Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

1Signalling Programme, The Babraham Institute, 2MRC Group, Cardiff School of Biosciences, Cardiff University
Biology

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Summary

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

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Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond. J. Vis. Exp. (77), e50484, doi:10.3791/50484 (2013).

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Abstract

Autophagy é uma resposta celular desencadeada pela falta de nutrientes, em particular a ausência de aminoácidos. Autophagy é definido pela formação das estruturas de membrana dupla, chamada autofagossomas, que sequestram o citoplasma, proteínas de longa duração e os agregados de proteína, organelas defeituosos, e até mesmo vírus ou bactérias. Autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomas levam a uma degradação do seu conteúdo em massa, produzidos com os nutrientes a ser reciclado de volta para o citoplasma. Portanto, autofagia é crucial para a homeostasia celular, e a desregulação de autofagia pode levar a doença, mais notavelmente a neurodegeneração, envelhecimento e cancro.

Formação autophagosome é um processo muito elaborado, pelo qual as células foram definidos para um grupo específico de proteínas, chamado de máquinas autofagia núcleo. A maquinaria autofagia núcleo é funcionalmente complementadas por proteínas adicionais envolvidas em diversos processos celulares, por exemplo, em membrantráfico de e, em biologia mitocondrial e lisossomal. Coordenação destas proteínas para a formação e degradação de autofagossomas constitui a resposta dinâmica e altamente sofisticadas de autofagia. Imagem de células vivas permite seguir a contribuição molecular de cada proteína relacionada autofagia até ao nível de um único evento de formação autophagosome e em tempo real, pelo que esta técnica oferece uma resolução temporal e espacial elevada.

Aqui usamos uma linha celular estável expressando GFP-DFCP1, para estabelecer um contexto temporal e espacial para a nossa análise. DFCP1 omegasomes marcas, que são estruturas precursoras que conduzem à formação autofagossomas. Uma proteína de interesse (POI) pode ser marcado com um vermelho ou ciano etiqueta fluorescente. Diferentes organelas, como o ER, mitocôndrias e lisossomos, estão todos envolvidos em diferentes etapas de formação autophagosome, e podem ser marcadas com um corante rastreador específico. Microscopia de lapso de tempo de AUTOPHagy nesta montagem experimental, permite que a informação a ser extraído sobre a quarta dimensão, ou seja, o tempo. Assim podemos seguir a contribuição do POI para autofagia no espaço e no tempo.

Introduction

Autophagy é um processo altamente dinâmico, o que requer a coordenação de um grande número de proteínas para o resultado final da formação do autophagosome 1-3. Microscopia é provavelmente o método mais vulgarmente aplicados para estudar autofagia 4. A localização da maioria das proteínas autofagia tem sido extensivamente estudada em células fixadas, quer por imuno-coloração das proteínas endógenas e por expressão de proteína exógena fluorescentemente marcados. Além disso, a microscopia eletrônica (ME), isoladamente e em combinação com marcação imuno-ouro, descreveu os detalhes destas estruturas 5,6. Apesar do facto de que estas técnicas têm estabelecido nossa compreensão da formação autophagosome nas três dimensões do espaço, eles falharam em fornecer uma quantidade suficiente de informação sobre a dimensão de 4 th - tempo. Imagem de células vivas supera esta barreira, uma vez que permite acompanhar a formação de uma autophagosome tão perto quanto possível tempo real 7. Esta técnica foi empregada pela primeira vez para estudar autofagia por Yoshimori e seus colegas 8, e tem sido cada vez mais utilizada daqui em diante.

Microscopia de lapso de tempo capta a localização do PI em células vivas e ao longo de um período de tempo. Ao comparar essas informações com a autofagia bem caracterizados e / ou organela marcador, a análise de imagens de células vivas pode colocar o POI no maior contexto espacial e temporal da formação autophagosome. Análise de imagem de células vivas baseia-se na captura repetitiva da localização POI ao longo de todos os passos de formação autophagosome, enquanto que imagens de células fixas baseia-se numa única captura. Portanto, imagens de células vivas pode provar a contribuição do POI em etapas específicas de formação autophagosome, enquanto imagens de células fixas só podem assumir o papel de POI, com base em sua localização média em muitos autophagosomes simultaneamente capturados em diferentes fases do seu lifecycle.

Apesar de imagens de células vivas é um método de alto poder analítico, ele tem algumas limitações inerentes, que devem ser levados em consideração. Primeiro de tudo, a imagem de células vivas, requer a expressão de uma ou mais proteínas exógenas marcados com fluorescência. Marcas fluorescentes tendem a ser grande em tamanho, e por vezes, podem alterar o comportamento de uma proteína devido a razões estéricas. Esta situação é acentuado para as proteínas da membrana, uma vez que necessitam para funcionar no espaço limitado das duas dimensões de membranas. De nota, autofagossomas são estruturas membranosas e, consequentemente, a sua formação requer um grande número de proteínas associadas à membrana.

Um outro conjunto de problemas é conectado com os níveis de expressão da PI. Em princípio, uma proteína exógena deverá ser expressa em níveis comparáveis ​​aos da proteína endógena. Isto assegura que os reguladores importantes da sua localização sub-celular não vai ser saturado, e thanálise e será biologicamente relevante. Além disso, a sobre-expressão de proteínas autofagia deve ser evitada, tal como quando são expressas acima dos níveis endógenos, que tendem a inibir a resposta autofagia 9. Inversamente, uma vez que os níveis de expressão da PI deve ser suficientemente alta para permitir a sua localização na sequência de um bom período de tempo sem foto-branqueamento, um compromisso deve ser alcançado. Atingir os níveis de expressão de ideais de uma proteína exógena em células de mamíferos requer muita sintonia fina, mas é possível através da criação e seleção linhas de células expressando estavelmente diferentes níveis do POI.

A resolução espacial que pode ser obtida com microscopia de fluorescência padrão é outro factor limitante. A resolução pode ser limitada por um número de razões, mas no melhor dos casos, a resolução lateral, será de cerca de 250 nm. Isto significa que quaisquer objectos separados por uma distância menor do que esta aparece ligado (ou como uma únicaobjeto) e objetos menores do que 250 nm será representado na imagem maior do que eles realmente são. Portanto, as imagens devem ser sempre interpretadas com isso em mente e técnicas complementares, tais como EM será necessário para resolver pequenos detalhes ultra-estrutural.

Finalmente, a imagem de células vivas requer inerentemente exposição de uma célula à luz, possivelmente durante um período de tempo prolongado. Isto pode alterar as respostas fisiológicas de uma célula, um fenômeno conhecido como foto-toxicidade.

Nós utilizamos com sucesso imagens de células vivas da proteína de ligação PI3P DFCP1 descrever, pela primeira vez, que se originam a partir autofagossomas PI3P ricos em anel, como estruturas denominadas omegasomes, que estão em estreita associação com ER fios 10,11. Mostrámos claramente que as estruturas LC3-positivos começam a se formar em estreita associação com omegasomes. Nós, aqui sugerem que emprega uma linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1 para a célula vivaimagiologia da proteína de interesse, estabelece uma estrutura espacial e temporal robusta para a caracterização do seu papel na formação autophagosome.

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Protocol

1. Preparação celular

  1. Semente de baixo número de passagem das células HEK-293T que expressam estavelmente GFP DFCP1 em 22 lamelas redondas mm; células de cultura durante a noite em Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), a uma confluência de 30-40% (o objectivo de confluência de 80% após 2 dias - dias de imagens de células vivas).

2. Transfecção celular

  1. Prepare a mistura complexa de transfecção para cada prato, contendo 100 mL OptiMEM eu reduzi meio de soro, 3 mL X-9 tremeGENE reagente de transfecção de DNA, e 0,5 mg de pECFP-LC3 DNA plasmídeo. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo e incubar 15 minutos à temperatura ambiente. [Nota: temos encontrado repetidamente que outros reagentes de transfecção, como Lipofectamine 2000, tem um monte de toxicidade, e, além disso, eles produzem partículas fluorescentes por conta própria que interferem com muitas técnicas de microscopia.]
  2. Aspirar o meio das placas e adicionam DMEM fresco pré-aquecido a 37 ° C.
  3. Adicione o transfection complexo para células por pipetagem, células incubar durante 24 horas.

3. A incubação de células com o marcador Organelle (Opcional)

  1. Adicionar Mitotracker / Lyso Tracker para DMEM a uma concentração final de 75 nM, e manter em gelo, em um tubo Falcon coberto com folha de alumínio, ao longo de todo o dia experimental, para evitar a exposição à luz e os ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento.
  2. Remove-se uma alíquota de 2 ml da Mitotracker / Lyso Tracker, contendo meio e se aquecer a 37 ° C; meio aspirado a partir de células transfectadas e substituir com Mitotracker / Lyso Tracker contendo meio e as células a incubar durante 30 - 60 min.

4. Preparação da câmara de incubação para imagens de células vivas (Figura 1)

  1. Limpeza de metal e plástico anéis com etanol a 75% e aplicar massa de silicone sobre o aro do metal o-ring.
  2. Usando fórceps remover a lamela da placa e secar o excesso de meio a partir do lado inferior da lamela,para evitar a mistura demasiado médio com a massa lubrificante, pois isso irá aumentar a probabilidade de fugas.
  3. Adicione a lamela para descansar sobre a borda do anel de vedação de plástico e encaixam o anel de vedação de metal no topo do anel de vedação de plástico, com a lamela ensanduichada entre elas, de modo a criar uma câmara fechada.
  4. Encher com a câmara de suporte da placa, a partir deste ponto em diante, evitar prolongada incubação das células em meio DMEM sem um agente de tamponamento, para evitar alterações de pH para ocorrer, assim como o sistema de tampão de bicarbonato de DMEM exige a concentração de CO 2 artificial de 5-10% e a concentração de CO 2 do ar ambiente é muito menor.

5. Fome de Células

  1. Coloque a câmara de incubação na platina do microscópio.
  2. Aspirar o meio completo e lava-se com 2 ml de meio de inanição três vezes, para assegurar que não há aminoácidos de ter permanecido no meio DMEM, o qual irá eventualmente inibir a resposta autofagia; definir otemporizador ON.

6. Microscopia

  1. Será necessário um sistema de imagem apropriado configurado para células vivas de campo amplo epi-fluorescência. Isto irá tipicamente compreender uma armação de microscópio invertido de grau de pesquisa, uma intensa largo espectro fonte de luz, espelhos e filtros específicos para a proteína fluorescente (s) / corante (s) de interesse, uma lente objectiva de alta qualidade, um CCD sensível / scmos câmera e uma câmara de incubação. Todos os principais fabricantes de microscópios oferecer sistemas wide-campo completo apropriado para imagens de células vivas, mas também é possível em casa construir um sistema com componentes de uma variedade de fabricantes e controlá-lo usando o software de código aberto, como Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). O aspecto mais importante na nossa opinião é a utilização de um sistema de alta sensibilidade de modo que os níveis de expressão dos repórteres fluorescentes pode ser mantido a um mínimo.
  2. Selecting as células apropriadas para a imagem.
    1. Seleccionar as células grandes e planas que permitam a formação de eventos mais autophagosome a ser capturado. Além disso, optar por células que já começou a produzir um maior número de omegasomes.
    2. Iniciar a captura vídeo após 30 min ou bem em resposta autofagia, a fim de captar um rácio maior de eventos de formação autophagosome por vídeo.
  3. Imaging.
    1. Use uma lente de grande aumento (100x 1.4 NA).
    2. Ajustar a intensidade da luz de excitação para 10-20% do máximo, para evitar foto-branqueamento.
    3. Defina a câmara (Hamamatsu ORCA ER, tamanho do pixel 6,45 mm) a exposição 100-500 ms, binning 2x2 e 100 de ganho.
    4. Definir a taxa de aquisição de imagem para um quadro a cada 10 seg.

7. Criando montagens de Eventos Formação autophagosome com ImageJ

[Isto pode ser feito de uma forma não sistemática, basta digitalizar o vídeo incorporado pela eaberturas de interesse, mas também pode ser sistematizado, conforme descrito abaixo.]

  1. Abertas as pilhas de imagem para a 3 (ou 2) capturou canais em ImageJ / Fiji.
  2. Aplicar verde, vermelho e azul LUT (tabelas de pesquisa) para o canal correspondente; fundir três cores e salvar.
  3. Na guia Analisar, selecione Ferramentas> ROI gerente ... > Especifique, em seguida, selecione uma área aleatória de tamanho definido na primeira imagem da pilha.
  4. A partir da guia Imagem, selecione duplicar, a fim de duplicar a área selecionada da pilha.
  5. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Faça montagem ... para criar uma montagem experimental que contém todos os quadros capturado. Verificar todos os quadros na montagem de um evento completo formação autophagosome; manter notas do primeiro e do último quadro do evento.
  6. Na guia Analisar, selecione Ferramentas> ROI gerente ... seleccionar a mesma área na primeira imagem da pilha para as outras duas cores, bem como para a imagem de cores resultante da fusão e pilhas duplicado.
  7. De tele guia Arquivo, selecione Novo> Imagem e defina a largura de acordo com o número de pixels inicialmente selecionados usando o gerenciador de ROI, estabelecidos para a altura quatro vezes a altura definida no gerenciador de ROI mais 3 pixels de espaço entre as três cores e as se fundiram, e definir fatias como o número de quadros em cada pilha.
  8. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Ferramentas> Inserir ..., em seguida, insira cada um sub-stack em cima da outra, deixando um espaço de 1 pixel no meio.
  9. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Faça montagem ... para criar uma montagem e acabamento de partida com o primeiro e o último quadro do evento formação autophagosome capturado.

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Representative Results

No protocolo descrito, utilizou-se microscopia de lapso de tempo a seguir a localização de PCP marcado com LC3 numa linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1, sob condições indutoras autofagia. O resultado desta experiência é a captura de duas séries ou pilhas de imagens, uma do verde e uma do canal azul, correspondentes a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Analisamos ainda mais esses vídeos usando ImageJ, a fim de criar montagens correspondentes a eventos únicos formação autophagosome, conforme descrito na seção de protocolo. Esta análise nos permitiu provar que um autophagosome LC3-positivo origina de uma omegasome DFCP1 positivo. Na montagem mostrada na Figura 2, a formação de um omegasome torna-se aparente a partir do segundo quadro, sob a forma de um pequeno ponto. O omegasome começa a se expandir de modo a formar a característica estrutura em forma de anel, e atinge o seu diâmetro máximo após 6 min. Em seguida, começa a omegasome collapsing e eventualmente desaparece, depois de cerca de 10 min. Colocando-se agora a formação da estrutura LC3-positivo ou autophagosome no contexto da formação omegasome, observamos que o autophagosome aparece após o omegasome, e torna-se claramente visível após aproximadamente 1,5 min. O autophagosome começa a se expandir em estreita associação com o omegasome, primeiro lugar e, em seguida, toque, e quando o omegasome começa desmoronar as papilas autophagosome off. Eventualmente, o autophagosome fica para trás, aparentemente para fundir-se com os lisossomos, após a omegasome desaparece. Esta análise proporciona uma indicação clara acerca da relação funcional entre as duas estruturas, de acordo com o qual LC3 autofagossomas positivos originam omegasomes correspondentes.

Em outro exemplo, nós adicionamos um tracker lisossomo, a fim de captar a associação temporal e espacial do autophagosome formação com os lisossomos (Figura 3

No entanto, o mesmo tipo de análise pode produzir resultados não interpretáveis, devido a uma variedade de razões. No exemplo apresentado na Figura 4, os resultados tornam-se não interpretável devido a um desvio no foco. Vídeo inicia a captura com sucesso a formação de uma autophagosome, no entanto um desvio no foco ocorre após a marca de 3 min. A captura de vídeo continua fora de foco para a próxima 6 min, mas, eventualmente, o foco é corrigido manualmente após a min marca de 9 a 10. Esta análise, porém, torna impossível distinguir se o evento de formação autophagosome capturado quando o foco é corrigido é oevento inicial, que está quase concluído, ou uma nova, que começou após a deriva em foco.

Problemas adicionais podem ser atribuídos para a confluência das células cultivadas. Por exemplo, quando as células são cultivadas a uma confluência superior óptimo, eles são obrigados a expandir-se no topo de uma célula adjacente, o que torna a focalização bastante desafiador. Além disso, as células que são cultivadas em alta confluência tendem a ser salientado, aumentando os níveis de atividade autofagia fundo antes do início da inanição.

Finalmente, os problemas relacionados com a fluorescência são bastante comuns. PCP tem mais fraca atividade de fluorescência em relação ao GFP, e muitas vezes fica foto-branqueada em fases posteriores da captura de vídeo. Análise de tais vídeos podem levar a conclusões negativas falsas sobre a associação espacial do POI com autophagosomes formadoras. Contudo, estes problemas podem ser ultrapassados ​​usando uma das variantes, tais como mTurquise2. Outro phenomeno comumn deriva do facto que a fluorescência das marcas vermelhas não é temperada, ao pH mais baixo dos lisossomos. Muitas proteínas autofagia fisiologicamente terminar seu ciclo de vida em lisossomos, enquanto autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomos. Além disso, as proteínas não-funcionais são frequentemente alvo para degradação nos lisossomos. Portanto, pode-se acabar seguindo a associação não-relacionado de autophagosomes com lisossomos, em vez de uma associação física real entre um POI vermelho-marcados e omegasomes.

Figura 1
Figura 1. Câmara de incubação. O O-ring de plástico se encaixa em torno da borda do anel de vedação de metal e tem na parte inferior um ressalto fino que se estende para dentro. A lamela é colocada sobre a borda do anel de vedação de plástico, e, em seguida, o anel de plástico é montado na parte inferior do anel de vedação de metal. Dessa forma, a lamela é de areiainíquas entre os dois anéis de vedação, criando uma câmara fechada.

Figura 2
Figura 2. Células que expressam GFP-DFCP1 e CFP-LC3 estavam sedentos de 30 min e fotografada a uma taxa de 1 quadro a cada 10 segundos. Uma montagem de um evento representativo formação autophagosome é apresentado. Os sinais dos canais verde e azul são pseudo-colorido em verde e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3
Figura 3. As células que expressam a GFP-DFCP1 e CFP-LC3, foram incubadas com vermelho Lyso Tracker, fome durante 30 minutos e trabalhada, a uma taxa de um quadro a cada 15 seg. Uma montagem de um evento de formação autophagosome representativo é apresentado. Os sinais dos canais verde, vermelho e azul são pseudo-cor verde, azul e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. Arrowhead indica a primeira captura de fusão autophagosome com o lisossomo. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4
Figura 4. Células que expressam GFP-DFCP1 e CFP-LC3 estavam sedentos de 30 min e fotografada a uma taxa de 1 quadro a cada 10 segundos. Uma montagem de um exemplo de sub-o ptimal captura é apresentado. Os sinais dos canais verde e azul são pseudo-colorido em verde e vermelho correspondente. As setas indicam a primeira omegasome discernível e autophagosome. Clique aqui para ver a figura maior .

Video 1. Vídeo do evento de formação autophagosome apresentado na Figura 2. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo. Clique aqui para ver filme .

Video 2. O vídeo do evento autophagosome formação apresentada na Figura 3. A seta indica em primeiro lugar, a formação do omegasome, e em segundo lugar, a fusão do autophagosome com o lisossoma. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo."> Clique aqui para ver filme.

Vídeo 3. Vídeo do evento de formação autophagosome apresentado na Figura 4. A taxa de reprodução é de 4 frames por segundo. Clique aqui para ver filme .

Tabela 1. Lista de reagentes e equipamentos específicos necessários para o protocolo, juntamente com o correspondente fornecedor e número de catálogo.

BUFFERS

Tampão Composição Passo Usado
Médio fome 20 mM de HEPES pH 7,4 5.2
140 mM de NaCl
CaCl 2 1 mM
MgCl2 1 mM
5 mM de glucose
1% de BSA

Tabela 2. Lista dos tampões utilizados neste protocolo. Os tampões utilizados, da sua composição e da primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas.

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Discussion

O método descrito neste protocolo permite a visualização da localização de uma proteína durante a formação autophagosome. Temos tentado vários métodos de visualização dos eventos descritos incluindo ponto-de varredura confocal, disco giratório confocal e microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (TIRF). Descobrimos que para fins gerais padrão de campo amplo epi-fluorescência oferece o melhor compromisso entre a sensibilidade ea resolução. Isso garante bom sinal para ruído, photo-bleaching/photo-toxicity mínima e rápida aquisição. A falta de seccionamento óptico não é um problema se regiões apropriadas da célula são escolhidas para a imagem ou seja, a periferia, em que a célula é espalhada e plana. No entanto, é importante que o sistema de imagiologia usado é apropriadamente configurada (tanto em termos de hardware utilizado e as configurações do sistema).

Para uma melhor resolução espacial, é recomendado o uso de uma grande ampliação, high numérica abertura da lente de imersão em óleo (lentes de imersão em água vai oferecer nenhuma imagem benefício em estreita proximidade com a lamela). Sugere-se a equilibrar a intensidade de iluminação (por exemplo, com filtros de densidade neutros), as configurações da câmara (tempo de exposição, binning e ganho) para maximizar a relação sinal-ruído e minimizar branqueamento. Isso terá de ser feito de forma empírica, mas como um guia, quando se usa uma lente de 100x 1.4 NA costumamos reduzir o poder da nossa luz de excitação a 10-20% do máximo e definir a câmara (Hamamatsu ORCA ER, tamanho do pixel 6,45 mm) a exposição 100-500 ms, binning 2x2 e 100 de ganho.

A taxa de aquisição de imagem deve ser definido na faixa de um quadro a cada 1-10 segundos. Aquisição de imagens em taxas de quadro superiores irá garantir melhor continuidade entre as imagens (melhor resolução temporal), mas vai expor as células de mais luz e, assim, aumentar photo-bleaching/photo-toxicity.

Se uma imagem mais fluorescenccanais de mensagens, tem de ser assegurado que o atraso entre a captura do canal é minimizado (reduzir o tempo de exposição, a encaixar trocadores de filtros rápidos). Isso irá reduzir as chances de artefatos de movimento que aparecem na imagem composta. Se artefatos de movimento estão se mostrando difícil de evitar considerar o uso de um divisor de imagem (um dispositivo para facilitar a aquisição simultânea de dois canais de fluorescência usando uma câmera) ou um adaptador de câmera dupla.

Imagem do canal de azul requer a seleção de filtros e espelhos adequados para evitar cross-emissão da fluorescência azul para o canal verde. Temos utilizado com sucesso um CellR microscópio Olympus, que usa o Até policromada V iluminador, permitindo seleção específica de comprimento de onda, largura de banda e da intensidade e por isso é muito flexível. No entanto, a fonte de luz é 'permeável com uma luz branca que passa para além da wavelengths.For seleccionada esta razão temos montada (multi) filtros de excitação de banda nacubos, para que haja adicional de filtragem da luz de excitação. A seguinte combinação de espelhos / filtros foi utilizada (todos Semrock). Para GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, emissor FF02-525/40 (GFP) e FF01-607/36 (mCherry), Espelho dicróico FF505/606-Di01. Para PCP: Exciter FF01-416/501, Emitter FF01-523/610, dicróica Espelho FF440/520-Di01. Temos também utilizado um microscópio CellR diferente, que tem dado resultados sub-óptimos, com cross-emissão de fluorescência azul para o canal verde. Este microscópio utiliza uma fonte de luz branca e tem uma roda de filtro rápido para seleccionar o wavelengths.This excitação significa que a selecção de comprimento de onda está limitado aos filtros em 8 da roda, mas há uma roda separado para regular a intensidade. Foi utilizada a seguinte combinação de espelhos / filtros. Para GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, Emitter FF02-525/50, dicróica Espelho FF495-DI02. Para PCP e mCherry: Exciter FF01-427/10 (PCP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), emissor FF01-472/30 (PCP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Espelho dicróico 89006bs (Chroma).

O significado desta técnica em comparação com outras técnicas de imagiologia é duplo: Em primeiro lugar, ele pode capturar a localização da proteína de interesse em células vivas, e em segundo lugar, pode aumentar a informação extraída adicionando a quarta dimensão do tempo. No entanto, como com as proteínas exógenas, há sempre a possibilidade de mislocalization, quer devido ao aumento dos níveis de expressão ou função de marcação, de imagem de células vivas deve, portanto, ser combinada com imuno-coloração de PI endógenos em células fixas, a fim de confirmar os resultados . Finalmente, vale a pena notar que a imagem de células vivas pode ser combinada com imuno-EM, de modo a aumentar a resolução espacial da análise.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Nosso trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas. Gostaríamos de agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para gentilmente nos fornecer com o plasmídeo para a expressão da CFP-LC3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 41965
OptiMEM I Invitrogen 31985-062
MitoTracker Red FM Invitrogen M22425
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche Applied Science 6365787001
22 mm coverslips VWR 631-0159
35 mm plates Fisher NUNC 153066
Silicon grease RS Components Ltd. RS 494-124
O-rings Custom made
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A-7816 Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope Olympus IX81 Inverted microscope
Objective Olympus UPLSAPO 100XO N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera Hamamatsu ORCA-R2 C10600 10B Progressive scan interline CCD
Illuminator TILL Photonics Polychrome V Ultrafast monochromator
Incubation chamber Solent Scientific Cell^R IX81
Software Olympus SIS xcellence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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