagte kule er festet til membranen (polystirene limstreng, O 4 mikrometer) og holdt i et optisk felle. Gjennomsnittlig strøm av IR-laser ved prøven er 14 mW. Hvit pil viser lesjon nettstedet. Bar er 5 mikrometer. (B) innspilte spor etter tilbake fokusplan interferometry av perlen posisjon i den optiske felle. Blå, grønn og rød spor representerer vulsten posisjon langs x-, y-og z-akser, henholdsvis. Samplingsfrekvensen er 20 kHz. (C) Displacement av en ripe på kultur støtte målt ved video sporing for å overvåke scenen drift. Blå og grønne spor er x-og y posisjoner innhentet av video sporing. Frame rate er 5,5 Hz.

77fig3.jpg "/>
Figur 3. Analyse av axon diameter under avspenning, og membranen stamme av lesioned axon. (A) Bright feltet bilde av lesioned axon, på venstre panel. Den hvite linjen vinkelrett på axon indikerer posisjonen hvor et kymograph er beregnet. På høyre panel, kymograph av axon diameter, oppstrøms av lesjon nettstedet. Hver rad av kymograph tilsvarer 0,18 sek. (B) Summen av pixel intensiteter av hver rad i kymograph som representerer et estimat av axon diameter under avspenning. (C) Totalt variansen av den Brownske bevegelser av vulsten festet til axon (t0 og t1 indikerer henholdsvis begynnelsen og slutten av spenning utgivelse i axon etter disseksjon).

0477/50477fig4.jpg "/>
Figur 4. Kvantifisering av spenning løslatt etter axotomy. (A) Bright feltet bilde av lesioned axon. Den hvite boks indikerer estimatet av den neurite kontaktflaten mellom lesjon og sentrum av den fanget limstrengen. (B) Spor av den totale amplitude av styrken målt etter axotomy (F tot = √ (Fx ​​+ Fy 2 2 + Fz 2)). Fx, Fy og Fz ble beregnet ved Hookes lov (F = kx), hvor slagvolum sporene er de vist i Figur 2b. De stivheter, i de tre ortogonale retninger, av den optiske fellen ble beregnet ved effektspekteret metode (k x, y = 7,9 PN / mikrometer, k z = 2,3 PN / mikrometer). ΔpN angir målt utgitt kraft mellom tiden instants t0 og t1.

Figur 5 Figur 5. Avhengighet av målt spenning utgivelse på hvor mye energi som leveres til prøven, og på neurite kontaktområdet. Data fra 26 eksperimenter utført på axons av mus hippocamapal nevroner på 3 DIV. (A) Scatter plott av spenningen slipper versus neurite kontaktområdet mellom lesjon og fanget perle steder. (b) Scatter plott av spenningen slipper versus totale mengden energi levert til prøven neurite kontaktflate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi rapporterer i dette arbeidet en kvantitativ metode for å sammenligne den neurite adhesjon til kultur-substrat, ved å utføre simultan kraft spektroskopi måling under laser-indusert celle lesjon. Den målte frigjøring av spenning er relatert til graden av adhesjon av cellen til substratet: celler med et større antall kontaktpunkter adhesjon bør frigi mindre spenning. Ved å måle frigjøring av spenninger i form av piconewtons gir en fysisk kvantitet som å evaluere den axonal hefting til kulturen støtten i forskjellige eksperimentelle betingelser 14.

Flere laboratorier integrert en laser dissector med en optisk pinsett system, vedta forskjellige optiske design 23. Vårt valg var et oppsett med fast optisk bane og mikroskop scenen bevegelse. For å oppnå dette, introduseres en romlig lysmodulator i IR-laser strålebanen for å bevege den trapping sted med hensyn til UV-laser stilling. Selv galvanometric speil tillate styring av laser fokus stilling uten å bevege prøven, kan de innføre mekanisk støy i systemet som påvirker kraft spektroskopi målinger. Videre har vi besluttet å re-posisjonere IR laser fokus i prøven, siden Brownske bevegelser analyse tillater en rask re-kalibrering av den optiske stivhet. Flytting av UV-laser spotposisjon på prøven kan produsere sfæriske avvik som påvirker kvaliteten av UV-flekk fokus selv, som er ubetydelig bare for små forskyvninger av strålen fra sin sentrale stilling. Derfor kan modifisering av de optiske egenskapene til laseren dissector kreve en de novo kalibrering av den leverte laser strøm kontra skade på enheten.

Av kraft spektroskopi måling, kan vi observere at avspenning er sammensatt av en fast fase av et par sekunder, og en langsom fase som kan vare noen titalls sekunder. Som rapportert i tidligere arbeid 14, noen ganger saktefasen kan vare et par minutter. Av den grunn måtte vi korrigere kraft måling av video spore en ripe på kultur støtte. I fremtiden vil en bedre tilnærming være å avbryte scenen drift med en feedback loop, som automatisk korrigerer mikroskopet scenen stilling ved video eller interferometrisk sporing av en perle festet til dekselet glass. Denne type konfigurasjon, som allerede er rapportert i litteraturen, krever en andre laserstråle sentrert på den vedlagte vulsten, og sikrer stadium stabilisering med sub-nanometerpresisjon 24,25.

I fremtiden ønsker vi å anvende utviklet protokollen for å sammenligne axonal vedheft til kultur støtte på ulike stadier av differensiering og i ulike patologiske tilstander for å gi en kvantitativ analyse for farmakologisk behandling. Videre kan den samme protokollen gjelder utformingen av implanterbare stillasene, å sammenligne neuronal vedheft til ulike typer materialer med distinkt mechanical eller kjemiske egenskaper 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Alberto Guiggiani for utvikling av sanntids kontrollsystem, Evelina Chieregatti og Hanako Tsushima for innsiktsfulle diskusjoner, Giacomo Pruzzo og Alessandro Parodi for utvikling av tilpassede elektronikk og programvare, og Claudia Chiabrera og Marina Nanni for sine ekspertråd og hjelp i cellekultur forberedelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  2. Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
  3. Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
  4. Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
  5. Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
  6. Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
  7. Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
  8. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  9. Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
  10. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
  11. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  12. O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
  13. O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
  14. Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1, (183), (2011).
  15. Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. 191-216 (2011).
  16. Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
  17. Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. (2011).
  18. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
  19. Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
  20. Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
  21. Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
  22. Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
  23. Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
  24. Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
  25. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  26. Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics