Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting is een opkomende technologie die zijn oorsprong in de rapid prototyping-industrie heeft. De verschillende drukprocessen kunnen worden onderverdeeld in contact bioprinting 1-4 (extrusie, dip pen en zachte lithografie), contactloze bioprinting 5-7 (het laser overdracht, ink-jet depositie) en laser gebaseerde technieken zoals twee foton fotopolymerisatie 8. Het kan worden gebruikt voor vele toepassingen zoals tissue engineering 9-13, 14-16 biosensor microfabricage en als instrument voor fundamentele biologische vragen als invloeden van co-kweken van verschillende celtypes 17 beantwoorden. In tegenstelling tot gewone fotolithografische of soft-lithografische methoden, extrusie bioprinting heeft het voordeel dat geen afzonderlijke masker of stempel vereist. Behulp van CAD-software, kan het ontwerp van de constructie snel worden gewijzigd en aangepast aan de wensen van de operator. Dit maakt bioprinting flexibeler dan lithografie-basedbenaderingen.

Hier laten we het afdrukken van een offer mal om een ​​multi-materiaal 3D structuur met behulp van een reeks zuilen in een hydrogel als voorbeeld maken. Deze pijlers kunnen holle structuren vormen voor een vasculair netwerk of de buizen binnen een zenuwgeleider leiding. Voor de wijze offeren vormmateriaal was poloxameer 407, een warmteresponsieve polymeer met uitstekende drukeigenschappen dat vloeibaar is bij 4 ° C en een vast boven de geleringstemperatuur ~ 20 ° C 24,5% w / v oplossing 18. Deze eigenschap maakt het poloxameer-based offer mal te worden geëlueerd op aanvraag en heeft voordelen ten opzichte van de langzame ontbinding van een vast materiaal speciaal voor smalle geometrieën. Poloxamer werd op microscoop glasplaatjes gedrukt om het offer mal te maken. Agarose werd gepipetteerd in de mal en afgekoeld tot gelering. Na elutie van de poloxameer in ijskoud water, werden de holten in de agarose mal gevuld met alginaat methacrylaat spiked met FITC gelabeld fibrinogeen. De gevulde holten werden daarna verknoopt met UV en het construct werd afgebeeld met een epi-fluorescentie microscoop.

Introduction

Tissue engineering benaderingen hebben veel vooruitgang geboekt in de afgelopen jaren met betrekking tot de regeneratie van menselijke weefsels en organen 19,20. Tot nu toe, de focus van tissue engineering is vaak beperkt tot weefsels die een eenvoudige structuur of kleine afmetingen, zoals de blaas of de huid 21,22 23-25 ​​hebben. Het menselijk lichaam bevat echter vele complexe driedimensionale weefsels waar cellen en extracellulaire matrix zijn gerangschikt in een ruimtelijk gedefinieerde manier. Om deze weefsels te vervaardigen, is een techniek vereist die cellen en extracellulaire matrix steiger kan uitgaan van een driedimensionaal construct op gespecificeerde plaatsen. Bioprinting heeft het potentieel om een dergelijke techniek waarbij het ​​beeld van de vervaardiging van complexe driedimensionale weefsels worden gerealiseerd 10,11,26-28 zijn.

Bioprinting wordt gedefinieerd als "het gebruik van materiaal overdrachtsprocessen voor patroonvorming en monteren biologisch relfende materialen - moleculen, cellen, weefsels, en bioafbreekbare materialen -. een voorgeschreven organisatie een of meer biologische functies "4 bereiken Het omvat verschillende technieken die werken bij verschillende resoluties en lengteschalen, van de sub-micron resolutie van twee -foton polymerisatie 29 op een resolutie van 150 micrometer tot 420 micrometer voor extrusie afdrukken 1,12,30. Geen enkel materiaal of materiaal combinatie zal voldoen aan de eisen van elke methode 31. Voor extrusie afdrukken, de belangrijkste parameters zijn viscositeit en geleringstijd 32, waar een hoge viscositeit en snelle gelering gewenst.

3D printen is een techniek die de gemakkelijke creatie van opofferende mallen voor het maken van complexe geometrieën 30,33,34 mogelijk maakt. Dit proces is gebaseerd op de constructie van een vorm met een snelle prototyping zoals een extrusie bioprinter. De gecreëerd offer mal wordt gebruiktom complexe structuren te vormen uit materialen die moeilijk mogelijk wegens hun lage viscositeit en langzaam geltijd zijn. De hier gepresenteerde methode omvat de vorming van een offer mal bestaat uit een materiaal dat snel oplost bij lage temperatuur nauwkeurig kan worden geëxtrudeerd. Het blokcopolymeer poly (ethyleenglycol) 99-poly (propyleenglycol) 67-poly (ethyleenglycol) 99 (ook bekend als Pluronic F127 of poloxameer 407) voldoet aan deze eisen. Er is reeds gebruikt in een gemodificeerde versie extrusie drukken 1 maar voor zover wij weten, nooit gebruikt voor het afdrukken in de ongewijzigde versie vanwege zijn instabiliteit in vloeibare omgeving. Poloxamer 407 toont ook een inverse thermisch responsief gedrag 18 dwz verandert van een gel naar een sol bij afkoeling. Het belangrijkste is, kan het in complexe willekeurig gebogen structuren worden geprint met een zeer hoge betrouwbaarheid. Dit maakt de creatie van een gestructureerde hydrogel uit eenmateriaal met lage viscositeit, in casu langzaam gelerend agarose bepaling, waarbij de oplossing in de gedrukte offer mal. De combinatie van het drukken van de opofferende mal met hoge betrouwbaarheid en snelle elutie van de gegoten structuur hydrogel laat een snelle en flexibele manier om schimmels te creëren met verschillende geometrieën zonder gebruik van een masker of een stempel zoals vaak vereist lithografische methoden. De gegoten gestructureerde hydrogel kan verder worden gevuld met een ander materiaal dat niet geschikt is voor extrusie druk vanwege de lage viscositeit. Dit is in ons geval een lage viscositeit alginaat methacrylaat oplossing. Hier presenteren we de werkwijze thermoresponsieve reverse offer matrijzen voor hydrogel patroonvorming het voorbeeld van een zuil array.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de Poloxamer 407 Solution

Indien beschikbaar, voert u de voorbereiding van de poloxameer oplossing in een koude ruimte (4 ° C). Indien niet beschikbaar, plaats een glazen fles in een bekerglas gevuld met ijskoud water. Bij hogere temperaturen zal het poloxameer boven het gelpunt en niet goed oplossen.

  1. Voeg 60 ml ijskoude PBS oplossing in een glazen fles en roer krachtig met een magneetroerder.
  2. Weegt 24.5 gram poloxameer en voeg deze in kleine hoeveelheden aan de koude PBS. Wacht tot het poloxameer gedeeltelijk is opgelost voordat er nog meer toe te voegen.
  3. Roer de oplossing tot alle poloxameer is opgelost.
  4. Voeg koude PBS tot een eindvolume van 100 ml wordt bereikt. De eindconcentratie wordt 24,5% w / v.
  5. Stop roeren van de oplossing en laat het rusten bij 4 ° C totdat luchtbellen en schuim in de oplossing verdwenen. Bellen die zijn gevangen in de gel wordt overgedragen aan de printer cartridge en zal leiden tot defecten in de gedrukte offer mallen.
  6. Filter (0,22 pm filter) de oplossing direct in de drukkerij cartridge om ongewenste deeltjes die de naald zouden kunnen verstoppen. De filterstap moeten worden uitgevoerd in een koude ruimte (of indien niet beschikbaar gekoeld tips, filter enz.) geleren van het poloxameer in het filter te voorkomen. Bewaar de gesloten patroon bij 4 ° C tot 30 minuten voor het experiment.

2. Voorbereiding van de 3D-printer

De 3D-printer gebruikt in dit werk was de "BioFactory" van regenHU. De extrusie deel van het systeem bestaat uit verschillende delen. Een patroon onder druk aan de top via een luer-lock adapter een connector verbonden. De connector overbrugt de ruimte tussen de uitlaat van de patroon en de inlaat van een elektromagnetische klep. Aan de uitgang van de magneetventiel kan naalden met verschillende diameters worden gebruikt. Het materiaal wordt geëxtrudeerd op een subStrate dat wordt gehouden op een bewegend podium door middel van vacuüm. De belangrijkste onderdelen van het systeem zijn weergegeven in figuur 1. Andere extrusie gebaseerde systemen kunnen worden gebruikt voor het afdrukken en het optimalisatieproces moet worden gedaan voor elk systeem.

  1. Plaats de magneetklep (nozzle diameter 0.3 mm) en de naald (inwendige diameter 0,15 mm) in afzonderlijke 1,5 ml reageerbuisjes gevuld met ultrapuur water en plaats ze in een verwarmde ultrasoon bad schoon te maken voor 30 minuten. Spoel de gereinigde kleppen met ethanol en droog ze met een stikstof pistool.
  2. Installeer de klep en naald in de printer en een lege, schone cartridge.
  3. Solliciteer 3 bar druk op het systeem en blaas eventueel resterende vloeistoffen uit de geïnstalleerde kraan en de naald met perslucht. Voor kleine naald diameters, wordt aanbevolen een filter (gemeenschappelijke spuitfilter, 0,45 urn poriegrootte) bij de uitgang van de perslucht geïnstalleerd om toegang van kleine deeltjes die de naald zouden kunnen verstoppen te vermijden. Schakel de druk uit en installeer de cartridge geladen met de poloxameer. De cartridge moet worden genomen uit de koelkast ongeveer 30 minuten vóór het monteren van de cartridge, zodat de poloxameer kan kamertemperatuur en gel te bereiken.
  4. Breng 3 bar druk van het systeem en afzien poloxameer totdat de naaldpunt bereikt en geëxtrudeerd in een continue streng.

3. Optimalisatie van de Printing Parameters

Om nauwkeurige 3D structuren, het drukproces worden geoptimaliseerd voor het gekozen materiaal en concentratie. Afhankelijk van de viscositeit en het 3D printsysteem elk materiaal een specifiek volume en afgifteleiding lijndikte een vaste set parameters verkregen.

  1. Met een geschikte CAD-software (staat om ISO bestanden te maken uit de tekeningen), trek een lijn ongeveer dezelfde lengte als de structuur die u wilt afdrukken.
  2. Plaats een microscoop glasplaatje 25 mm x 75 mm x 1mm of een ander substraat in de printer en zet door draaien aan het vacuüm.
  3. In de printersoftware, stellen de magneetklep aan een hoge frequentie van 50 Hz en stel een hoge druk van 3 bar.
  4. Print een laag van een enkele lijn met een podium snelheid van 300 mm / min.
  5. Verminder de druk totdat de gewenste lijndikte is bereikt. U kunt het volume dat is geëxtrudeerd via de openingstijd van de klep ook besturen.
  6. Verlaag de de klep totdat geen doorgaande lijn meer kan worden afgedrukt. Kies een frequentie boven deze waarde.

Opmerking: Zodra de gewenste lijndikte en continue lijnen worden bereikt, bepalen de optimale podium snelheid en laagdikte dwz de lift van de naald na een bedrukte laag.

  1. Druk meerdere lagen over elkaar of de naald in de juiste positie boven de vorige laag na verscheidene afgedrukte lagen. Pas de laagdikte (naald lift) Zodat elke laag is gedrukt op de volgende (Figuur 3).
  2. Verlaag de fase snelheid van de etappe van 300 mm / min stapsgewijze zodat geëxtrudeerde lagen beginnen en eindigen op dezelfde posities als de voorgaande (figuur 4). Te hoge fase snelheden leiden het podium te bewegen voordat het geëxtrudeerde materiaal de vorige laag heeft aangeraakt.
  3. Voor het afdrukken van de pijler structuren volgen stappen 3.1.-3.8., Maar in plaats van het tekenen van een enkele lijn te trekken een enkel punt. De parameters te richten op het afdrukken van de pijlers van de druk (regelt laagdikte en pijler diameter poloxameer), de openingstijd van de klep (geëxtrudeerde volume) en de verblijftijd van de printkop de positie waar de pijler worden gedeponeerd .
  4. Als de parameters worden geoptimaliseerd printen van een aantal lagen van een regel moet resulteren in een massieve wand, of bij de punten, een pilaar. Sla de parameters voor later gebruik.

Gebruik de parameters die tijdens de optimalisatie procedure vanaf dit punt op.

  1. Print de innerlijke structuur (hier is het een pilaar array) op een microscoopglaasje en laat het een nacht drogen. Deze a) vermindert de grootte en dikte van de structuren en b) een betere hechting tussen de structuur en het substraat, dus loskomen tijdens het opvullen kan worden vermeden.
  2. Met de CAD-software, trek je een structuur die bestaat uit een buiten muur rond de structuur u van plan te zijn geëlueerd weg en gevuld. Print de structuur met poloxameer. De drukken van de wand 6 minuten duren.

Let op: de wand te drukken ten minste 3,5 mm van de inwendige structuur vanwege de afmetingen van de naald. Anders het drukken van de buitenwand zal de inwendige structuur vernietigen

  1. Bereid de oplossing die u wilt uw sacr backfillificial mal met (hier 1% agarose in gedemineraliseerd water). De agarose oplossing dient een temperatuur tussen 35 ° C en 45 ° C hebben Onder deze temperatuur wordt de agarose te snel stollen, boven deze temperatuur kan het de afgedrukte pilaren vernietigen omdat poloxameer structuur verzachten.
  2. Vul langzaam de opofferende mal met het opvullen oplossing met behulp van een pipet. Dit moet langzaam gebeuren om vernietiging van de structuur in de wand te voorkomen.
  3. Laat de oplossing opgevuld gel of het verknopen naargelang de gebruikte polymeer. Bij agarose nam de stolling staan ​​bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Plaats de opgevuld offer matrijs in een ijsbad gedurende 10 min naar het poloxameer structuur elueren.
  5. Dep de opgevuld structuur met een papieren tissue en plaats deze op een nieuwe glazen microscoopglaasje. Druk structuur voorzichtig op het microscoopglaasje om lekkage van de derde hydrogel uit de holte te voorkomen in de ruimte tussende structuur en opgevuld microscoopglaasje.

5. Het vullen van de Voids

  1. Om de vides achtergelaten door de geëlueerde poloxameer vullen formulier, vul het beoogde polymeer oplossing in een spuit met een 30 G naald. In dit voorbeeld gebruikten we een 1% alginaat methacrylaat in 0,15 M NaCl oplossing met de toevoeging van 0,05% w / v lithium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) en 2,5% v / v van Alexa-488 geconjugeerd fibrinogeen . De Alexa-488 geconjugeerd fibrinogeen werd toegevoegd visualisatiedoeleinden.
  2. Photopolymerize het polymeer met een hoge intensiteit UV-lamp (100 Watt, 365 nm, afstand van substraat was 3,5 cm) gedurende 5 min en het imago van de bouw met behulp van een epi-fluorescentie of confocale microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve resultaten tonen aan dat de omgekeerde vorm techniek (getoond in figuur 2) een gestructureerd gel die kan worden gevuld met een tweede materiaal te maken. Aan het begin van elk drukproces de parameters afdrukken worden eerst geoptimaliseerd. Stapsgewijze aanpassing van de parameters zal resulteren in gedrukte meerlaagse constructies weergegeven in figuur 3 en figuur 4 als enkele lijnen afgedrukt. Als de laagdikte (de naald lift na een bedrukte laag) te laag is, zal men zien dat de naald de voorgaande lagen zal raken. Als de naald te hoog is, zal een golf patroon op het oppervlak van de gedrukte construct verschijnt. Dit is te zien in figuren 3A-3D, waarbij alle geteste laagdikten waren te groot voor de gegeven stadiumsnelheid. Omdat een hoge podium snelheid vermindert de laagdikte, kleine verschillen tussen de ingestelde en de werkelijke laagdikte ophopen en het golfpatroon begintverschijnen als de hoogte van het construct verhoogt. Door verlaging van de laagdikte, de verschillen kleiner en het golfpatroon verschijnt op een hogere positie dan voorheen (aangegeven door de stippellijnen in figuur 3C en Figuur 3D). En een dikte vaste laag, als de fase te snel is zal dit tot resultaat hebben dat een golfpatroon of constructen die smalle naar boven en een bult aan het begin van het construct (rechterkant van de gedrukte structuur), zoals in Figuren 4A-4C. Geoptimaliseerde parameters voor het poloxameer waren een openingstijd van 0,2 msec, een frequentie van 31.14 Hz, een laagdikte van 0,15 mm, een druk van 1,5 bar en een snelheid van 75 mm / min. Afdrukken met deze parameters resulteerde in gladde massieve muren zoals in figuur 4D. Echter, een hoger stadium snelheid van 100 mm / min werd gekozen voor de werkwijze om de productietijd van de wanden te verminderen.

Met geoptimaliseerde parameters voor pillar afdrukken (openingstijd 0,2 msec, frequentie 31,14 Hz, laagdikte 0,08 mm, druk 1.5 bar, podium snelheid 200 mm / min, residency tijd 0,3 sec) hebben we een reeks van pilaren zoals weergegeven in figuur 5A. Uitdroging door de pijler matrix geleid buigen van de pijlers naar het midden. Dit effect kan worden verminderd, maar niet vermeden door het plaatsen van de pijlers verder uit elkaar. Een muur wordt dan rond de pijlers gedrukt zoals getoond in figuur 5B.

Na de elutie van de opofferende poloxameer schimmel in koud water, werden gestructureerde agarose hydrogels zoals weergegeven in figuur 5C aangemaakt. Na het vullen van de holten met de fluorescerende alginaat methacrylaat oplossing en daaropvolgende verknoping, a novel hydrogel-in-hydrogel pijler matrix zoals die getoond in figuur 6 kan worden gemaakt. De 3D-z-stack reconstructie illustreert duidelijk de tl pilaren die zijn gemaakt. Figuur 7 strong> illustreert de mogelijkheid deze techniek ook willekeurig gebogen matrijzen maken.

Figuur 1
Figuur 1. Afbeelding van de bioprinter. A) Een beeld van de bioprinter "BioFactory". De naald en de afsluiter zijn niet zichtbaar in het beeld maar zijn afgebeeld in B). Tot 8 printkoppen zijn op een draaiende turret die toelaat om snel te wisselen tussen materialen gemonteerd. Het afdrukken wordt uitgevoerd op een bewegende fase dat kan worden verplaatst x-, y-en z-richting. hier grotere afbeelding te bekijken .

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schema van de werkwijze van de productie van offer matrijzen voor het vervaardigen van gestructureerde hydrogels.

Figuur 3
Figuur 3. Laagdikte optimalisatie. Poloxamer lagen afgedrukt op een vaste fase snelheid (250 mm / min) met afnemende laagdikte. Wanneer de laagdikte te hoog is, een golfpatroon ontstaat. Dit verdwijnt geleidelijk bij afnemende laagdikte. De rode vaste lijnen geven de onderkant van de afgedrukte construct dat de rode gestippelde lijnen geven de hoogte van het defect vrije gedeelte van de afgedrukte construct. Laagdiktes zijn A) 0.18 mm, B) 0.16 mm C) 0,15 mm en D) 0.13 mm. De rode balk geeft 2 mm.

"> Figuur 4
Figuur 4. Stage snelheid optimalisatie. Poloxameer lagen bedrukt met een laagdikte van 0,15 mm met verschillende snelheden van fase A) 250 mm / min, B) 200 mm / min, C) 150 mm / min en D) 75 mm / min. Door verlaging van de stadiumsnelheid, het beginpunt van het drukproces alle lagen dezelfde en een massieve wand kan worden afgedrukt. De rode balk geeft 2 mm.

Figuur 5
Figuur 5. Productie van gedessineerde hydrogels. A) Pillar scala van gedroogde poloxameer met pilaren gescheiden 1.75 mm van elkaar. Het buigen van de pijlers wordt veroorzaakt door het drogen effecten. B) Pillar matrix omsloten door een wand van poloxameer voor pipetteren de agarose. C) Structuredagarose hydrogel na verwijdering van de opofferende matrijs.

Figuur 6
Figuur 6. 3D z-stack reconstructie van fluorescent gelabelde pijlers ingebed in een agarose steiger.

Figuur 7
Figuur 7. Concentrische cirkels gedrukt van poloxameer. Single lagen zichtbaar zijn. De rode balk geeft 2 mm.

Ontwerpcriteria Parameter afdrukken
Fijnere laagdikte
  • Druk ↓
  • Stadiumsnelheid ↑
  • Openingstijd ↓
  • Frequentie ↓
Kleinere lijndikte
  • Druk ↓
  • Stadiumsnelheid ↑
  • Openingstijd ↓
  • Frequentie ↓
Continu extrusie
  • Druk ↑
  • Stadiumsnelheid ↓
  • Openingstijd ↑
  • Frequentie ↑
Snellere bouwsnelheid
  • Druk ↑
  • Stadiumsnelheid ↑
  • Openingstijd ↑
  • Frequentie ↑

Tabel 1. Vier ontwerpparameters voor de extrusie van poloxameer lijnen en hoe ze kunnen worden beïnvloed door verschillende parameters afdrukken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we voor het eerst het gebruik van een warmteresponsieve polymeer voor een offer schimmel die snel kan worden geëlueerd in koud water door de gel-sol overgang van poloxameer van ~ 20 ° C. De snelheid van het gehele proces maakt poloxameer interessant dat spoedig biopolymeer structuren die niet worden bedrukt met voldoende resolutie. De hier beschreven techniek kan worden gebruikt voor patroonvorming een hydrogel in elkaar hydrogel of voor het maken van microfluïdische kanalen zoals eerder beschreven voor andere materialen 35. Het voordeel van het poloxameer als offer matrijs dat het in willekeurige geometrieën in solid layer-by-layer constructen die kunnen worden gevuld en daarna geëlueerd kunnen worden afgedrukt.

We beschrijven hier het proces van het creëren van een offer mal met poloxameer met latere opvulling van een tweede hydrogel om gestructureerde hydrogelen te creëren. Het materiaal voor de gestructureerde hydrogel kan chOsen met beperkingen met betrekking tot viscositeit en temperatuur op het punt van het vullen. Laag viskeuze precursor oplossingen gebruikte polymeren zoals polyethyleenglycol diacrylaat 36,37, 38,39 alginaat, agarose en 40 methacrylbevattend biopolymeren 41-43 zijn slechts enkele voorbeelden van geschikte vulmaterialen. Hoog viskeuze materialen kunnen echter niet invullen smalle geometrieën of kon het offer schimmel in geval van dunne fragiele structuren zoals de pilaren hier afgedrukt vernietigen. Een laag percentage agarose oplossing werd daarom gekozen voor de opvulling. Een ander voordeel van het gebruik van agarose in combinatie met poloxameer is dat het goed gels door afkoeling. Daarom, wanneer ondergedompeld in koud water, agarose behoudt zijn gegeleerde toestand, een toestand die nauwkeurig weerspiegelt de inverse afgedrukt poloxameer patroon.

De belangrijke stappen in deze procedure omvatten het optimaliseren van de parameters druk, het vullen van de matrijs en de opofferendehet vullen van de holten. Printparameters die zijn geoptimaliseerd waren de frequentie en de openingstijd van de klep de druk stadium snelheid en de laagdikte. De laagdikte wordt gedefinieerd als de lift van de naald na elke gedrukte laag. In het geval van de pijlers, de residentie tijd, dwz de tijd materiaal is geëxtrudeerd op een punt zonder het verplaatsen van het podium, ook moest worden aangepast. Het optimalisatieproces kan tijdrovend zijn omdat veranderingen in een parameter effecten op verscheidene ontwerpparameters van de geëxtrudeerde lijnen hebben. De belangrijkste parameters voor verschillende ontwerpcriteria worden beschreven in Tabel 1.

De tweede belangrijke stap in het proces is de vulling van de matrijs offer. Het vullen van de matrijs offer een delicate stap. Klein en smal structuren moeten zorgvuldig worden gevuld, vaak handmatig, en eenvoudige casting oplossingen niet altijd mogelijk.

Zorgvuldige vulling van de sacrificial mal met agarose werd daarom uitgevoerd met een 100 ul pipet om vernietiging van de zuilen voorkomen. De laatste stap, het vullen van de lege ruimten, vereist het gebruik van een spuit met een 30 G naald. Zorg moet worden genomen om blaasvorming voorkomen tijdens het vullen.

De verschillende gels in het construct hier gepresenteerde kunnen cellen bevatten. Door een celtype in de hydrogelen in de lege ruimten en ander celtype in de gestructureerde hydrogel kan een ruimtelijk gedefinieerd co-kweek opstart aangemaakt. Onderling 3D netwerk in de publicatie van Miller et al.. 30, intravasculair of neurale netwerken mogelijk. Een mogelijke benadering voor dergelijke netwerken zou zijn lijnen binnen een omgevende wand af en vul de lege ruimten van de tweede hydrogel, verknopen tweede hydrogel en doorgaan met het afdrukken van de volgende laag gedraaid 90 °. Het voordeel van druk poloxameer als offer matrijs dat het noch nodigeen meester schimmel of een masker. Het maakt ook niet nodig een verwarmde printkop te extruderen van het materiaal en de verstopping van het systeem is niet waargenomen in onze experimenten.

Constructen zoals die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt in de toekomst als ruimtelijk georganiseerd 3D co-culturen diffusie-gebaseerde cel-cel interacties en voor drug discovery bestuderen. Echter, een volledig geautomatiseerde versie van de hier gepresenteerde moet worden ontwikkeld om succesvol te worden op het gebied van drug screening.

Samengevat, hebben we een methode die het drukken van willekeurige geometrieën die kunnen worden gevuld met hydrogels en daarna geëlueerd. Gepresenteerd Zo kunnen gestructureerde hydrogel-in-hydrogel architecturen worden gemaakt in een eenvoudige en kosteneffectieve manier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verklaren.

Acknowledgments

Wij danken Deborah Studer voor de hulp bij de bioprinter.

Het werk werd gefinancierd door de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° NMP4-SL-2009-229292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics