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Summary

L'aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico. Questo manoscritto illustra un facile da usare ex vivo modello per studiare carotidea fresco o placche coronariche. Il modello ex vivo permette la ricerca di sostanze potenziali sul milieu infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche umane ed i risultati possono essere analizzati con vari metodi.

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Erbel, C., Okuyucu, D., Akhavanpoor, M., Zhao, L., Wangler, S., Hakimi, M., Doesch, A., Dengler, T. J., Katus, H. A., Gleissner, C. A. A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology. J. Vis. Exp. (87), e50542, doi:10.3791/50542 (2014).

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Abstract

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica del sistema vascolare. Ci sono vari metodi per studiare il composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche. Modelli murini sono uno strumento importante per studiare i processi infiammatori in atherogenesis, ma questi modelli soffrono di differenze fenotipiche e funzionali tra il topo e il sistema immunitario umano. Gli esperimenti in vitro di cellule sono utilizzate per valutare specificamente cellulari variazioni a seconda del tipo causati da una sostanza di interesse, ma le variazioni coltura-dipendenti e l'incapacità di analizzare l'influenza delle molecole specifiche nel contesto del composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche limitano l'impatto dei risultati. Inoltre, i livelli di una molecola di interesse nel sangue umano misurazione aiuta a indagare ulteriormente la sua rilevanza clinica, ma questo rappresenta infiammazione sistemica e non locale. Pertanto, qui descriviamo un modello di coltura placca studiare lesione aterosclerotica biologia umanaex vivo. In breve, le placche freschi sono ottenuti da pazienti sottoposti ad endoarterectomia o bypass aorto-coronarico e conservati in mezzo RPMI sul ghiaccio fino al loro utilizzo. I campioni vengono tagliati in piccoli pezzi seguite da distribuzione casuale in una piastra a 48 pozzetti, contenente RPMI oltre ad una sostanza di interesse quali citochine o chemochine soli o in combinazione, per periodi di tempo definiti. Dopo l'incubazione, i pezzi di placca possono essere scossa congelati per l'isolamento di mRNA, inclusi in paraffina o ottobre per la colorazione immunoistochimica o distrutte e lisate per western blotting. Inoltre, le cellule possono essere isolate dalla placca per l'analisi di citometria a flusso. Inoltre, surnatanti possono essere raccolti per la misurazione delle proteine ​​mediante ELISA. In conclusione, la ex vivo modello presentato apre la possibilità di studiare ulteriormente infiammatoria biologia lesionale, che può provocare l'identificazione di meccanismi di malattia romanzo e bersagli terapeutici.

Introduction

Aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica è una delle principali cause di morte nei paesi industrializzati 1-2. Complicazioni di aterosclerosi, sindromi coronariche acute in particolare, sono stati collegati alla rottura delle lesioni vulnerabili, causando aterotrombosi e all'occlusione del vaso 3. L'immunità innata e adattativa sembra essere coinvolto in tutte le fasi atherogenesis 2,4-5. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento dell'infarto miocardico, un'efficace prevenzione di aterosclerosi e di eventi cardiovascolari avversi sono ancora irrisolti. Così, lo studio della biologia lesionale è essenziale per aumentare le nostre conoscenze sulla fisiopatologia di aterosclerosi e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.

In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio atherogenesis utilizzando modelli murini è accompanied da diverse limitazioni: (1) Di solito, i topi aterosclerotiche ricevono una dieta ricca di colesterolo. I livelli di colesterolo in questi modelli non possono essere confrontati con quelli in pazienti con elevati livelli sierici di colesterolo 6. (2) Ci sono differenze sostanziali tra il topo e il sistema immunitario umano; così FOXP3 è un marcatore specifico delle cellule T regolatorie murine, mentre l'espressione umana FOXP3 nelle cellule T umane non necessariamente conferisce un fenotipo regolamentazione 7. Inoltre, il paradigma Th1/Th2 come definito negli esseri umani non è completamente trasferibile a cellule T murine. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare monociti e macrofagi murini come F4/80 e marcatori di classica (M1) vs alternativa (M2) pattern di attivazione non esiste in cellule mieloidi umane 8. (4) L'espressione genica di monociti del sangue periferico murini e umani è stato trovato per essere sostanzialmente differente 9.

Pertanto, al fine di aumentare la comprensione delleprocessi infiammatori cronici in aterosclerosi umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i tessuti umani, sangue o cellule. Qui, descriviamo un modello di coltura tissutale placca umana, che permette il rilevamento di eventuali sostanze romanzo nel concetto di biologia lesionale infiammatoria umana.

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Protocol

1. Preparare medio come segue

  1. Cultura Media: RPMI.
  2. Aggiungere siero di vitello fetale al 10% (FCS).
  3. Aggiungere 100 U / ml di penicillina G, e 100 g / ml streptomicina.

2. Conservazione del cilindro placca fresco fino al momento dell'uso

  1. L'operazione di endoarteriectomia carotidea dei pazienti con o senza sintomi ischemici (ictus, attacco ischemico transitorio) con una significativa stenosi carotidea sarà fatto da chirurghi vascolari e coronarica endoarteriectomia durante bypass coronarico da cardiochirurghi. Carotidee / placche coronariche devono essere rimossi in blocco per preservare la struttura della placca come descritto in precedenza 5.
  2. Dopo placca luogo l'estirpazione il campione in una provetta mezzo pieno e memorizzarli sul ghiaccio (placca deve essere completamente coperto con terreno) fino al momento dell'uso.

3. Elaborazione Plaque

  1. Utilizzare un adeguato piatto di coltura cellulare (per esempio 60 mm)e aggiungere 5 ml di RPMI medie.
  2. Collocare il tessuto lapide nel piatto di coltura (placca deve essere completamente coperto di media).
  3. Tenere il tessuto placca attenzione i bordi del tessuto utilizzando pinze sterili.
  4. Tagliare i bordi del campione placca utilizzando un bisturi sterile.
  5. Dividere il tessuto placca a metà.
  6. Valutare la morfologia della lesione macroscopicamente (calcificato, lipidi ricchi, rotto, trombo, fibrosi).
  7. Analizzare l'esatta morfologia della placca dopo l'ex vivo esperimento di immunoistochimica. Utilizzare la classificazione AHA 10.
  8. Eliminare placche con calcificazione grave o fibrosi.
  9. Tagliare il tessuto targa in piccoli pezzi omologhi (3 x 3 x 3 mm).
  10. Shock congelare due pezzi di placca e conservarli in azoto liquido per i valori fondamentali della lesione fino al momento dell'uso.
  11. Preparare una piastra a 48 pozzetti.
  12. Aggiungere 500 microlitri terreno RPMI a ciascun pozzetto utilizzati per l'esperimento.
  13. Si prega di utilizzare unt almeno due pezzi di placca per ogni gruppo.
  14. Aggiungere la sostanza d'interesse (es. citochine e chemochine specifiche).
  15. Utilizzare pezzi di placca non stimolate come controlli.
  16. Casualmente piantare il numero appropriato di pezzi di placca nei pozzetti.
  17. Cultura pezzi di placca per i punti temporali indicati.
  18. Per l'esperimento di stimolazione dei tessuti targa con lipopolisaccaride (LPS)
    1. Utilizzare i seguenti punti di tempo: 3 ore, 8 ore e 24 hr.
    2. Utilizzare 2 parti placca per LPS e due per il gruppo non stimolato per ogni punto temporale, rispettivamente.
    3. Aggiungere 1 mg / ml di lipopolisaccaride.
  19. Durante l'incubazione, mantenere la piastra a 48 pozzetti a 37 ° C in aria umidificata contenente il 5% di CO 2.

4. Harvest Time pezzi di tessuto placca Dopo indicati

  1. Shock congelare i pezzi di placca per l'isolamento di mRNA e la sintesi del DNA (per informazioni dettagliate, vedere protoSezione col 5).
  2. Raccogliere il supernatante e conservato è a -20 ° C per l'analisi ELISA.
  3. Per western blotting, smash e lisare tessuto placca. Filtrare il lisato attraverso un 0,65 micron e 0,1 micron dispositivo di filtro centrifugo.
  4. Incorpora tessuto targa in tessuto-tec o paraffina per colorazioni immunoistochimica.

5. Estrazione di RNA da pezzi di placca in coltura

  1. Utilizzare un TissueLyser di omogeneizzazione.
  2. Isolare l'RNA utilizzando il kit (vedi tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  3. Determinare la quantità di RNA e la qualità del campione con spettrofotometro.
  4. Utilizzare il kit Boehringer cDNA per la trascrizione inversa in base alle istruzioni del produttore.
  5. Per PCR quantitativa, usare per esempio il tempo reale kit PCR Roche con SYBR Green.

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Representative Results

Qui vi presentiamo una serie di figure che dimostrano risultati della ex vivo placca coltura. Per valutare i cambiamenti nel milieu infiammatorio in risposta all'agente di interesse nel vivo esperimento modello ex, misuriamo diverse molecole che sono noti per essere principalmente coinvolto nell'aterogenesi. Come rappresentante citochine pro-aterogeni scegliamo TNFa, IL6 e IFNg 2,11. Inoltre, utilizziamo fattore di von Willebrand e del fattore tissutale per valutare le variazioni pro-trombotici. Inoltre, per affrontare lo sviluppo di instabilità placca indotta da un agente di interesse, matrice metallopeptidasi 9 (MMP9) saranno analizzati i livelli. Chemoattractance è anche un passo importante nella progressione e la regressione della placca 11, quindi, studiamo i livelli di CCL2, noto anche come monociti chemiotattica protein-1 (MCP-1), chemoattractant principio di monociti / macrofagi. Dopo l'attrazione delle cellule di rotolamento delle cellule e l'adesione sono le seguenti passaggi.A causa di ciò abbiamo scelto ICAM-1. Analizzando ulteriormente le vie di segnalazione influenzati dalla sostanza di interesse usiamo chinasi extracellulare-signal-regulated (ERK1 / 2), ampiamente espressa e attivato da molti stimoli diversi, come le citochine, apoptosi, differenziamento, l'infezione da virus e ligandi per proteine ​​eterotrimerica G recettori accoppiati 12.

In primo luogo, vi mostriamo ora cambia dipendenti del composto infiammatorio delle lesioni aterosclerotiche coltivate non stimolate, analizzati da reale reazione quantitativo tempo-polimerasi a catena (qRT-PCR) (Figura 1). Durante la coltura placca, un aumento dell'attività del milieu infiammatorio lesionale può essere osservato. Nessuna differenza è stata trovata dopo 3 ore vs nessuna cultura (dati non mostrati). Dopo 8 ore di coltura placca, abbiamo trovato solo un leggero aumento di alcune molecole come IL6, ma non di un TNF e IFN g, mentre dopo 24 ore, c'era un upregulationdi varie molecole come TNF a, IL6 e IFN g. In particolare, maggiore è il tempo di coltura placca maggiore è la variazione di espressione molecola sono.

In secondo luogo, per dimostrare la fattibilità di influenzare l'ambiente infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche, vengono presentati i risultati di pezzi placca incubate con 1 mg / ml LPS per 3 ore, misurata mediante PCR (Figura 2). Pezzi placca non stimolate servito come controllo negativo . Abbiamo trovato che LPS induce un marcato aumento del grado di attivazione del composto infiammatoria all'interno lesioni aterosclerotiche. Varie citochine (IL6, TNF un ecc, Figura 2A-B), chemochine (CCL2 ecc, non mostrati), adesione (ICAM1, non mostrato), destabilizzante placca (Matrix metallopeptidasi 9 (MMP9), non mostrata) e pro- molecole trombotiche (fattore di von Willebrand, Figura 2C,

In terzo luogo, per valutare l'abbondanza di proteine, surnatanti di lesioni coltivate sono stati analizzati mediante ELISA e fracassato tessuti placca tamponando occidentale (Figura 3D). In figura 3A-C, mostriamo analisi ELISA di IFN-g, MCP-1 e TNF-a nel supernatante di coltura campioni incubati con LPS o controllo per 8 ore. Inoltre, l'analisi western blot per (fosforilata) ERK 1/2 di tessuti placca fracassato e lisate, sia stimolate con LPS o controllo, è dimostrato nella figura 3D.

Figura 1
Figura 1. Effetto della coltura placca sul composto lesionale infiammatorio nel tempo. Pezzi placca aterosclerotica sono stati immediatamente scossa congelate o coltivate per 8o 24 ore e l'espressione di citochine indicati IL6 (A), IFN g (B) e TNF a (C) sono stati analizzati mediante PCR. I risultati riportati rappresentano la media di cinque esperimenti indipendenti. Cinque pezzi lesione aterosclerotica per ciascun gruppo sono stati usati per punto di tempo indicato. I valori sono normalizzati a b-actina e in copie di cDNA / 1.000 copie b-actina. I risultati sono mostrati come trame di dialogo con medio e 25 ° e 75 ° percentile come scatole e 10 ° e 90 ° percentile come baffi. *: P <0.01.

Figura 2
Figura 2. LPS stimolazione dei pezzi placca coltura induce un aumento delle varie molecole infiammatorie. Pezzi placca sono stati incubati con 1 ug / ml LPSo non stimolate per 3 ore e analizzati da qRT-PCR. I risultati riportati rappresentano la media di cinque esperimenti indipendenti. Sono stati utilizzati due pezzi per ogni gruppo. I valori sono normalizzati a b-actina e in copie di cDNA / 1.000 copie b-actina. I risultati sono mostrati come trame di dialogo con medio e 25 ° e 75 ° percentile come scatole e 10 ° e 90 ° percentile come baffi. *: P <0.01.

Figura 3
Espressione Figura 3. Proteina nel supernatante di coltura placca. Misurazioni rappresentativa ELISA di citochine IFN-g (A), TNF-a (B) e MCP-1 (C) nel supernatante di pezzi placca trattati con LPS o non stimolato per 8 sono presenti hr. I risultati riportati rappresentano la media di cinque speri indipendentits. I risultati sono mostrati come trame di dialogo con medio e 25 ° e 75 ° percentile come scatole e 10 ° e 90 ° percentile come baffi. Inoltre, rappresentante western blotting per (fosforilata) ERK 1/2 di LPS stimolato o controllare lesioni aterosclerotiche in coltura dopo 3 ore è dimostrato in figura 3D. I grafici a barre colonna espongono medio + SEM come baffi rappresentano la media di cinque esperimenti indipendenti. *: P <0.01.

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Discussion

Qui vi presentiamo un ex vivo placca modello di coltura per studiare l'influenza di sostanze potenzialmente rilevanti sul aterosclerotica lesione biologia. Il principale vantaggio di questo metodo ex vivo è la capacità di valutare l'influenza delle sostanze indicate sulle cellule infiammatorie e la loro interazione cellulare nonché vie infiammatorie e cascate all'interno lesioni aterosclerotiche umane. Diversi metodi utilizzabili (es. RT-PCR, western blot, immunoistochimica, citometria a flusso, ELISA) contribuiscono a fornire un'analisi completa degli effetti della sostanza di interesse sulla lesione aterosclerotica infiammazione.

I processi infiammatori nell'aterosclerosi murino sono ben compresi, anche grazie a modelli murini sovraesprimono o privi alcuni geni di interesse 11. Tuttavia, i risultati non sono sempre strettamente corrispondono agli esseri umani 6-9,13. Topi aterosclerotiche ricevono di solito un alto chol patologicaesterol dieta 6. Inoltre, è noto che i sistemi immunitari tra umani e topi mostrano differenze sostanziali 7-9. Qui, presentiamo un ex vivo placca modello di coltura, che permette studiare l'influenza di una sostanza di interesse sul composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche umane come dimostrato da Niessner et al. 14. Inoltre, vari metodi aggiuntivi possono essere utilizzati per analizzare i risultati di un esperimento cultura placca, paragonabile a studi murini. Pertanto, il modello ex vivo apre la possibilità di sostituire murino in vivo in alcuni casi e può rappresentare un eccellente metodo di collegamento tra un aterosclerosi putativo promozione molecola nel sistema murino e traduzione di biologia umana.

L'ex vivo modello umano per l'aterosclerosi non è paragonabile con esperimenti in vitro di cellule in. Le linee cellulari possono essere facilmente memorizzati e colto, ma sono fenotipicamente e functionally non identiche alle cellule primarie. Cellule fresche possono essere ottenute dal sangue regolari pareggi, ma è a volte molto difficile per la cultura e la loro cultura è sottoposto a molti fattori. Inoltre, utilizzando in vitro esperimenti di coltura cellulare, non è possibile studiare l'influenza di molecole specifiche sul composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche. Così, esperimenti in vitro sono importanti per iniziale (traslazionale) passo per indagini di biologia umana, ma non riescono ad analizzare ulteriormente il ruolo della molecola di interesse per il concetto di aterosclerosi umana, soprattutto interazione cellulare e influenza sulle cascate infiammatorie e percorso all'interno lesioni aterosclerotiche .

Monaco et al. Stabilisce un importante sistema di coltura a breve termine di cellule isolate dal tessuto aterosclerotica umana 15. Hanno usato una miscela enzimatica di collagenasi, elastasi e DNasi. Questo metodo permette di indagine di lesiesperimenti cellula-cellula onal, segnalazione analisi percorso e gli studi di trasferimento genico con vettori adenovirali. Ma rimane sconosciuta come la miscela enzimatica influenza le cellule, cioè grad di attivazione, espressione marcatore di superficie ecc Inoltre, ci si può chiedere se i risultati di questi esperimenti riflettono i processi reali all'interno lesioni aterosclerotiche. Inoltre, la posizione originale delle cellule sarà distrutta dalla miscela enzimatica e il sistema di coltura a breve termine ha le stesse limitazioni come le vitro esperimenti sulle cellule in.

Per gli studi di cellule o di popolazioni cellulari specifiche all'interno di una lesione aterosclerotica, è possibile utilizzare il metodo di micro dissezione laser capture. Il composto cella o cella di interesse sarà tagliato fuori dal tessuto utilizzando un-infrarossi o UV-Laser e RNA, DNA o analisi delle proteine ​​può essere effettuata. La cattura laser micro dissezione non sembra danneggiare le cellule, il recettore di superficie cellulare expreSsion ecc Il vantaggio del metodo è l'analisi di una cellula o di una posizione di interesse all'interno di una lesione aterosclerotica. Ma non è possibile valutare ulteriormente le cellule, come studi in vitro.

Il modello ex vivo implica una vasta gamma di possibili metodi per misurare e analizzare i risultati. Tempo reale PCR può essere eseguita dopo l'isolamento di RNA e cDNA sintesi di indagare il livello di espressione genica come dimostrato da Niessner et al. 14. Immunoistochimica è uno strumento istituito per valutare il livello di proteine ​​al fine di dimostrare l'espressione della proteina e l'origine cellulare all'interno lesioni aterosclerotiche. Western blotting può essere utilizzato per analizzare percorsi di segnale. Inoltre, isolamento cellulare mediante digestione enzimatica in una soluzione apre la possibilità di effettuare analisi citofluorimetrica analizzare ulteriormente per tipo di cellula esempio, sottotipi cellulari e grado di attivazione. Inoltre, dopo l'isolamento delle cellulespectratyping rappresentano un buon metodo per analizzare ulteriormente variabilità T cell receptor. Inoltre, dopo l'isolamento digestione cellulare magnetica è un metodo di alta qualità provata di separazione cellulare di sottotipi cellulari specifici per ulteriori studi in vitro e analisi microarray. Alla fine, surnatanti possono essere raccolti per la misurazione delle proteine ​​mediante ELISA. In conclusione, il modello ex vivo è uno strumento prezioso per indagare le esatte variazioni del milieu infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche umane.

Il modello ex vivo si basa su campioni endoarterectomia. Uso placche aterosclerotiche ottenuti da individui diversi può provocare un maggior grado di composizione cellulare differenziale e quindi superiore variazione dei livelli di geni / proteine ​​di interesse. Pertanto, è importante utilizzare campioni ricchi o complicati lipidi placca anziché lesioni fibrosclerotica 10, perché la risposta infiammatoria è nettamente inferiore nelle lesio fibroscleroticons. Pertanto, è di grande interesse per valutare la morfologia di placca prima di analizzare i risultati di esperimenti di coltura placca.

Inoltre, ciascun campione di prova comprende diverse fasi della lesione aterosclerotica sviluppo / progressione, dalla disfunzione endoteliale iniziale e lipidi accumulo passo, verso striature grassi e sviluppo di un nucleo necrotico a placche rotti. Pertanto, al fine di minimizzare l'eterogeneità del tessuto placca, è necessario tagliare i bordi, che generalmente rappresentano primi passi di aterogenesi.

Non si può escludere che il taglio induce risposte danno tissutale. Ma i nostri placca di tessuto esperimenti di coltura hanno mostrato analoghi livelli di espressione genica dei tessuti placca coltivati ​​a tessuti placca non coltivate. Così, questo sottolinea che il metodo attuale è un buon strumento per indagare l'ambiente infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche.

La cultura dellapezzi placca è limitata a un periodo di tempo fino a un giorno. Se il tessuto placca viene coltivato più di un giorno, la variazione dei risultati aumenta notevolmente. Inoltre, dopo 3 giorni la composizione della placca e la morfologia crolla.

Ci sono dei limiti che devono essere tenuti a mente quando si applica questo modello. Il modello ex vivo è un buon metodo per studiare l'ambiente infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche. Tuttavia, i principali componenti sono mancanti in questo contesto. Nessun caratteristiche emodinamiche sono applicabili e le influenze sistemiche sono totalmente mancanti. Inoltre, con questo metodo è possibile solo per indagare cambiamenti a breve termine, ma manca una analisi di lungo termine a causa del crollo della morfologia di placca.

In conclusione, presentiamo qui un metodo che sarà utile per i ricercatori che sono interessati nella ricerca di potenziali nuove molecole sulla lesione infiammazione aterosclerotica umana. L'ex vivo targa cmodello ulture fa soffrire differenze tra il topo e il sistema immunitario umano, ma ci dà la possibilità di analizzare l'interazione cellulare nel contesto delle lesioni aterosclerotiche e rappresentano l'opportunità di studiare cascate infiammatorie lesionali locali e percorsi. Il vivo targa metodo ex cultura qui descritto è facile da usare ed è riproducibile e può aiutare ad identificare e convalidare nuovi meccanismi di malattia e bersagli terapeutici.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto da dichiarare.

Acknowledgements

Ringraziamo Nadine Wambsganss per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) ER 682/2-1 e uno stipendio di ricerca dalla Società Tedesca di Cardiologia a C. Erbel nonché una borsa di studio di ricerca dal tedesco accademico Servizio Heidelberg a L. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Gibco 21875-091
FCS Gibco 10270-106
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
15 ml Tube Sarstedt 62,554,502
Culture dish (60 mm) Orange Scientific 5550200
LPS Sigma L4516
Cell culture plates 48-well Greiner 677102
Scalpel - single use Feather FEA200130011
TissueLyser Precellys 24 Dual Cat. No. EQ03119.200.RD010.0
RNeasy (Mini) Kit  Qiagen Cat. No. 74104
Boehringer cDNA kit  Roche Diagnostics Cat. No. 11483188001
Nanodrop spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific

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References

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