Summary
Прижизненные микроскопия кремастер микроциркуляции мыши М. предлагает уникальное и хорошо стандартизированы в естественных условиях модели для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.
Abstract
В эпоху внутрисосудистых прикладных протоколов клеток в контексте регенеративной клеточной терапии, основные механизмы миграции стволовых клеток в nonmarrow ткани не были полностью выяснены. Мы описываем здесь технику прижизненной микроскопии применяется к мыши кремастер микроциркуляции для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток в естественных условиях. Прижизненные микроскопия M. кремастер был ранее введен в области воспалительного исследования для прямого наблюдения лейкоцитов взаимодействия с эндотелием сосудов. Поскольку достаточно периферических стволовых и миграции клеток-предшественников включает подобные начальные шаги вдоль прокатки и фирма адгезии на эндотелиальных выстраиваются вполне возможно применить кремастер модель М. за соблюдение и количественной оценки взаимодействия intravasculary вводимых стволовых клеток с эндотелием. Поскольку различные химические компоненты могут быть выборочно применена к целевой твопрос простыми методами суперфузии, можно установить необходимые микросреды предпосылки, для первоначального набора стволовых клеток, которая пройдет в живом организме вне костного мозга.
Introduction
Цель настоящей статьи заключается в описании технику прижизненной микроскопии (IVM) применяется на мыши кремастер микроциркуляции для непосредственного наблюдения и анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.
Нынешняя концепция стволовых клеток на основе тканей и органов регенерации включает в ноль костного мозга стволовых клеток, полученных в поврежденной ткани 1. Важнейшим шагом для успешной миграции стволовых клеток включает стволовых взаимодействие клеток с местным эндотелия в поврежденного органа с последующим трансэндотелиальной миграции и в конечном итоге органов приживления 2. Прижизненные анализ этих стволовых клеток - эндотелия межклеточных взаимодействий образует идеальную параметр для количественного определения стволовых клеток на основе регенеративной реакции в различных патофизиологических настроек в естественных условиях. Кроме того, представляется предположить, что в будущем, прижизненной анализ миграционной способности конкретного стволовых клеток рopulations пределах стандартных условиях микроциркуляции, могут применяться до продвижения этих групп населения к дальнейшему клинических испытаний.
Прижизненные микроскопия была первоначально разработана для наблюдения и количественной оценки лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия клеток в естественных условиях в области воспалительного исследований 3. Первые успешные записи прижизненных исследований микроскопии сообщили Cohnheim уже в 19 веке, изучая языки и мезентерий лягушек под световым микроскопом 4. С момента своего первого использования IVM претерпела огромные технического развития, и сегодня некоторые существенные компоненты образуют предпосылки для того, чтобы выполнить количественную IVM: (I) тканей препараты, которые позволяют оптического доступа, (II) молекулярные зонды, которые могут быть обнаружены с помощью микроскопа, (III ) микроскоп подключен к системе обнаружения и (IV) систем анализа компьютерных основе, которые могут извлечь интересующие параметры из данных изображениянабор 4.
Разнообразие тканевых препаратов была введена для исследований КБПБ включая мезентериев и печени мыши и крысы 5 дорсальной кожных складок палат мыши 6 и хомяка, уха кролика и хомяка защечный мешок, чтобы назвать несколько.
Тем не менее, в дальнейшем мы сосредоточимся на мыши кремастер мышцы, представляющего собой идеальную ткань для прижизненных наблюдений, как подготовка и визуализация возможны с помощью хорошо стандартизированной хирургической процедуры, и вообще не возникает никаких проблем артефактов движения. Открытая подготовка кремастер мышцы проводилась впервые в 1970-х годах Баэз и его коллеги 7. Первоначально описано у крыс, было успешно принято также к мыши 8. После предыдущие исследования в основном сосредоточены на лейкоцитов взаимодействия с стенки сосуда, наша собственная группа недавно представила мыши подготовку кремастер мышц как ВалуаBLE инструмент для прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий в пределах определенной микросреды 9. Различные субпопуляции стволовых клеток были изучены с использованием этой модели, в том числе мышей с-Kit + костного мозга стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток, а также человеческого стволовых клеток CD + 133 костного мозга 10-12. После выделения клеток из костного мозга доноров и флуоресцентного мечения для визуализации, стволовые клетки селективно применяться в кремастер микроциркуляции с использованием артериальной инъекции через бедренную артерию, тем самым избегая клеток захвата в пределах удаленных органов. Кроме того, модель кремастер мышц особенно полезен, так как различные хемокины потенциально посреднические миграцию местного стволовых клеток в соответствующих настроек, могут местном применении к ткани-мишени по простой технологии суперфузии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Весь протокол после выделения клеток занимает около 2 часов.
1. Микрохирургическая Подготовка
- Выполнение изоляции стволовых клеток из костного мозга доноров и флуоресцентного мечения изолированной субпопуляции в соответствии со стандартными протоколами 9,12 позволяют клеткам отдохнуть в течение времени, операция выполняется животное. Для флуоресцентного мечения мы рекомендуем CFDA (карбоксифлуоресцеин Диацетат сукцинимидил эфира).
- Обезболить мужской мышь весом 20-25 г кетамином (75 мг / кг) и ксилазина (2,5 мг / кг). На протяжении хирургических процедур и экспериментальных протоколов, анестезия должна поддерживаться добавок (10% от первоначальной инъекции, IP) по мере необходимости (обычно через каждые 30-60 мин).
- Бритье мягко передней поверхности правой мошонки, а также правое бедро и пах. Соберите все терять волосы с смоченной ватным тампоном. Поместите мыши брюшной стороной вверх на сцене просмотра оргстекло и исправить платут с использованием эластичного драпировка. Сцена на заказ, состоящий из основания и второй пластине в хвостовом краю опорной пластины для высоты обеих ног и мошонку. Поместите этап на грелку для поддержания температуры тела при 37 ° С После фиксации на сцене, поместите животное под операционным микроскопом и выполните следующие действия операции с использованием 10 - для увеличения 16-кратным.
- Сделать начальный разрез не с помощью ножниц кожи на правом бедре, всего передней из бедренных сосудов от колена до в пах.
- Определить бедренную артерию и следовать ему проксимально, мобилизации артерии от окружающих мягких тканей. Выявление и сократить большую ветку, чтобы левого яичка с помощью thermocautery. После этого поместите пребывания шов поверхностно в левом яичке. Нежный тяги будет способствовать дальнейшему ближний мобилизации бедренной артерии.
- После завершения проксимального мобилизации, определить и сократить большое филиал работает mediallу на бедро thermocautery. После лигирования бедренную артерию в дистальной части правого бедра. Нежный тяга на лигатуры поможет дополнительной подготовки.
- Включите внимание теперь к проксимального отдела бедренной артерии снова и поместить шов вокруг артерии, как проксимально, насколько это возможно. Подготовьте узел, но не связывают его еще. Нежный тягу к шву и создать артериальное петель.
- После установления петель, надрезать артерия, тщательно используя microscissor. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не повредить бедренную вену.
- Вставьте подготовленную микрокатетера (внутренний диаметр 0,28 мм) через разрез. Катетер должен быть deaired (0,9% хлорид натрия, NaCl) и подключен к 1 мл шприца предварительного введения.
- После успешного введения катетера, тщательно ослабить петель, чтобы облегчить прохождение катетера. Артериальная кровоток должен быть сразу же видны в катетер. Аккуратно продвигать катетер несколько миллиметрс пределами предыдущего перегибов. После этого, сковать, подготовленный лигатуры для фиксации катетера.
- Аккуратно промойте катетер (0,9% NaCl) и аспирации для подтверждения правильного положения. Используйте кусок ленты для дальнейшего обеспечения катетер для стадии эксплуатации.
- После адекватной фиксации, поставить катетер в сторону для следующих стадий получения мышц кремастер. Применение регулярной промывки и стремление катетера каждые 5-10 мин, чтобы предотвратить образование тромбов.
- Включите внимание теперь на правую мошонки и сделать надрез, сокращая кожу и фасции над вентральной части правой мошонку. Будьте осторожны, не прикасайтесь к основной ткани с любыми инструментами.
- Расширение разрез до паховой складки и каудально к дистальному концу мошонки.
- Тщательно отдельный основной мягкой и соединительной ткани выше кремастер мешок, не касаясь его. Определить дистального конца кремастер, и место пребывания шва здесь, чтобы SLightly расширить мышцы. Резекцию теперь оставшиеся мягкие ткани под мышечной мешок, осторожно потянув мышцу каудально и вперед.
- После полного отделения от соединительной ткани, откройте кремастер мешок в одной точке на черепной краю с помощью ножниц. Расширить разрез от этого открытия вниз к дальнему концу мышцы.
- Уплотнение небольшое судно подключения яичко и кремастер помощью thermocautery, затем резать оставшихся связей между мышцей и яичка с помощью ножниц.
- Отложите яичко, из области микроскопии.
- Открыл кремастер сейчас лежит плашмя на сцене. Поместите четыре 6-0 Prolene пребывания швы по краям ткани и исправить их с упругой драпировка для того, чтобы распространить кремастер мышечной ткани. Отныне постоянно увлажнять ткань с фосфатно-солевой буфер (PBS) с использованием 1 мл шприц (рис. 1).
- Разрешить сейчас подготовку отдохнуть в течение 15 мин. После инъекции0,05-0,1 мл 1% родамина-декстрана через левую бедренную артерию для повышения контрастности микрососудов. Если какие-либо хемокинов или агенты планируются к применению, теперь вы должны местно увлажнить мышцы с соответствующим реагентом, используя 1 мл шприц. В случае контрольного эксперимента, по-прежнему увлажнения с PBS.
2. Прижизненные микроскопия
- Держите мышь, закрепленный на стадии эксплуатации и двигаться под флуоресцентным микроскопом модифицированной для эпи-подсветкой и подключенного к ПЗС (прибора с зарядовой связью) видеокамера. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не вывихнуть катетер бедренной артерии.
- Провести эксперименты с использованием погружения в воду цели.
- После корректировки цели в течение достаточного визуализации кремастер микроциркуляции и до введения клеток, стохастически определить шесть посткапиллярных венулы для последующего анализа твердой приверженности стволовых клеток.
- Администрирование меченных флуоресцентными стволовые клетки,растворяли в 200 мкл PBS, в 0,4 × 10 6 клеток на инъекции, в общей сложности пяти последовательных инъекций с использованием катетер бедренной артерии и шприц емкостью 1 мл. Тщательно встряхнуть кюветы до первой инъекции.
- Запись стволовых клеток прокатки сразу после инъекции клеток, тем самым определяя "прокатки" как уменьшение более чем на 50% скорости клеточного вдоль эндотелиальной выстилки в сочетании с типичной сотовой "палки и освобождение" движений. Выполните подсчет прокатных стволовых клеток и все стволовые клетки, проходящие предопределенный расстояние венулярный в течение 1 мин наблюдения после каждой одной инъекции. Количество стволовых клеток прокатки выражают в процентах от всех проходящих клеток. Не рассчитывайте клетки выставке случайные краткие явления привязывать как прокатных клеток.
- После последней инъекции клеток определения количества прочно прилипающих стволовых клеток путем подсчета и выразить количество по отношению к расчетной эндотелиальной поверхности гоэ шесть предопределенных венул (диаметр х длина х π), а прилипшие клеток / мм 2. Фирма адгезия считается, когда нет движения клеток не обнаруживается в течение 30 сек.
- После завершения прижизненной микроскопии осторожно снимите кремастер мышцы и хранить его в соответствие последующего анализа (иммуногистохимии или молекулярной биологии). Жертвоприношение животного путем смещения шейных позвонков. Анализ прижизненной микроскопии записи для количественного определения прокатки стволовых клеток и твердой эндотелиальной адгезии, а также микрососудистых гемодинамики, таких как скорости красных кровяных клеток (мм / с), длины судна (мкм), диаметр сосуда (мкм), скорость доля стена (с -1); должны быть выполнены форума исследователем, не знающим к соответствующему экспериментального лечения тканей, использующей программное обеспечение для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общем, взаимодействие непосредственно вводили стволовые или родительские клетки с сосудистого эндотелия в рамках кремастер мышечной микроциркуляции является редким событием и происходит исключительно в посткапиллярных венул (диаметром: 30-80 мкм). В связи с флуоресцентной маркировки прокатки и прочно прикрепленные стволовые клетки могут быть четко количественно в отрыве от циркулирующих эндогенных лейкоцитов в наблюдаемых венул (рис. 2).
Условия микроциркуляции, представленные скорости кровотока и скорости сдвига стены, как правило, значительно не отличаются между соответствующими экспериментальными группами с различным лечения хемокинов (табл. 1).
Местное лечение кремастер мышечной ткани с различными хемокинов или медиаторов воспалительной реакции, например, SDF-1α (стромальных клеток, полученных фактор-1 альфа) или TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) способен имитировать конкретный миcroenvironmental условия. Такие условия повышения стволовых клеток-эндотелиальной взаимодействия клеток в другом размере, в зависимости от конкретного хемокинов / посредника применяется и стволовых клеток населения вводится (рис. 3) 12. Возможность четко количественно эти различные модели сотовых-эндотелиальной взаимодействия стволовых клеток дает возможность для оценки миграционного потенциала конкретных популяций стволовых клеток в пределах, определенных микросреды в естественных условиях до продвижения этих групп населения для дальнейшего клинические испытания.
Кроме того, воздействие некоторых патофизиологических условиях влияния на функцию эндотелия, таких как дефицит азотно-оксида, как было показано с использованием нокаутных животных 9.
Рисунок 1. Иллюстрация из ключевых микрохирургических шагов (AF) в мыши кремастер музподготовка НКУ для последующего прижизненной микроскопии.
Рисунок 2. Прижизненные микроскопия с-Kit + клеток в мышиной подготовки кремастер мышц. Внутрисосудистая фон обеспечивается родамином-декстрана. (AF) Серия из шести последовательных изображений с прокатки (черные стрелки) и прочно прилипших (белая стрелка) карбоксизащитных флуоресцеина D-ацетат succinimidylester меченных с-Kit + клеток в венулярного сосудов. Лаборатория Инвест, 2008, Vol 88. Каминский А., Ма, Н., Donndorf, П. и др..
Рисунок 3. Количественный анализ взаимодействий между с-Kit + клетки и эндотелиальные клетки на основе прижизненной флуоресцентной микроскопических изображений. (а) количество подвижного с-Kit + клеток на венулярного эндотелия (выраженное в процентах от общего числа проходящих клеток) в мышиных мышц Кремастер подвергающихся SDF-1α, TNF-α или комбинации того и другого по сравнению с с-Kit + инъекции клеток без хемокинов предварительной обработки (контроль). Лечение с SDF-1α один и сочетание SDF-1α + TNF-α Увеличение доли прокатных с-Kit + клеток. (Б) количество прочно прилипающих с-Kit + клеток на мм 2 венул эндотелиальной выстилки значительно увеличивается только после обработки сочетанием SDF-1α + TNF-α. Данные выражены как среднее ± SEM (* Р <0,05 по сравнению с контролем). Lab Invest, 2008, том 88. Каминский А., Ма, Н., Donndorf, П. и др..
| Тип мыши | Экспериментальная группа | скорость эритроцитов(Мм / сек) | скорость сдвига стены (с -1) |
| Дикого типа | Контроль | 0,7 ± 0,2 | 43 ± 32 |
| Дикого типа | SDF-1α | 0,5 ± 0,2 | 51 ± 31 |
| Дикого типа | ФНО | 0,4 ± 0,2 | 45 ± 24 |
| Дикого типа | SDF-1 α + TNF α | 1,0 ± 0,5 | 117 ± 26 |
Таблица 1. Красная скорости клеток крови и скорости сдвига стены в венулах мышиных мышц Кремастер в начале исследования. Анализ проводили с использованием CapImage Software (Zeintl, Гейдельберг, Германия) в мышечных препаратов мышей дикого типа после лечения SDF-1α, TNF-α. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение различий между отдельными группами не было обнаружено быть значительным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прижизненные флуоресцентной микроскопии позволяет прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий. Модель кремастер мышц является особенно полезным, так как микрохирургической экспозиции и методы прижизненной визуализации были хорошо известны в ходе исследований по лейкоцитов эндотелия взаимодействий и различных химических компонентов могут быть выборочно применен к ткани-мишени путем простого метода суперфузии. В связи с отсутствием артефактов движения и тяжелой шумов изображения, эта конкретная модель, по сравнению с другими настройками прижизненной микроскопии, обеспечивает оптимальные условия для визуализации межклеточных взаимодействий.
Модель позволяет выявить существенные микросреды предпосылки, для вербовки начальная стволовых клеток состоится в живом организме. При необходимости, эндогенные лейкоциты могут служить положительные элементы управления для проверки и доказать принципа поведения стволовых клеток.
jove_content "> Представление острый животную модель и использования прямой артериальной инъекции вместо венозной применения, потенциальные ограничения хронических моделей миграции клеток и / или системной доставки клеток - например, гибели клеток из-за затягивания в отдаленных органах - можно избежать с другой. С другой стороны, острый хирургический ткань травма может вызвать определенную степень активации ткани непосредственно. Таким образом, атравматичность хирургический препарат является обязательным и стабильной микроциркуляции условия следующие кремастер препарат мышцы должны быть достигнуты в воспроизводимом моды предварительного начиная с экспериментальными группами.Наличие обширного накопления лейкоцитов в пределах посткапиллярных венул и значительное утечки флуоресцентным красителем на окружающие ткани в начале прижизненной микроскопии записей в контрольных животных показывают большую травму тканей хирургическое.
Тем не менее, даже тогда, когда уделяя пристальное подгометоды рацион, результаты, полученные из разных исследователей, не обязательно полностью сопоставимы из-за слегка отличающихся активации базовой ткани. Именно поэтому последующие эксперименты должны быть выполнены одним и тем же следователем, когда это возможно.
Предназначен для анализа и количественной оценки начальных этапах набора стволовых клеток в тканях-мишенях, нынешняя модель не позволяет заявления по определенной стволовых клеток органа-приживления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все эксперименты на животных, проведенные для этой рукописи были одобрены местным уходу и использованию животных комитета.
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 | |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 | |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available | |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available | |
| Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home? Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
