Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi en robust metod för fraktionering av växtplasmamembran in i tvättmedelsresistenta och detergent lösliga membran baserad på en blandning av omärkt och in vivo fullt 15 N märkta Arabidopsis thaliana cellkulturer. Förfarandet används för jämförande proteomik studier för att förstå signaleringsprocesser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasma membranmikrodomäner är funktioner som bygger på de fysikaliska egenskaperna hos lipid-och sterol miljö och har särskilda roller i signalprocesser. Extrahera sterol berikad membranmikrodomäner från växtceller för proteomic analys är en svår uppgift, huvudsakligen på grund av flera framställningssteg och källor för föroreningar från andra cellulära utrymmen. Plasmamembranet utgör endast ca 5-20% av alla membranen i en växtcell, och därmed isoleringen av högt renat plasmamembranfraktionen är utmanande. En ofta använd metod inbegriper vattenhaltiga två-fasuppdelning i polyetylenglykol och dextran, vilket ger plasmamembranblåsor med en renhet av 95% 1. Sterol-rik membranmikrodomäner inom plasmamembranet är olösliga vid behandling med kall nonjoniska detergenter vid alkaliskt pH. Detta diskmedel beständiga membranfraktionen kan separeras från bulkplasmamembranet genom ultracentrifugering i såsomucrose gradient 2. Därefter kan proteinerna extraheras från lågdensitets bandet hos sackarosgradient av metanol / kloroform-utfällning. Extraherade protein kommer då att trypsin smälta, avsaltat och slutligen analyseras med LC-MS/MS. Vår utvinning protokoll för sterol rika mikroområden är optimerad för att förbereda rena tvättmedel resistenta membranfraktioner från Arabidopsis thaliana cellkulturer.

Vi använder fullständig metabolisk märkning av Arabidopsis thaliana fjädring cellkulturer med K 15 NO 3 som enda kvävekälla för kvantitativa jämförande proteomik studier efter biologisk behandling av ränta 3. Genom att blanda lika förhållanden mellan märkta och omärkta cellkulturer för gemensam utvinning protein påverkan av beredningssteg på slut kvantitativt resultat hålls på ett minimum. Även materialförlust under extraktion kommer att påverka både kontroll-och behandlingsprover på samma sätt, end därför förhållandet mellan ljus och heave peptid kommer att förbli konstant. I den föreslagna metoden antingen märkt eller omärkt cellodling genomgår en biologisk behandling, medan den andra fungerar som kontroll 4.

Introduction

År 1972, Jonathan Singer och Garth Nicolson föreslog vätskan mosaikmodellen en struktur modell av cellmembran, som ersätter protein-lipid-protein sandwich modell som allmänt accepterades i början av 1960. Singer och Nicolson postulerade att det biologiska membranet kan anses vara en tvådimensionell vätska, där alla lipid-och proteinmolekyler diffunderar fritt och lätt 5. Efter den tid, strukturmodell av plasmamembranet och kunskap om membranets sammansättning blev ännu mer komplicerad. Speciellt inom plasmamembranet, kan observeras strukturer såsom proteinkomplex och lipid / sterol baserade strukturellt oordnade mikroområden. I konstgjorda modell membran 6,7, kan steroler och sfingolipider sidled segregera från andra lipid arter att bilda regioner med förändrade fysiska egenskaper. Denna segregering inom cellmembranet orsakas främst av de själv associera egenskaper mellan steroler och högt saturated kolvätekedjor av phopsho-och sfingolipider 8. Särskilt de styva sterol ringarna gynnar interaktioner med styvare och rakare mättade fettarter och dessa interaktioner tvinga grann kolvätekedjor i flera förlängda konformationer, ökar membrantjocklek och hårdhet.

En av de vanligaste observerade egenskaperna hos sterol anrikad membranmikrodomäner var deras olöslighet vid behandling med icke-joniska detergenter såsom Triton X-100 eller Brij 35. Dessa fraktioner tros vara identisk med membranmikrodomäner och kallades rengöringsmedel resistenta membran (DRM) baserat på deras biokemiska beredningsmetod 2. Användningen av nonjoniska tvättmedel under DRM utvinning fått en del kritik som den biokemiska DRM preparatet inte direkt motsvarar någon specifik membranutrymmet i den levande cellen 9. Särskilt tvättmedels till proteinhalt verkar avgörande i sådana preparat, enolika detergenter s, såväl som olika mängder tvättmedel kan ge olika sammansättning av tvättmedelsresistent membranfraktionen 10. Men det finns bevis för att vissa proteinvarianter specifikt förknippar med dessa cellulära sterol rika membrandomäner, och att dessa proteiner är väl anrikas i biokemiska preparat av tvättmedel resistent membranfraktioner 11. Kärnan av proteiner som finns i växt DRM fraktion, och för vilka det finns i DRM var sterol beroende, var särskilt GPI-förankrade proteiner, såsom fasciclin liknande arabinogalactan proteiner (FLA) och medlemmar i SKU proteinfamiljen. Även vissa signalproteiner, såsom receptorliknande kinaser eller fosfolipaser hittades 11. Dessa resultat överensstämmer med många proteomik studier på däggdjursmembranmikrodomäner 12,13. Även i växter det finns allt fler bevis för rollen av membranmikrodomäner i samband med stress 14 -16.

Protokollet som beskrivs här ger en robust metod för fraktionering av plasmamembranmikrodomäner och i synnerhet använder ett protein till tvättmedel koncentration som tillåter oss att skildra stress förändringar av sterol rika membranutrymmet 4,11,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FÖRFARANDE

Vanliga reagens och buffertar som används vid utvinning protokollet:

  1. JPL medium för Arabidopsis thaliana suspensionscellkulturer
    • 3 ^ M H 3 BO 3
    • 3 pM MnSO 4 x H2O
    • 1,1 pM ZnSO 4 x 7 H2O
    • 0,15 | iM KJ
    • 0,03 ^ M Na 2 MoO 4 x 2 H2O
    • 3 nM CoCl 2 x 6 H2O
    • 3 nM CUSO4 x 5 H2O
    • 0,9 mM CaCl2 x 2 H2O
    • 0,5 mM MgSO 4 x 7 H2O
    • 0,5 pM FeSO 4 x 7 H2O
    • 0,5 pM Na2EDTA x 2 H2O
    • 0.12 ^ M tiamin HCl
    • 0.16 ^ M nikotinsyra
    • 0,097 ^ M pyridoxin HCl
    • 0,107 pM NAA
    • 0,375 mM KH 2 PO 4
    • 0,061 mM NaH2 PO 4 x 2 H2O
    • 0,039 mM Na 2 HPO 4
    • 0,027 mM glycin
    • 0,56 mM myoinositol
    • 1,5% sackaros
    • 10 mM K 14 NO 3 eller 10 mM K 15 NO 3

OBSERVERA: pH för JPL mediet bör justeras till 5,7 med KOH. Mediet måste steriliseras genom filtrering eller autoklavering före användning.

  1. Buffert H
    • 100 mM HEPES-KOH (pH 7,5)
    • 250 mM sackaros
    • 10% (vikt / volym) glycerol
    • 5 mM EDTA
    • 5 mM askorbinsyra
    • 0,6% (vikt / volym) PVP K-25 eller K-30
    • 5 mM DTT (lägg färska)
    • 1 mM PMSF (lägg färska)
    • proteas och fosfatasinhibitorer (lägg färska)
      • 50 mM NaF
      • 1 mM Na-3 VO 4
      • 1 mM benzamidin
      • 0,3 uM mikrocystin
      • 4 | iM leupeptin
      • proteasinhibitorcocktail
  2. Buffert R
    • 5 mM kaliumfosfat
    • 0,33 M sackaros
    • 3 mM KCl
    • 0,1 mM EDTA
    • 1 mM DTT (lägg färska)
  3. Buffert TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
    • 150 mM NaCl
    • 5 mM EDTA
  4. Två-fas-system (6 g-systemet är lämpligt för upp till 15 g av provet färskvikt) beredningsmetod
    I 15 ml Falcon rör blanda ingredienser som anges nedan och blanda väl:
    • 20% (vikt / vikt) dextran T500 - 2,6 g
    • 40% (vikt / vikt) poly (etylenglykol) (PEG 3350) - 1,3 g
    • sackaros - 0,678 g
    • 0,2 M kaliumfosfat, pH 7,8 till 0,15 ml
    • 2 M KCl - 0,014 ml
    • tillsätt vatten tills den totala massan av tvåfassystemet är 6 gram.
  5. Sackarosestrar lösningar i TNE-buffert
    • 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
  6. Reagenser för trypsin matsmältning
    • UTU: 6 M urea, 2 M tiourea (pH 8,0 med 10 mM Tris-HCl) Buffert Reduction (1 mikrogram / l DTT i vatten, 6,5 mM)
    • Alkylering buffert (5 mikrogram / l jodoacetamid i vatten, 27 mM)
    • LysC Endopeptidase (0,5 mikrogram / l)
    • Trypsin, modifierat sekvense grade (0,4 | ig / | il)
  7. Reagens för peptid avsaltning över C 18
    • resuspension lösning: 2% trifluorättiksyra (TFA), 5% acetonitril i vatten
    • lösning A: 0,5% ättiksyra
    • lösning B: 80% acetonitril, 0,5% ättiksyra
  8. Reagenser för fosfopeptid anrikning
    • Lösning A: 0,1% TFA, 5% acetonitril
    • Lösning B: 0,1% TFA, 80% acetonitril
    • TiO 2 10 ^ m
    • Ammoniak (lager 25% lösning)
    • Piperidin (lager 100%)

PROTOKOLL

1. Metabolisk märkning av Arabidopsis thaliana cellsuspensionen Kulturer

  1. Väx Arabidopsis Col-0-cellsuspensionskulturer härledda från bladen 17 med full 14 N-JPL-medium (18; se "vanliga reagens och buffertar" nedan) och en uppsättning av kulturer i 15 N-JPL mediet i steril kolv vid konstant ljus skick vid 80 till 100 | imol / m 2 s, 23 ° C, under konstant skakning vid 120 rpm.
  2. För att bibehålla cellkulturerna, ympa 400 ml färskt JPL-medium med 40 ml av en sju dagar gammal cellkultur i en L-kolvar.
  3. Skördande av cellkulturer sker via vakuumsugning genom en bred glastratt med ett nät av rostfritt stål. Celler samlas på maskplattan och i tratten och kan lätt uppsamlas därifrån. Celler rekommenderas att frysas vid -80 ° C eller i flytande kväve innan slipning.

OBS: För 15 N metaboliskt märkta cellkulturer använder K 15 NO 3 som den enda källan till kväve under minst två passager över två veckor 19. I erfarenriments för jämförande proteomik, använd en 15 N märkt cellkultur och även behålla en omärkt kultur i normalt medium. Biologisk behandling kommer därefter att appliceras på antingen märkt eller omärkt kultur, medan den andra tjänar som kontroll (Figur 1). För proteinberedningen kommer båda kulturerna kombineras 20. Vid planering av experimentuppställning rekommenderar vi överväger en ömsesidig märkning inställning 4, där samma behandling appliceras en gång på de 15 N-märkta celler och en gång för att de omärkta celler och respektive omärkta eller 15 N-märkta celler fungerar som kontroller. I detta fall behövs de dubbla mängder av cellkulturer.

2. Plasma Membrane Rening

NOTERA: Alla ytterligare steg utförs i det kalla rummet och / eller på is, såvida det inte noteras på annat sätt.

  1. Homogenisera cellerna från ca 1 L av 7 dagar gamla cellsuspensionsodlingar i flytande kväve.Materialet kan lagras vid -80 ° C tills vidare användning.
  2. Blanda samma mängder av märkta och omärkta frysta cellkulturer baserade på färskvikt i en bägare och tillsätt 2 volymer buffert H omedelbart. Vid membranmikrodomän beredningen föreslås att använda minst 7 g färskvikt av både märkta och omärkta celler.
  3. Placera bägaren på en skakapparat och skaka tills materialet är smält och lösningen är flytande och utan iskristaller.
  4. Filtrera homogenatet genom ett skikt av Miracloth i 50 ml centrifugrör.
  5. Balans på prover med buffert H och centrifugera vid 10.000 x g under 8 min.
  6. Ladda supernatanten i förväg kylda ultra-centrifugrör (t.ex. för rotor Beckman Coulter SW31Ti), med volym på ca 32 ml
  7. Balans på prover med buffert H och pelletera mikrosomer genom centrifugering vid 100.000 xg vid 4 ° C under 30 min med användning av Beckman SW32Ti rötor.
  8. Avlägsna supernatanten efter centrifugering.

    OBS: Ovanvätskan innehåller lösliga proteiner. En liten mängd av denna fraktion kan sparas för ytterligare proteinutfällning och efterföljande analys även av lösliga proteiner.

    1. Suspendera membranpellet av varje prov i respektive mängd av buffert R och laddar in i den övre delen av U1 tvåfassystem (Figur 2). Om 6 g två-fas system används, ladda exakt 2 g suspenderad membran pellet.

    OBSERVERA: Den slutliga volymen av buffert R beror på storleken av den två-fassystem som kommer att användas (~ 1,6 ml buffert R behövs vid användning av 6 g-system). Det rekommenderas att använda mindre buffert för återsuspension så ren buffert kan tillsättas på två-fassystem för att erhålla den efterfrågade vikt, snarare än att använda för mycket buffert för solubilisering och inte kunna ladda hela provet på två-fassystem.

    1. Fyll på samma volym ren buffert R som används för the prov resuspension på U2.
    2. Långsamt blanda U1 och U2 rören genom att invertera dem 30x (cirka en inversion / sek).

    OBS: Använd inte kraftigt skaka två-fas system. Det kan leda till en brist på separation av faserna i ultracentrifugering steg.

    1. Centrifugera proverna vid 1500 xg vid 4 ° C under 10 min.
    2. Avlägsna supernatanten efter centrifugering.
    3. Överför den övre fasen från U1 till U2 och upprepa centrifugering vid 1500 xg vid 4 ° C under 10 min.
    4. Flytta den övre fasen från U2 i SW41Ti ultracentrifugrör och späda ut det med fem volymer buffert R och blanda väl.

    OBS: Den slutliga övre fasen kan behöva delas upp i separata ultracentrifugrör innan den kan spädas fem gånger.

    1. Centrifugera proverna vid 200.000 xg vid 4 ° C under en timme med användning av SW41Ti rötor.
    2. Resuspendera membran pelleten i small mängd TNE buffert (vanligtvis 200 l av buffert används) för isolering av tvättmedel resistenta membran.

    OBS: En liten mängd av denna fraktion kan sparas för analys av ofraktionerat plasmamembranet.

    OBS: Plasmamembranfraktionen kan lagras vid 4 ° C över natten innan fraktione i tvättmedel resistenta membran och tvättmedel lösliga fraktioner.

    3. Tvättmedel Resistent Membran Förberedelse

    1. Kontrollera koncentrationen av plasmamembranfraktionen genom Bradford-analysen.
    2. Lägg Triton X-100 till plasmamembranet fraktionen. Den slutliga koncentrationen av detergent bör stanna mellan 0,5-1%. Tvättmedlet för protein vikt i förhållande till vikt bör stanna mellan 13-15.
    3. Skaka proverna vid ca 100 rpm vid 4 ° C under 30 min.
    4. Lägg tre volymer av 2,4 M sackaros till en volym av det behandlade plasmamembranet för att erhålla 1,8 M slutlig koncentration av sackaros. </ Li>
    5. Förbered sackarosgradient i SW41Ti ultracentrifugrör genom laddning av de respektive sackaroslösningar på toppen av 1,8 M-fraktionen såsom illustreras i figur 3.
    6. Centrifugera proverna vid 250.000 xg vid 4 ° C under 18 h med användning av Beckman SW41Ti rötor.
    7. Ta försiktigt bort ultracentrifugrör från rotorn för att undvika störningar av låg densitet band som kan vara synlig som en mjölkig ring vid gränsytan mellan 0,15 M/1.4 M sackaros. Ibland ingenting syns men fraktionen fortfarande innehåller tvättmedelsresistent proteinfraktionen.
    8. Avlägsna fraktion av 0,75 ml volym från toppen av gradienten. Fraktioner 2 och 3 som täcker volym av omkring 1,5 ml ovanför interfas ringen och 0,5 ml nedan visar tvättmedelsresistent membranfraktionen. Samla dessa fraktioner i 15 ml Falcon-rör. Fraktionerna 9 och 10 innehåller tvättmedels lösliga membranfraktionen och kan också samlas in för jämförelse. För vidare analys, pool fractjoner 2 och 3 samt fraktioner 9 och 10.

    4. Utvinning av proteiner från tvättmedel Resistent Fraktion av metanol / kloroform

    NOTERA: Alla steg utförs vid rumstemperatur.

    1. Lägg 4 volymer av metanol till de uppsamlade fraktionerna och vortex ordentligt.
    2. Tillsätt 1 volym kloroform, virvel ordentligt.
    3. Lägg 3 volymer vatten, vortexa grundligt.
    4. Centrifugera proverna vid 2000 xg under 5 minuter med hjälp av en bordscentrifug (t.ex. Eppendorf 5417R).
    5. Avlägsna vattenfasen ovan proteinskiktet i interfas.
    6. Lägg 3 delar metanol, virvel ordentligt.
    7. Centrifugera proverna vid 4000 xg under 10 min.
    8. Avlägsna supernatanten och torka pelleten. Den torkade pellets är klar för in-lösning matsmältningen.

    5. I lösning Trypsin Digestion

    OBS: I denna procedur alla steg sker vidrumstemperatur för att minska oönskade derivatisering av aminosyrasidokedjor av denatureringsmedel.

    1. Lös upp provet i liten volym av 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Använd så låg volym som möjligt med provet (vanligtvis ca 40 ^ il).
    2. Spin prover solubiliserade i UTU vid 5000 x g i en bordscentrifug (t ex Eppendorf 5417R) under 10 min för att pelletisera varje olösligt material.
    3. PH hos den slutliga lösningen skall vara nära 8,0 för optimal trypsindigerering. Kontrollera med pH-remsor.
    4. Lägg till en fil buffert rabatt på varje 50 ^ g av proteinprovet och inkubera 30 minuter vid rumstemperatur.

    OBS: Endast en grov uppskattning av proteinhalten är nödvändig. När provmängd är begränsad är det bättre att offra noggrannhet snarare än att slösa prov på en proteinanalys.

    1. Lägg ett pl av alkylering buffert för varje 50 | j, g proteinprov och inkubera 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
    2. Lägg 0,5 pl av LysC per 50 | ig proteinprov och inkubera under tre timmar vid rumstemperatur med konstant skakning vid 700 rpm. Vid behov kan den digere även utföras över natten. Dock är förlängd tid vid varma temperaturer rekommenderas inte eftersom det kan öka peptid förlust på grund av adsorption till plaströr material under vattenbaserade pH 8 förhållanden.
    3. Späd provet med fyra volymer 10 mM Tris-HCl, pH 8.

    Anmärkning: Detta steg är absolut nödvändigt för att späda koncentrationen urinämne såsom trypsin är mycket känsligt för hög salthalt.

    1. Lägg ett pl av trypsin per 50 | ig proteinprov och inkubera över natten vid rumstemperatur med konstant skakning vid 700 rpm.
    2. Surgör proverna till 0,2% TFA slutlig koncentration för att nå pH 2 (lägg till ungefär 1/10 volym av 2% trifluoro-ättiksyra).

    NOTERA: Prov kan förvaras vid - 20 ° C tills de användes ytterligare, men det är bättre att lagradem på StageTips vid 4 ° C om det är för en kort tid (en vecka) eller lagra dem efter StageTips avsaltning.

    6. Tillverkning av C-18-StageTips

    1. Placera en Empore Disk C18 på en plan, ren yta, t.ex. en disponibel plast petriskål.
    2. Stansa ut en liten skiva med hjälp av en trubbig spets injektionsnål med en diameter på 1,5 mm. Skivan fastnar i nålen och kan överföras in i en pipettspets.
    3. Skjut skivan ut genom injektionsnålen och fixera den i avsmalningen av en pipettspets med en bit av kvarts-eller slang montering på insidan av nålen.

    Anmärkning StageTips kan lagras torrt vid rumstemperatur 21.

    7. Användning av C 18-StageTips för peptid Avsaltning och koncentration

    1. Behandla en C 18-StageTip genom att 50 l av lösning B på den förberedda StageTip. Snurra spetsen i centrifug vid 2000 rpm under 2 min i en bänk centrifuge (exempelvis Eppendorf 5417R).

    OBS: Använd adaptrar att snurra StageTips i en Eppendorf centrifug, kommer vätska att samlas i en 2 ml reaktionsröret. För storskaliga preparat, kan scen tips också placeras i en spets rack med 96 av de 200 il tips och vätska kan samlas i en mikrotiterplatta.

    OBS: Använd aldrig högre hastigheter än 3.000 xg i en bordscentrifug (t.ex. Eppendorf 5417R) på grund av risken för att snurra ut C 18 skivan från spetsen.

    1. Jämvikta StageTip med 100 pl lösning A. Spin spetsen i centrifugen vid 5000 xg i en bordscentrifug (t.ex. Eppendorf 5417R).
    2. Upprepa steg 2.
    3. Ladda provet på disk genom att försiktigt pipettera provet i pipettspetsen med skivan inuti.

    OBS: En skiva kan binda ca. 100 | j, g protein.

    1. Snurra tipsen i centrifuge tills hela volymen av provet passerar genom C-18 skivan.
    2. Tvätta StageTips två gånger med 100 l av lösning A. Spin tipsen i centrifugen.

    OBSERVERA: De tvättade och loaded StageTips kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka.

    1. Eluera provet med 40 l av lösning B. Samla upp eluatet i en färsk 1,5 ml reaktionsröret.
    2. Koncentrera provet i speed vac. Under idealiska förhållanden, stoppa uttorkning processen eftersom det är bara om 1 eller 2 l vätska kvar.

    NOT: torkade proverna kan förvaras i -80 ° C i flera år.

    1. Lägg till en slutlig volym på 9 l av resuspension lösning på provet och för över den till mikrotiterplatta för massanalys spec.

    OBSERVERA: Den slutliga volymen av den använda resuspensionsbuffert är beroende av behoven hos försöksledaren och känsligheten hos masspektrometernanvändas.

    8. Alternativ Protokoll för fosfopeptid Anrikning

    OBS! Fosfopeptid anrikning, proteinutvinning i steg 2 måste göras i närvaro av fosfatasinhibitorer.

    OBS: Exakt proteinkoncentration inte behöver fastställas för följande steg. Det räcker med att ha en grov uppskattning av proteininnehållet för att undvika onödiga provförlust

    1. Förbered C 8-StageTips (följer samma protokoll för framställning av C 18-StageTips vid steg 6).
    2. Överför 1 mg TiO 2-pärlor till början av beredda C 8-StageTips (användning 1 mg TiO 2 per 100 ^ g protein).
    3. Jämvikta TiO 2 spetsar med 100 ^ il lösning C, centrifugering vid 2000 x g under 5 min i en bordscentrifug (t ex Eppendorf 5417R).
    4. Blanda 100 pg av smälta och avsaltat peptider från steg 7,7 (det bör vara i 100 pl lösningB) med 100 pl av lösning A.
    5. Load blandade provet på den jämviktade TiO 2 kolumner, centrifugering vid 1000 x g, 5 min.
    6. Samla upp genomflödet och ladda den på samma spets igen (hålla flödet genom efter andra passagen).
    7. Tvätta spets med 100 | il av lösning A, centrifugering vid 2000 x g, 5 min i en bordscentrifug (t ex Eppendorf 5417R).
    8. Eluera provet med 50 pl 5% ammoniak.
    9. Eluera provet med 50 pl 5% piperidin (båda eluat kan kombineras).
    10. Omedelbart surgöra provet med användning av 50 pl av 20% fosforsyra. pH bör ligga på runt 2.

    OBS: Spara TiO 2 tips och hämta pulvret. Det kan tvättas med lösning B och användas igen för en eller två omgångar.

    1. Återigen avsalta försurade prover över C 18 tips (se steg 8).

    9. LC-MS/MS Analys av peptidblandningar

    1. Resuspendera avsaltade fosfopeptides i resuspensionsbuffert.
    2. Ladda suspenderas provet på LC-MS/MS valfrihetssystem och förvärva spektra i databeroende läge på förslag upplösning på 60.000 fulla bredd vid halva maximum.

    OBS: För optimal fragmentering, bör antingen neutral-förlust skanning tillämpas 22, eller om det finns det flerstegs aktivering 23. Om ETD finns det gör att fragmentering peptid ryggraden utan förlust av fosforsyra 24.

    OBS: Peak listor från rådata måste utvinnas och lämnas till identifiering databas samt för kvantifiering. Här beskriver vi inställningar för att använda Mascot och MSQuant, som arbetar för rå datafiler från LTQ, LTQ-Orbitrap och LTQ-FT instrument (Thermo Scientific).

    1. Utdrag topp listan med DTAsupercharge inom "Helper" Meny i MSQuant. Använd standardinställningarna.
    2. Skicka in resulterar topplistfilen till Mascot sökmotor. Critical inställningar: moderjon mass tolerans 10 ppm, MS / MS mass tolerans 0,5 Da. Fasta ändringar: carbamidomethylation av cysteiner, variabla modifieringar: oxidation av metionin, fosforylering av serin, treonin, tyrosin. Kvantifiering metod: 15 N metabolisk märkning.
    3. Spara Mascot resultat som webbsida fil.
    4. Ladda Mascot resultatfil och raw-fil i MSQuant. Välj alla proteiner av intresse och köra "Automatisk kvantifiering". Programmet kommer att läsa fullscan-spektra från råfilen och göra maximal integration för märkta och omärkta partners i varje peptid.
    5. Exportera kvantifiering resultat till ett kalkylprogram eller till en tabbavgränsad textfil. Uppgifterna kan sedan lämnas till ytterligare statistisk analys i Excel eller med hjälp av ytterligare programpaket såsom Statquant 25 eller Cracker 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med den presenterade protokollet använder metaboliskt märkta Arabidopsis cellkulturer är det möjligt att isolera plasmamembran från växtvävnad (steg2, figurerna 2 och 4), och anrika för detergent-resistenta membranfraktioner inom plasmamembranet (steg 3, figurerna 3 och 5). Därefter tillåter protokollet extraktion av proteiner från dessa tvättmedelsresistent membranfraktioner (steg 4) och digerering av proteinet för jämförande proteomik analys (steg 5). Slutligen är den valfria anrikning av fosfopeptider (steg 8) särskilt intressant att studera cellulära signalprocesser. Det sista steget är sedan kvantitativ analys av data (steg 9, fig. 6) protein abundance kvoterna i membranfraktioner från märkt och omärkt cellodling.

Typiska resultat efter blandning av 2-fas-system (steg 2) och efterföljande centrifugering är ett klart färgat övre fas och engrön färgade lägre fas (figur 2). Plasma membranvesiklar preferentiellt associera med den övre PEG-fasen, medan membranvesiklar från gröna kloroplaster och andra inre membran är inkorporerade in i den undre dextran fasen. Om inte kan observeras färgseparation, har steg 2 inte genomförs på rätt sätt och plasmamembran kan vara kontaminerad med betydande mängder av inre membran. Anrikning av plasmamembranproteiner kan visas genom proteomik analys av små portioner av plasmamembranfraktioner och proteiner i den undre fasen av tvåfassystemet. Den nedre fasen innehåller de inre membran av cellen. Till exempel, i synnerhet typiska kända plasmamembranproteiner, såsom receptorkinasproteiner uppvisade hög förekomst i plasmamembranfraktion (PM) och låg förekomst i den undre fasen fraktionen (Figur 4A) innehållande de inre membran (IM). I sin tur, kända proteiner i endoplasmatiska retiklet visar högöverflöd i innermembranfraktionen och observerades inte i plasmamembranfraktionen (Figur 4B).

Den efterföljande berikning av detergent-resistenta membranfraktioner (steg 3) kommer i idealiska fall resultera i bildning av en mjölkaktig ring av låg densitet membranvesiklar på ungefär 1/5 av den röret höjd (Figur 3). Om justeringen av Triton X-100 koncentrationer eller tvättmedlet till proteinförhållande (steg 3,2) är optimal för separation i tvättmedelsresistent och rengöringsmedel lösliga fraktioner, kan observeras ytterligare ringar i nedre delen av gradienten och det kommer också att vara membran klumpar i lågdensitets-bandet. I dessa fall är tvättmedel till proteinförhållande eller total tvättmedels annat belopp än den kritiska koncentrationen nödvändig micelle för reproducerbar separation av de två membrandomänfraktioner. Med hjälp av den slutliga koncentrationen tvättmedel och rengöringsmedel till proteinförhållande som beskrivs här, Enrichment av typiska mikrodomän proteiner, såsom remorin (AT3G61260) 27 kunde bekräftas genom en jämförande masspektrometrisk analys av DRM-fraktion, tvättmedel fraktion (steg 3,8) och ofraktionerat plasmamembranet och inre membran. Högsta överflöd av remorin protein påträffades i DRM fraktioner som förväntat (figur 6A). Proteiner som inte finns i membranmikroområdena, till exempel ABC-transportör AT1G59870 (Figur 6B), inte visar en ökad förekomst i DRM-fraktionen. Också typiska föroreningar, till exempel en mitokondrieprotein (AT2G07707) från ATPas F0 komplexet (figur 6C) och ribosomalt protein (At1G001100) från 60S ribosomen (figur 6D) visar inte en berikad överflöd i DRM-fraktionen, även om minimala mängder kan fortfarande identifieras.

Efter masspektrometrisk analys, protein abundances förhållanden av proteinfosforylering status i plasmamembranfraktioner av märkta och omärkta cellkulturer kan kvantitativt särskiljas (figur 6). Typiska resultat från MSQuant ( msquant.alwaysdata.net ) kvantifiering fönster ska visa en jon intensitetsförhållande på 12:59 för de flesta av de identifierade peptider (Figur 6A). Dessa peptider med jon intensitetskvoten markant avviker från 1:1 betraktas som differential reglerade mellan märkta och omärkta cellodling, och är kandidater för att matcha till proteiner som påverkas av den behandling som (figur 6C). En god kvalitetskontroll av framgångsrika metabolisk märkning är sameluering både märkta och omärkta peptidversioner som en enda topp i nano-HPLC-separation (steg 9) som visas i figur 6B och D.

Figur 1 Figur 1. Metabolisk märkning experimentell strategi. Schematisk bild av två varianter av experimentell design vid användning helt metabolisk märkta och omärkta A. thaliana cellkulturer. Försöksledaren kan antingen välja att använda 14 N-celler (omärkt) som en kontroll och 15 N-celler (metaboliskt märkta) att undergå biologisk behandling eller vice versa. I ett ömsesidigt experimentell design båda varianterna genomförs parallellt.

Figur 2
Figur 2. Arbetsflöde för separation av växt membranvesiklar på en vattenhaltig två-fas-system baserat på polyetylenglykol (PEG) och dextran. Plasma membranvesiklar separeras i övre PEG-fasen medan kloroplast och andra invändiga membranen associeras med BottOM dextran fas efter centrifugering. Med extra tvättning av övre fasen kan uppnås bättre rening, men även materialförlusten ökar.

Figur 3
Figur 3. Anrikning av låg densitet membranfraktioner. Representation av sackaros lutning för anrikning av låg densitet tvättmedel resistent membranfraktioner. Den förväntade platsen efter över natten centrifugering av låg densitet membranvesikel bandet indikeras.

Figur 4
Figur 4. Anrikning av plasmamembranproteiner efter rening i tvåfassystem. Normaliseradprotein jonintensiteter för proteiner som uppmätts i plasmamembranet (PM) och inre membran (IM) fraktion. (A) Typiska kända beståndsdelar i plasmamembranet visar mycket högre överflöd i PM fraktionen än i IM fraktion. (B) Natural kända komponenter i interna membran visar motsatt beteende. För normalisering var jon intensitets summor för varje protein uttryckt som en bråkdel av den totala jon intensitet per prov och därefter i genomsnitt mellan replikat. Fraktion av totala jonintensiteter ades uttrycktes sedan i förhållande till medelvärdet mellan de två behandlingarna. Felstaplar representerar standardavvikelsen för tre beredningar från oberoende odlade cellkulturer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5 Figur 5. . Överflöd av standardproteinmarkörer inom uppmätta fraktionerna Tomter representerar fördelningen av normaliserade protein jonintensiteter av utvalda proteinmarkörer till särskilda subcellulära fack (DRM - sterol rika mikroområden, PM - plasmamembran, IM - inre membran, SP - lösliga proteiner). Överflöd mönster (A) remorin som markör för sterol rika membranmikrodomäner, (B) ABC-typ transportör familj protein som representant för en icke sterol-beroende protein, (C) subenheten av mitokondrie F0 komplex, (D) 60S subenheten av ribosomer som ett typiskt samtidig rening förorening. För normalisering var jon intensitets summor för varje protein uttryckt som en bråkdel av den totala jon intensitet per prov och därefter i genomsnitt mellan replikat. Fraktion av totala jonintensiteter ades uttrycktes sedan i förhållande till medelvärdet mellan de två Treatments. Felstaplar representerar standardavvikelsen för tre beredningar från oberoende odlade cellkulturer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6
Figur 6. Förväntat resultat av kvantitativ protein masspektrometri. Skärmdump från MSQuant av förväntade 01:01 jon intensitetsförhållandet av en peptid från en 01:01 blandning av proteinextrakt från märkta och omärkta Arabidopsis celler. (A) Full scan spektrum av peptid DNNLLGK klart separera märkt (höger topp) och omärkt (vänster topp) version av peptiderna på m / z-axeln. Den monoisotopisk massa och den första isotop anges med blå märken. (B) Märkt (blå) end omärkta (röd) versioner av peptiden co-elueras som en enda topp under nano-HPLC-kromatografi. (C) Fullständig sökning spektrum av en peptid med jon intensitetsförhållandet 1:5 som kandidat för ett differentiellt reglerad protein. (D ) Även proteiner med förhållanden som skiljer sig från 01:01 co-elueras i omvänd fas-kromatografi. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras i detta dokument innehåller många steg och alla är avgörande för att få rena och representativa fraktionering av anläggningen plasmamembranet i tvättmedel resistenta membran och tvättmedel lösliga fraktioner. Därför är det viktigt att följa varje steg enligt anvisningarna.

Behandling av plasmamembranet fraktion med icke-jonisk detergent (steg 3.2) har den starkaste påverkan på kvaliteten på membranmikrodomän fraktionering. För att erhålla reproducerbara resultat mellan olika preparat, och kan jämföra olika prov från samma experiment, är det mycket viktigt att exakt utvärdera koncentrationen av proteiner i plasmamembranet och att applicera rengöringsmedel alltid i samma förhållande med avseende på proteinhalt och alltid med samma slutkoncentration. Praktiskt innebär det att det ibland är nödvändigt att späda prover med hög proteinkoncentration eller att använda olika koncentrationslagerTriton X-100.

I biokemiska studier, nyligen har det funnits en tendens bland forskare att använda ett tvättmedel-fri metod för isolering av membranmikrodomäner 28-30. Dessa metoder är baserade på en mekanisk sönderdelning av plasmamembranet genom skjuvning genom en mycket liten nål i analogi med den franska tryckcellen pressen. Dessa förfaranden med framgång tillämpas på däggdjurscellkulturer rika på membranmikrodomäner, men ansökan till cellväggen innehåller organismer (jäst, växtceller) har inte rapporterats. Använda kvantitativa proteomik tillsammans med sterol störande medel, såsom metyl-beta-cyklodextrin, visades det att de DRM fraktioner framställda från växt plasmamembranet innehåller proteiner som är markörer för membranmikroområden 11.

När det gäller de slutliga resultaten av masspektrometrisk kvantifiering, de typiska resultat som visas i figur 6 representerar den ideala situationen ivilken jon intensitet för majoriteten av märkta och omärkta peptider är nära identiska. Men i vissa fall kan observeras en viss grad av biologisk variation mellan uppsättningarna av märkta och omärkta cellkulturer. Således före biologisk behandling av antingen märkt eller omärkt cellodling utförs, analys av en blandning av märkta och omärkta kontrollceller, båda utan någon behandling, möjliggör identifiering av peptider med ett nyckeltal avvikande från ideal 00:59 situationer. Dessa proteiner med olika nyckeltal finns indikationer för biologisk variation. För att övervinna utmaningen att särskilja behandlingseffekter från biologisk variation, därför föreslår vi att använda den ömsesidiga märkning parade experiment 20. I den ömsesidiga experimentuppställning är båda varianterna av experimentet utförs som föreslås i figur 1 och stegen i protokollet följs enligt beskrivningen. Sedan, att jämföra de jon intensitetsförhållanden av proteins från båda av de reciproka experiment kan man särskilja om skillnaderna mellan jon intensitetsförhållanden beror på biologisk variation eller som en effekt av den applicerade behandlingen.

En annan metod för att ta itu med problemet att skilja mellan behandlingseffekter och biologisk variation är att använda en intern märkt standard som referens för alla behandlingar 31. I detta synsätt, är omärkt kontroll och omärkta celler som genomgår biologisk behandling blandas med samma mängd tunga märkta kontrollceller, som kommer från samma parti. Det gör att eliminera påverkan av biologisk variation på peptidförhållande, eftersom proteiner anses som betydande, om jon intensitetsförhållanden av 14 N-styrning / 15 N-kontroll och 14 N-behandling / 15 N-kontroll är betydligt annorlunda. Detta är möjligt, eftersom den märkta standarden är exakt samma i alla fallen.

En av drawbacks av förfarandet DRM anriknings beskrivs här är de co-rening av proteiner som kan identifieras i diskmedels resistent membranfraktionen. I listan över proteiner som identifierats från den låg densitet tvättmedelsresistent membranfraktionen kan vi regelbundet observera ett stort antal ribosomala proteiner. På grund av den relativt låga densiteten hos de ribosomala proteiner, de vandrar i samma fraktion som sterol beroende membranproteiner i sackarosgradient. Det visade utan tvivel att de ribosomproteiner uppenbart inte beståndsdelar av membranmikroområden 11. För att utesluta dessa och andra co-renande proteiner faktiskt inte förknippas med tvättmedel resistenta låg densitet membranfraktioner, föreslår vi att även analysera proteomik sammansättningen av de intracellulära membran (IM) som kan extraheras från den nedre dextran fasen från två- fas system och att jämföra överflöd förhållanden av förmodade föroreningar mellan det inre membranet och DRMfraktion (se exempel i fig 5). DRM-co renande proteiner bör ha liknande bestånd i båda fraktioner (IM och DRM).

Fraktionering av cellextrakt och membranmikroområden är en gemensam strategi för att minska komplexiteten i ett prov för proteomik analys 32. Därför är det protokoll som beskrivs här användbara för alla studier av signalering processer vid plasmamembranet av växtceller. Biologiska tillämpningar är att studera stressreaktioner samt patogena infektioner som alla i hög grad medföra förändringar i plasmamembranet sammansättning och modifiering av membranproteiner 14,15. Förutom att studera stressreaktioner, kan kvantifiering av protein bestånd i olika membranfraktioner stor hjälp anteckning av ännu okända proteiner 33 34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Författaren, Witold Szymanski, är en anställd vid Max Planck-institutet för molekylär växtfysiologi. Författaren är Waltraud Schulze en anställd vid universitetet i Hohenheim, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
  2. Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
  3. Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
  4. Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
  5. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  6. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
  7. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
  8. Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
  9. Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. (2011).
  10. Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
  11. Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
  12. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
  13. Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
  14. Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  15. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
  16. Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
  17. Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
  18. Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
  19. Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
  20. Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
  21. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
  22. Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
  23. Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
  24. Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
  25. van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
  26. Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
  27. Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
  28. Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
  29. Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
  30. Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
  31. Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).
  32. Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
  33. Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
  34. Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
  35. Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics