Прижизненные микроскопия микроциркуляцию в мышцах мыши Кремастер для анализа периферических стволовых клеток миграции

1Reference and Translation Centre for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University Rostock, 2Institute for Experimental Surgery, University of Rostock
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Прижизненные микроскопия кремастер микроциркуляции мыши М. предлагает уникальное и хорошо стандартизированы в естественных условиях модели для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Donndorf, P., Ludwig, M., Wildschütz, F., Useini, D., Kaminski, A., Vollmar, B., Steinhoff, G. Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration. J. Vis. Exp. (81), e50485, doi:10.3791/50485 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В эпоху внутрисосудистых прикладных протоколов клеток в контексте регенеративной клеточной терапии, основные механизмы миграции стволовых клеток в nonmarrow ткани не были полностью выяснены. Мы описываем здесь технику прижизненной микроскопии применяется к мыши кремастер микроциркуляции для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток в естественных условиях. Прижизненные микроскопия M. кремастер был ранее введен в области воспалительного исследования для прямого наблюдения лейкоцитов взаимодействия с эндотелием сосудов. Поскольку достаточно периферических стволовых и миграции клеток-предшественников включает подобные начальные шаги вдоль прокатки и фирма адгезии на эндотелиальных выстраиваются вполне возможно применить кремастер модель М. за соблюдение и количественной оценки взаимодействия intravasculary вводимых стволовых клеток с эндотелием. Поскольку различные химические компоненты могут быть выборочно применена к целевой твопрос простыми методами суперфузии, можно установить необходимые микросреды предпосылки, для первоначального набора стволовых клеток, которая пройдет в живом организме вне костного мозга.

Introduction

Цель настоящей статьи заключается в описании технику прижизненной микроскопии (IVM) применяется на мыши кремастер микроциркуляции для непосредственного наблюдения и анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.

Нынешняя концепция стволовых клеток на основе тканей и органов регенерации включает в ноль костного мозга стволовых клеток, полученных в поврежденной ткани 1. Важнейшим шагом для успешной миграции стволовых клеток включает стволовых взаимодействие клеток с местным эндотелия в поврежденного органа с последующим трансэндотелиальной миграции и в конечном итоге органов приживления 2. Прижизненные анализ этих стволовых клеток - эндотелия межклеточных взаимодействий образует идеальную параметр для количественного определения стволовых клеток на основе регенеративной реакции в различных патофизиологических настроек в естественных условиях. Кроме того, представляется предположить, что в будущем, прижизненной анализ миграционной способности конкретного стволовых клеток рopulations пределах стандартных условиях микроциркуляции, могут применяться до продвижения этих групп населения к дальнейшему клинических испытаний.

Прижизненные микроскопия была первоначально разработана для наблюдения и количественной оценки лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия клеток в естественных условиях в области воспалительного исследований 3. Первые успешные записи прижизненных исследований микроскопии сообщили Cohnheim уже в 19 веке, изучая языки и мезентерий лягушек под световым микроскопом 4. С момента своего первого использования IVM претерпела огромные технического развития, и сегодня некоторые существенные компоненты образуют предпосылки для того, чтобы выполнить количественную IVM: (I) тканей препараты, которые позволяют оптического доступа, (II) молекулярные зонды, которые могут быть обнаружены с помощью микроскопа, (III ) микроскоп подключен к системе обнаружения и (IV) систем анализа компьютерных основе, которые могут извлечь интересующие параметры из данных изображениянабор 4.

Разнообразие тканевых препаратов была введена для исследований КБПБ включая мезентериев и печени мыши и крысы 5 дорсальной кожных складок палат мыши 6 и хомяка, уха кролика и хомяка защечный мешок, чтобы назвать несколько.

Тем не менее, в дальнейшем мы сосредоточимся на мыши кремастер мышцы, представляющего собой идеальную ткань для прижизненных наблюдений, как подготовка и визуализация возможны с помощью хорошо стандартизированной хирургической процедуры, и вообще не возникает никаких проблем артефактов движения. Открытая подготовка кремастер мышцы проводилась впервые в 1970-х годах Баэз и его коллеги 7. Первоначально описано у крыс, было успешно принято также к мыши 8. После предыдущие исследования в основном сосредоточены на лейкоцитов взаимодействия с стенки сосуда, наша собственная группа недавно представила мыши подготовку кремастер мышц как ВалуаBLE инструмент для прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий в пределах определенной микросреды 9. Различные субпопуляции стволовых клеток были изучены с использованием этой модели, в том числе мышей с-Kit + костного мозга стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток, а также человеческого стволовых клеток CD + 133 костного мозга 10-12. После выделения клеток из костного мозга доноров и флуоресцентного мечения для визуализации, стволовые клетки селективно применяться в кремастер микроциркуляции с использованием артериальной инъекции через бедренную артерию, тем самым избегая клеток захвата в пределах удаленных органов. Кроме того, модель кремастер мышц особенно полезен, так как различные хемокины потенциально посреднические миграцию местного стволовых клеток в соответствующих настроек, могут местном применении к ткани-мишени по простой технологии суперфузии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Весь протокол после выделения клеток занимает около 2 часов.

1. Микрохирургическая Подготовка

  1. Выполнение изоляции стволовых клеток из костного мозга доноров и флуоресцентного мечения изолированной субпопуляции в соответствии со стандартными протоколами 9,12 позволяют клеткам отдохнуть в течение времени, операция выполняется животное. Для флуоресцентного мечения мы рекомендуем CFDA (карбоксифлуоресцеин Диацетат сукцинимидил эфира).
  2. Обезболить мужской мышь весом 20-25 г кетамином (75 мг / кг) и ксилазина (2,5 мг / кг). На протяжении хирургических процедур и экспериментальных протоколов, анестезия должна поддерживаться добавок (10% от первоначальной инъекции, IP) по мере необходимости (обычно через каждые 30-60 мин).
  3. Бритье мягко передней поверхности правой мошонки, а также правое бедро и пах. Соберите все терять волосы с смоченной ватным тампоном. Поместите мыши брюшной стороной вверх на сцене просмотра оргстекло и исправить платут с использованием эластичного драпировка. Сцена на заказ, состоящий из основания и второй пластине в хвостовом краю опорной пластины для высоты обеих ног и мошонку. Поместите этап на грелку для поддержания температуры тела при 37 ° С После фиксации на сцене, поместите животное под операционным микроскопом и выполните следующие действия операции с использованием 10 - для увеличения 16-кратным.
  4. Сделать начальный разрез не с помощью ножниц кожи на правом бедре, всего передней из бедренных сосудов от колена до в пах.
  5. Определить бедренную артерию и следовать ему проксимально, мобилизации артерии от окружающих мягких тканей. Выявление и сократить большую ветку, чтобы левого яичка с помощью thermocautery. После этого поместите пребывания шов поверхностно в левом яичке. Нежный тяги будет способствовать дальнейшему ближний мобилизации бедренной артерии.
  6. После завершения проксимального мобилизации, определить и сократить большое филиал работает mediallу на бедро thermocautery. После лигирования бедренную артерию в дистальной части правого бедра. Нежный тяга на лигатуры поможет дополнительной подготовки.
  7. Включите внимание теперь к проксимального отдела бедренной артерии снова и поместить шов вокруг артерии, как проксимально, насколько это возможно. Подготовьте узел, но не связывают его еще. Нежный тягу к шву и создать артериальное петель.
  8. После установления петель, надрезать артерия, тщательно используя microscissor. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не повредить бедренную вену.
  9. Вставьте подготовленную микрокатетера (внутренний диаметр 0,28 мм) через разрез. Катетер должен быть deaired (0,9% хлорид натрия, NaCl) и подключен к 1 мл шприца предварительного введения.
  10. После успешного введения катетера, тщательно ослабить петель, чтобы облегчить прохождение катетера. Артериальная кровоток должен быть сразу же видны в катетер. Аккуратно продвигать катетер несколько миллиметрс пределами предыдущего перегибов. После этого, сковать, подготовленный лигатуры для фиксации катетера.
  11. Аккуратно промойте катетер (0,9% NaCl) и аспирации для подтверждения правильного положения. Используйте кусок ленты для дальнейшего обеспечения катетер для стадии эксплуатации.
  12. После адекватной фиксации, поставить катетер в сторону для следующих стадий получения мышц кремастер. Применение регулярной промывки и стремление катетера каждые 5-10 мин, чтобы предотвратить образование тромбов.
  13. Включите внимание теперь на правую мошонки и сделать надрез, сокращая кожу и фасции над вентральной части правой мошонку. Будьте осторожны, не прикасайтесь к основной ткани с любыми инструментами.
  14. Расширение разрез до паховой складки и каудально к дистальному концу мошонки.
  15. Тщательно отдельный основной мягкой и соединительной ткани выше кремастер мешок, не касаясь его. Определить дистального конца кремастер, и место пребывания шва здесь, чтобы SLightly расширить мышцы. Резекцию теперь оставшиеся мягкие ткани под мышечной мешок, осторожно потянув мышцу каудально и вперед.
  16. После полного отделения от соединительной ткани, откройте кремастер мешок в одной точке на черепной краю с помощью ножниц. Расширить разрез от этого открытия вниз к дальнему концу мышцы.
  17. Уплотнение небольшое судно подключения яичко и кремастер помощью thermocautery, затем резать оставшихся связей между мышцей и яичка с помощью ножниц.
  18. Отложите яичко, из области микроскопии.
  19. Открыл кремастер сейчас лежит плашмя на сцене. Поместите четыре 6-0 Prolene пребывания швы по краям ткани и исправить их с упругой драпировка для того, чтобы распространить кремастер мышечной ткани. Отныне постоянно увлажнять ткань с фосфатно-солевой буфер (PBS) с использованием 1 мл шприц (рис. 1).
  20. Разрешить сейчас подготовку отдохнуть в течение 15 мин. После инъекции0,05-0,1 мл 1% родамина-декстрана через левую бедренную артерию для повышения контрастности микрососудов. Если какие-либо хемокинов или агенты планируются к применению, теперь вы должны местно увлажнить мышцы с соответствующим реагентом, используя 1 мл шприц. В случае контрольного эксперимента, по-прежнему увлажнения с PBS.

2. Прижизненные микроскопия

  1. Держите мышь, закрепленный на стадии эксплуатации и двигаться под флуоресцентным микроскопом модифицированной для эпи-подсветкой и подключенного к ПЗС (прибора с зарядовой связью) видеокамера. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не вывихнуть катетер бедренной артерии.
  2. Провести эксперименты с использованием погружения в воду цели.
  3. После корректировки цели в течение достаточного визуализации кремастер микроциркуляции и до введения клеток, стохастически определить шесть посткапиллярных венулы для последующего анализа твердой приверженности стволовых клеток.
  4. Администрирование меченных флуоресцентными стволовые клетки,растворяли в 200 мкл PBS, в 0,4 × 10 6 клеток на инъекции, в общей сложности пяти последовательных инъекций с использованием катетер бедренной артерии и шприц емкостью 1 мл. Тщательно встряхнуть кюветы до первой инъекции.
  5. Запись стволовых клеток прокатки сразу после инъекции клеток, тем самым определяя "прокатки" как уменьшение более чем на 50% скорости клеточного вдоль эндотелиальной выстилки в сочетании с типичной сотовой "палки и освобождение" движений. Выполните подсчет прокатных стволовых клеток и все стволовые клетки, проходящие предопределенный расстояние венулярный в течение 1 мин наблюдения после каждой одной инъекции. Количество стволовых клеток прокатки выражают в процентах от всех проходящих клеток. Не рассчитывайте клетки выставке случайные краткие явления привязывать как прокатных клеток.
  6. После последней инъекции клеток определения количества прочно прилипающих стволовых клеток путем подсчета и выразить количество по отношению к расчетной эндотелиальной поверхности гоэ шесть предопределенных венул (диаметр х длина х π), а прилипшие клеток / мм 2. Фирма адгезия считается, когда нет движения клеток не обнаруживается в течение 30 сек.
  7. После завершения прижизненной микроскопии осторожно снимите кремастер мышцы и хранить его в соответствие последующего анализа (иммуногистохимии или молекулярной биологии). Жертвоприношение животного путем смещения шейных позвонков. Анализ прижизненной микроскопии записи для количественного определения прокатки стволовых клеток и твердой эндотелиальной адгезии, а также микрососудистых гемодинамики, таких как скорости красных кровяных клеток (мм / с), длины судна (мкм), диаметр сосуда (мкм), скорость доля стена (с -1); должны быть выполнены форума исследователем, не знающим к соответствующему экспериментального лечения тканей, использующей программное обеспечение для обработки изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В общем, взаимодействие непосредственно вводили стволовые или родительские клетки с сосудистого эндотелия в рамках кремастер мышечной микроциркуляции является редким событием и происходит исключительно в посткапиллярных венул (диаметром: 30-80 мкм). В связи с флуоресцентной маркировки прокатки и прочно прикрепленные стволовые клетки могут быть четко количественно в отрыве от циркулирующих эндогенных лейкоцитов в наблюдаемых венул (рис. 2).

Условия микроциркуляции, представленные скорости кровотока и скорости сдвига стены, как правило, значительно не отличаются между соответствующими экспериментальными группами с различным лечения хемокинов (табл. 1).

Местное лечение кремастер мышечной ткани с различными хемокинов или медиаторов воспалительной реакции, например, SDF-1α (стромальных клеток, полученных фактор-1 альфа) или TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) способен имитировать конкретный миcroenvironmental условия. Такие условия повышения стволовых клеток-эндотелиальной взаимодействия клеток в другом размере, в зависимости от конкретного хемокинов / посредника применяется и стволовых клеток населения вводится (рис. 3) 12. Возможность четко количественно эти различные модели сотовых-эндотелиальной взаимодействия стволовых клеток дает возможность для оценки миграционного потенциала конкретных популяций стволовых клеток в пределах, определенных микросреды в естественных условиях до продвижения этих групп населения для дальнейшего клинические испытания.

Кроме того, воздействие некоторых патофизиологических условиях влияния на функцию эндотелия, таких как дефицит азотно-оксида, как было показано с использованием нокаутных животных 9.

Рисунок 1
Рисунок 1. Иллюстрация из ключевых микрохирургических шагов (AF) в мыши кремастер музподготовка НКУ для последующего прижизненной микроскопии.

Рисунок 2
Рисунок 2. Прижизненные микроскопия с-Kit + клеток в мышиной подготовки кремастер мышц. Внутрисосудистая фон обеспечивается родамином-декстрана. (AF) Серия из шести последовательных изображений с прокатки (черные стрелки) и прочно прилипших (белая стрелка) карбоксизащитных флуоресцеина D-ацетат succinimidylester меченных с-Kit + клеток в венулярного сосудов. Лаборатория Инвест, 2008, Vol 88. Каминский А., Ма, Н., Donndorf, П. и др..

Рисунок 3
Рисунок 3. Количественный анализ взаимодействий между с-Kit + клетки и эндотелиальные клетки на основе прижизненной флуоресцентной микроскопических изображений. (а) количество подвижного с-Kit + клеток на венулярного эндотелия (выраженное в процентах от общего числа проходящих клеток) в мышиных мышц Кремастер подвергающихся SDF-1α, TNF-α или комбинации того и другого по сравнению с с-Kit + инъекции клеток без хемокинов предварительной обработки (контроль). Лечение с SDF-1α один и сочетание SDF-1α + TNF-α Увеличение доли прокатных с-Kit + клеток. (Б) количество прочно прилипающих с-Kit + клеток на мм 2 венул эндотелиальной выстилки значительно увеличивается только после обработки сочетанием SDF-1α + TNF-α. Данные выражены как среднее ± SEM (* Р <0,05 по сравнению с контролем). Lab Invest, 2008, том 88. Каминский А., Ма, Н., Donndorf, П. и др..

Тип мыши Экспериментальная группа скорость эритроцитов(Мм / сек) скорость сдвига стены (с -1)
Дикого типа Контроль 0,7 ± 0,2 43 ± 32
Дикого типа SDF-1α 0,5 ± 0,2 51 ± 31
Дикого типа ФНО 0,4 ± 0,2 45 ± 24
Дикого типа SDF-1 α + TNF α 1,0 ± 0,5 117 ± 26

Таблица 1. Красная скорости клеток крови и скорости сдвига стены в венулах мышиных мышц Кремастер в начале исследования. Анализ проводили с использованием CapImage Software (Zeintl, Гейдельберг, Германия) в мышечных препаратов мышей дикого типа после лечения SDF-1α, TNF-α. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение различий между отдельными группами не было обнаружено быть значительным. и др..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Прижизненные флуоресцентной микроскопии позволяет прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий. Модель кремастер мышц является особенно полезным, так как микрохирургической экспозиции и методы прижизненной визуализации были хорошо известны в ходе исследований по лейкоцитов эндотелия взаимодействий и различных химических компонентов могут быть выборочно применен к ткани-мишени путем простого метода суперфузии. В связи с отсутствием артефактов движения и тяжелой шумов изображения, эта конкретная модель, по сравнению с другими настройками прижизненной микроскопии, обеспечивает оптимальные условия для визуализации межклеточных взаимодействий.

Модель позволяет выявить существенные микросреды предпосылки, для вербовки начальная стволовых клеток состоится в живом организме. При необходимости, эндогенные лейкоциты могут служить положительные элементы управления для проверки и доказать принципа поведения стволовых клеток.

jove_content "> Представление острый животную модель и использования прямой артериальной инъекции вместо венозной применения, потенциальные ограничения хронических моделей миграции клеток и / или системной доставки клеток - например, гибели клеток из-за затягивания в отдаленных органах - можно избежать с другой. С другой стороны, острый хирургический ткань травма может вызвать определенную степень активации ткани непосредственно. Таким образом, атравматичность хирургический препарат является обязательным и стабильной микроциркуляции условия следующие кремастер препарат мышцы должны быть достигнуты в воспроизводимом моды предварительного начиная с экспериментальными группами.

Наличие обширного накопления лейкоцитов в пределах посткапиллярных венул и значительное утечки флуоресцентным красителем на окружающие ткани в начале прижизненной микроскопии записей в контрольных животных показывают большую травму тканей хирургическое.

Тем не менее, даже тогда, когда уделяя пристальное подгометоды рацион, результаты, полученные из разных исследователей, не обязательно полностью сопоставимы из-за слегка отличающихся активации базовой ткани. Именно поэтому последующие эксперименты должны быть выполнены одним и тем же следователем, когда это возможно.

Предназначен для анализа и количественной оценки начальных этапах набора стволовых клеток в тканях-мишенях, нынешняя модель не позволяет заявления по определенной стволовых клеток органа-приживления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все эксперименты на животных, проведенные для этой рукописи были одобрены местным уходу и использованию животных комитета.

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA C1157
Rhodamine 6 G (1%) Sigma-Aldrich, Munich, Germany 83697
Ketamin (Ketanest) Pfizer, Berlin, Germany not available
Xylacin (Rompun) Bayer, Leverkusen, Germany not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS) PAN Biotech, Aidenbach, Germany P04-36500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
  2. Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home? Blood. 106, 1901-1910 (2005).
  3. Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
  4. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  5. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
  6. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  7. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
  8. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. e2874 (2011).
  9. Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
  10. Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
  11. Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
  12. Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics