グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入:シナプス統合を調査するために便利なツール

Neuroscience

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Summary

この記事では、高い空間的および時間的な精度を持つシナプス信号の統合を調査するための技術として、神経伝達物質の高速マイクロイオン導入をご紹介します。

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Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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Abstract

神経科学の根本的利益の一つは、最終的には軸索における活動電位の神経出力につながる樹木、非常に複雑な構造に沿って興奮性と抑制性入力の統合を理解することです。ニューロンの出力上の特定のシナプス入力の多様な空間的および時間的パラメータの影響は、樹状入力の距離依存減衰、空間的に分離され、入力の場所に依存した相互作用、興奮統合、線形上GABAergig阻害の影響を、たとえば 、現在調査中ですと非線形統合モード、および多く。

グルタミン酸およびGABAの迅速なマイクロイオン導入で、それは正確にグルタミン酸作動性興奮及び抑制の空間的および時間的統合を調査することができる。重大な技術的要件は、トリガ蛍光灯、発光ダイオード(LED)、または2つの光子SCAある組織の有意な光損傷を導入することなく樹枝を可視化する顕微鏡nning。また、高抵抗ピペットの迅速な容量補正を可能にするマイクロイオントフォレーシス増幅器を有することが非常に重要である。もう一つの重要なポイントは、送信機が思わず実験中にピペットで放出されていないということです。

いったん確立された、この手法は、高い神経伝達物質と位置特異性で信頼性と再現性のあるシグナルを与える。グルタミン酸やGABAアンケージングに比べて、高速イオン導入は視野に限定することなく、同時に、非常に遠い場所で両方のトランスミッタを使用できます。軸索の焦点電気刺激と比較して利点もある。マイクロイオントフォレシス、入力部位の位置が明確に知られており、それが関心のある神経伝達物質のみが解除されていることを確認される。しかし、それだけで、マイクロイオントフォレシスであることを考慮する必要がありポストシナプスが活性化され、神経伝達物質の放出のシナプス前側面が解決されません。この記事では、脳スライス実験でマイクロイオントフォレシスを設定する方法を示します。

Introduction

中枢神経系のニューロンは、その薄いと分岐した樹状プロセス1のシナプス入力の様を受け取る。そこに、興奮性樹入力の大部分は、グルタミン酸作動性シナプスによって媒介される。これらのシナプスは、興奮性シナプス後電位(EPSPを)のシナプス後線形統合で、その結果、空間的に分散した方法で起動することができます。シナプスが同時にと樹状突起上の空間的に近接して活性化される場合、これらの興奮性入力は上記非線形統合されており、樹状突起スパイク2-5を生成することができます。

さらに、興奮性入力の統合は、樹状ツリー上の入力の場所によって異なります。遠房地域に到着した信号は、はるかに減衰ケーブルフィルタ6のために近位の入力よりも。海馬では、尖タフト樹状突起への遠い入力は近dendri上のものとは異なる脳の領域によって生成されTES 7。刺激的な質問は、異なる樹状コンパートメントによって樹状統合は、さまざまな方法で神経発火でこれらの階層の入力の影響を調整した場合どのように処理されるかシナプス入力、ことである。

機能特性、樹状突起の形態的な特徴だけでなく、入力の場所とクラスタリングは決定的にグルタミン酸作動性シナプス8,9の有効性を決定することも興奮性入力が、GABA作動性の端末からの追加の抑制性入力の樹統合に影響を与えている。シナプス統合のこれらの様々な側面は、理想的には、樹状ドメインに別の神経伝達物質の空間的に定義されたアプリケーションを可能にする神経伝達物質のマイクロイオン導入を用いて調査することができます。我々は成功したニューロンに信号積分を調査するために、グルタミン酸とGABAのマイクロイオントフォレシスを確立する方法をここに示しています。

このアプリケーションでは、先の細い濃縮された神経伝達物質溶液を充填した高抵抗ピペットが使用される。これらのピペットは、神経伝達物質受容体が位置するセルの外膜に近接して配置されている。樹枝の良い可視化が必要である。これは、最良のパッチピペットを介して導入される蛍光色素を用いて達成される。その後、非常に短い(<1ミリ秒)パルス電流(10の範囲内の - 100 nAの)を入れ、神経伝達物質の分子を取り出すために使用されます。これらの短いパルスと実効容量の補償と、シナプス後電位または電流は興奮性入力の位置が正確に分かっていることを意味する高い時間·空間的精度を誘発することができます。グルタミン酸マイクロイオン導入( 図1 9)ここに示されているように6未満である定義された半径内にシナプスを活性化することができますが、それは、単一シナプス決議10-12を達成することも可能です。

ハイネ、M. 13の二光子アンケージングで達成スポットサイズよりも小さい場合は0.5μm、以下のサイズを見つけるために調整することができます。高速のマイクロイオントフォレシスでは、2つまたはそれ以上のイオン泳動ピペットを使用して、樹状突起で異なる、さらに遠い箇所にそれらを配置することが容易に可能である。このように、異なる経路からのものを含む興奮性事象の統合を検討することができる。それは同時にグルタミン酸とGABA充填されたイオン導入ピペットを使用することも可能である。このようにして興奮入力(オンパス、オフ経路阻害)に対して異なる位置におけるGABA作動性抑制の効果を研究することができる。また、特定の神経細胞のドメインを標的とする介在による阻害の影響は、遠位樹状突起のように、ソーマまたは軸索14は 、GABAイオン導入を用いて検討することができます。培養神経細胞では、高速のマイクロイオントフォレシスはinveの機会を提供しています単一のシナプス分布とはるかに詳細10,11のニューロンにおけるシナプス伝達の基本側面をstigate。

この記事では、入力位置、入力強度、タイミング、単独または相互作用での依存性に興奮性と抑制性入力のシナプス統合を調査可能に急性脳スライス、で使用するためのグルタミン酸やGABAイオントフォレシスを確立する方法を詳細に示しています。私たちは、この技術の利点と限界を指摘し、どのように成功したトラブルシューティング方法になります。

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Protocol

1。システム要件

  1. 顕微鏡システム:デンドライトの良い可視化は非常に重要です。可能であれば、二光子レーザー走査型顕微鏡システムを使用してください。サファイア超高速パルスレーザー(カメレオンウルトラII、コヒーレント)と高NA目的:我々の実験では、Tiを装備TRIM範囲II、LaVisionバイオ、ビーレフェルト、ドイツやウルティマIVシステム、プレーリー·テクノロジーズ、ミドルトン、ウィスコンシン州で使用(60X、0.9 NA、オリンパス)我々は、パッチピペットを介して蛍光色素に満ちていた樹状突起を可視化する。光損傷が2光子スキャンを使用してそれほど深刻であると考えられているが、レーザパワーを低減(組織における下8 mW)とし、滞留時間(以下1μ秒)又はできるだけ。
  2. 第二の可能性は、可能な限り露光時間を短縮するために獲得と同期して広視野蛍光光源(LEDや蛍光灯)をトリガすることである。我々は、統合された光源(TILLPhoとモノクロを使用しているDodtコントラスト赤外線照明(TILLPhotonics、Grafelfingから、ドイツ)が装備されていたツァイスAxioskop 2 FS正立顕微鏡でトニック、Grafelfingから、ドイツ)。我々の実験において、露光時間は、通常、10ミリ秒から最大であった。 30ミリ秒。
  3. 例えば 2チャンネルマイクロイオントフォレーシスシステム高速キャパシタンス補償MVCS-C-02(NPI電子、タム、ドイツ)、高速マイクロイオン導入·アンプを使用してください。先の細いイオントフォレーシス微小電極は、25の抵抗がある - MΩ100(決定的にチップサイズやピペットの形状に応じて)、およびイオン導入アンプの容量補正を最適にチューニングされている場合、高速の立ち上がり時間にのみ達成することができます。この高速補償はイオン導入ピペットにサブミリ秒の範囲内で簡潔かつ迅速な開始と電流パルスを印加することにより、1ミクロン以下の13スポットサイズでの高空間分解能でトランスミッタを排出することが必要である。イオントフォレーシスアンプはアルです我々は我々の研究室でテストされていないいくつかの他の企業から入手できるそう。これらのデバイスは、静電容量補償回路を備えていない我々の知る限りである。

2。ソリューションを準備

  1. 人工脳脊髄液(ACSF)、それが実験的な設計のために必要とされるように内部溶液を調製。必要とされる内部のソリューションは、唯一の追加は、光学機器に応じて、赤または緑の蛍光色素( 例えば 50〜200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド、Invitrogen社)である。 mm単位で、解剖のために使用することができますACSF スクロースはこちら例:60のNaCl、100スクロース、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、1のCaCl 2、5のMgCl 2、20グルコース、および通常ACSF用mMの中でパッチクランプ実験のためのソリューション:125のNaCl、3のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、2.6のCaCl 2、1.3のMgCl 2、15グルコース。
  2. すべての細胞外の溶液絶えず(95%O 2、5%CO 2)Carbogenize。
  3. mMのは、例えば、内部の溶液を調製:140 K-グルコン酸、7のKCl、5 HEPES酸、0.5のMgCl 2、5クレアチンリン酸、0.16 EGTA、50と- 200μMアレクサ488。
  4. グルタミン酸マイクロイオントフォレーシスは150mMのグルタミン酸で溶液を調製し、NaOHでpHを7.0に調整した。可視化のための50 -200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド(Invitrogen)を追加します。
  5. GABAのイオン導入は1 M GABA溶液を調製し、HCl 15を5にpHを調整する。このpH GABAが充電される時にのみ、それはイオントフォレーシスを用いて適用することができる。溶液中の低pHは細胞外空間に排出することに注意してくださいでは、GABA伝達自体16,17に影響与える可能性があります。
    年上の解決策は、その有効性を失うことができるので、光からGABAソリューションを保護し、頻繁に新鮮なGABAストック溶液を調製。
  6. それはGABA作動性イベント、ハイテクを参照することが困難である場合GH Cl -のドライビングフォース内部ソリューションは、塩化カリウムを除外するなどして、GABAトフォレーシスが機能しているかどうかを確認するGABA作動性のイベントを可視化するために役立つかもしれない、しかし、生理的な駆動力が推奨されることがありシナプス統合を検討する。小さ ​​なGABA作動性イベントの一般的な検出のために、 図8Cに示すプロトコルは助けることができます。

3。イオン導入ピペットを引いて、テスト

  1. 一般的には、右のピペットを引っ張ると多分制御、神経伝達物質のイオン導入を達成するための最も重要なステップです。細胞培養においてイオントフォレーシスを使用する場合は、鋭い微小電極10と同様の非常に微細な電極をプルすることができる。それらは角度で組織に下降しているときに、急性スライスにおけるパッチクランプ実験では、しかしながら、これらの非常に薄いピペットは不可能深い樹状突起に到達すること、スライス面上に曲げる。
  2. したがって、そう、非常に小さなチップでピペットを引くこといいえNeurotransmitterは漏れることができますが、先端はまだ組織( 図2)に侵入するのに十分な剛性でなければならない。またはP-97プーラー、サター器械の会社、例えば、150ギガバイトF 8Pクラスピペット(科学製品、ホフハイム、ドイツ)と水平プラー(例えばDMZ-ユニバーサルプーラー、ザイツ·インスツルメンツ社、マルティンス、ドイツ使用、急な角度( 図2および表2)を用いて小開口ではなく、短いタッパを達成するために、いくつかの引上げ工程とノヴァト、カリフォルニア州)。
  3. 10イオン導入ピペットをプルする石英ガラスピペットを使用することも可能である。これらは、良好な機械的特性を有するように、より信頼できるものと想定しているが、特殊なレーザ引き手が必要である。しかし、それは通常、パッチピペットを引っ張るために使用される通常のガラスピペットで良好な結果を達成することも可能である。
  4. 最初にのためにそれらを使用する前に、組織なしでチャンバー内ピペット性能と抵抗をテスト時間は、グルタミン酸の漏洩以来、組織に悪影響を及ぼす可能性がある。
  5. 正しくイオントフォレーシスアンプを設定します。その後、神経伝達物質と染料を含む溶液をピペットを記入し、お風呂(ACSF)にそれを置きます。
  6. 容量( 図3)を補う。通常、非常に鋭いピペットは鈍いものより高い容量を持つことになります。
  7. ピペットの抵抗をチェックします:ここで使用マイクロイオントフォレシスアンプはピペットの抵抗を測定するためのビルドの機能があります。これは、標準的なオシロスコープまたは集録ソフトウェアを使ってコンピュータに接続されたA / Dボードで監視することができます簡単な長方形のテストパルスを、呼び起こす。形状とチップサイズに応じて、先端が25間の抵抗を持っている必要があります - MΩ90。
  8. ピペットチップの外に蛍光染料が漏れた場合は60Xまたは40X水浸対物レンズと蛍光イメージングへのスイッチで可能であれば先端に焦点を当て、ズームイン、(GLUの場合は小さな正を適用玉手)または負は(GABA、 図4の場合)(<0.02μA)現在保持している。それが漏れをキャンセルするために役立つていない場合は、ピペットを変更してください。
  9. 強力なステップ電流を適用するか、手動トリガを使用し、溶液をピペットの外に排出することができるかどうかを確認するために蛍光画像で先端を監視します。上述したように、パルス電流の極性が吐出されることになっている分子の電荷に依存している。グルタミン酸を取り出すには、それは負の電流とGABAのために正の電流( 図4)である。
  10. 染料と送信機のブロック吐出を、高い排出現在の数倍を適用することによってクリアすることができますことをピペット内の空気が泡。
  11. そこには目に見える漏れはありませんし、テスト排出が成功した場合、一緒になって、静電容量を補償し、実験を開始します。
  12. 注意:容量補正は、フィードバック回路により達成されるので、それがovercompであれば、この回路はオーバーシュートや発振することができるensated。優しく容量補正のダイヤル設定を使用します。
  13. フィラメントのプロパティを変更しているかもしれないので、プーラー安定性に応じて、それは、時には随時プラー設定を調整する必要がある。一旦良好なピペットが設計されれば、それは数日間使用することができる。したがって、実験を終えた後、先端に損傷を与えることなく、密閉容器にイオン導入ピペットを格納します。
  14. 次の実験では特性( 例えば抵抗)が大幅に変更する場合は先端をクリアしてから、チェックするために、いくつかの強力なイジェクトパルスを印加する、神経伝達物質の溶液をピペットを埋める。その後、静電容量を補償して、再度ピペットを使用しています。別の神経伝達物質のソリューションを単一のピペットを使用しないでください。

4。脳スライスを準備

  1. マイクロイオントフォレーシスが初めて使用される場合間違いなく確実に作業プーラープログラムを確立した後、スライスを調製。
  2. <あなたの機関や地方自治体の動物ケアのガイドラインに従った李>行う麻酔と断頭手続き。
  3. 脳を除去した後、氷冷ACSF スクロース (プロトコル2.1を参照)に転送します。
  4. 適切な厚さ(例えば300μm以下)のスライスに関心領域をカットします。
  5. 30分間35℃でACSF スクロース内のスライスをインキュベートする。その後、室温で通常のACSFを含む水没保持室に転送します。
  6. 調製及び実験を通して95%O 2、5%CO 2でスライスを囲むACSFをcarbogenize。

5。ホールセル記録を確立する

  1. ホールセルモードを確立した後、長期的なポジショニングを回避するために、パッチを適用する前にセルをすでにスライス表面付近のイオントフォレーシスピペット(s)を配置します。
  2. 低抵抗パッチピペット(3 - mΩの5)を引き、dでそれを埋めるあなたがたは、内部の溶液を含有し、ピペットに正圧(30 - 60ミリバール)を適用します。
  3. 視覚的な指導の下、お風呂とアプローチセル(赤外線dodtコントラストまたは2つの光子のグラデーションのコントラスト画像)を入力します。
  4. 電圧クランプモードでのテストパルス( 例えば -10 mVで、20ミリ秒)とピペット抵抗を監視します。オフセット電位を修正する組織に触れたとき。
  5. セルに近づくと "ディンプル"ははっきりと見ることができるようになるまで静かにそこにピペットの先端を押してください。 60ミリバール負圧にし、-65 mVまで膜電位を切り替える - 直ちにピペットの圧力を解放し、40を適用します。
  6. 100 pAの下に現在の流域の値を保持する場合には、負圧を解放します。
  7. ギガシールを確立した後(抵抗> 1GΩ)、ピペットまたはキャパシタンス補償回路の簡単な過補償に短い、強力な吸引と破裂膜。
  8. どのモードに応じて(電圧または電流クランプ)が必要です実験的なデザインのため、適切に補う。
  9. その最終的な位置にイオン導入ピペットを持って開始します。成功したパッチクランプ記録を実行する方法の詳細な説明が必要な場合は、18,19利用可能ないくつかの優れたガイドラインがあります。

6。イオン導入ピペットを置き、シナプス後イオン導入の可能性を生成する

  1. 一般的には、イオン導入イベントはGABAマイクロイオントフォレシス用ソーマや軸索イニシャルセグメント、樹状シャフトで、グルタミン酸マイクロトフォレーシス用のとげの樹状突起で、例えば、所望の実験に応じて定義されている場所で誘発することができます。
  2. それに触れずに1μm程度の距離にセルをアップアプローチ。興味のある位置に到達した後、それは神経伝達物質が漏れ出していないし、ピペット容量が正しく補正されていることをしていることが重要です。
  3. イオン導入pipettいっぱいグルタミン酸を細胞に近づいた場合eは膜電位の検出可能な脱分極を引き起こし、可能であれば現在の保持、またはピペットを変え調整します。
  4. 、短い負の電流パルスを印加ゼロから開始し( 例えば 0.1から0.4ミリ、0.01から1μAパルス)系統的に電流を増加。これは、イオン導入、現在は、特定の実験のセットアップに必要な反応を呼び起こすどの範囲で調べるのに役立ちます。
  5. 無応答検出がない場合は、ピペット数百μmを持ち上げ、先端をきれいにする(> 0.1μA)強いイジェクト電流を適用する。 、静電容量を補正して、細胞に近づき、再度実行してください。
  6. 応答がまだ存在しない場合、現在保持して減らす。この手順は、制御不能な神経伝達物質の放出を引き起こす可能性がありますので、ダイヤル設定と非常に注意してください。したがって、常に膜電位の各変化を検出するために記録を監視します。
  7. それはGABA作動性イベントを検出することは困難である場合には、人が使用することができるnの内部溶液組成は、高い塩素で降伏-駆動力を。ピペット溶液中の濃度(プロトコルセクション2.6を参照してください) -これを達成するために、塩素を減らす。これは、より高い駆動力によって静止膜電位で大きくGABA作動性イベントが発生します。
  8. また、-48 mVの( 図8C)に-100 mVの膜電位からのチャンスをもたらし長時間電流ステップを注入。このプロトコルClで-駆動力が脱分極GABA応答を引き起こす過分極電位に上昇する。
  9. それは、イベントのGABA作動性を決定するのに役立ち誘発事象の逆転電位を決定する工程電流注入プロトコルを使用することも可能である。 GABAの漏れ、グルタミン酸の漏洩よりも検出が困難である。この場合には、入力抵抗の一定の監視がGABA充填されたピペットに近づくとき、助けることができる。入力抵抗が減少した場合、電流およびBを保持するeが増加又は異なるピペットを使用すべきである。
  10. グルタミン酸イオントフォレシス用対照実験として、我々は200μMOGB-1とグルタミン酸をリークが原因である可能性があり、ローカルカルシウム流入を可視化するピペット溶液のないEGTAを用いて、Ca 2 +のイメージング実験を示唆している。
  11. 一般的に、安定した応答を達成するためには、経時的ドリフトを避けるために、機械的に安定なピペットを持っていることは非常に重要である。ドリフトは、温度変化が原因で発生することができ、したがって、それは、熱ドリフトを回避するための機器で測定する前に、少なくとも半時間を切り替えることをお勧めします。ピペットホルダーとチップで良いカートリッジシールを必ず使用して実際に固定されています。ホルダー自体はさらにテフロンテープで固定することができ、さらに、また、ドリフトの潜在的な源であるヘッドステージやマニピュレータ、からのケーブルには緊張感がないことを確認してください。

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Representative Results

イオントフォレーシスの空間的な広がりを決定する簡単な方法は、排出されたグルタミン酸を一定に保ちながら、デンドライトから段階的にイオン導入ピペットを後退させることである。我々は、マイクロイオン導入刺激の空間的な範囲は約12ミクロン( 図1半径を示す)の直径を持っていたことが分かった。どのように深部組織にイオン導入を使用することができるピペットの剛性に依存します。しかし、ここで使用されるスライス( 図2)における実験のために必要なイオン泳動ピペットは、侵入の深さを限定するものではない。むしろ光学系と脳スライスの深さで減少分解能が制限要因である。良質の録音のためにそれは送信機がピペットの外に漏れていないことが重要です。ベースラインが急になった場合、デンドライトがピペットチップに近づいた場合や急激な脱分極がある場合、グルタミン酸の場合には、漏れを識別することができる不安定( 図5)。安定した記録を確立した後、それが樹状ツリー( 図6)を通して任意の場所で、この技術を用いて定義された振幅、樹状スパイクまたは活動電位のEPSPのを喚起することが可能です。高速マイクロイオン導入とグルタミン酸を適用することにより、EPSPSがプロパティ、それらの伝播と総和は、同時に異なるさえ遠い場所で、( 図7)調査することができる。そして正の電流取り出し:GABA作動性イベントが高度に濃縮されたGABA溶液(プロトコルセクション2を参照)イオン導入ピペットを充填することにより、第2ピペットを用いてグルタミン酸に単独で、または加えて誘発することができる。イベントのGABA作動性を確認し、高い駆動力内部溶液を使用しない場合は、検出するGABA作動性のイベントを容易にするために単純なプロトコルがあります:負の電流(約1秒注入し、振幅はの入力抵抗に依存しセル)hyperpolarising VOになる間電圧ステップ、-100 mVの周りから始まり、その後、5 mVステップ( 図8)に増加。非常に負電位でGABA作動性イベントが高い駆動力により、検出することが容易である。信号が計算された塩素を中心リバース場合-ソリューションの逆転電位、それは彼らが( 図8)自然の中でGABA作動性である可能性が非常に高いです。 additional GABAマイクロピペットイオン導入によって、それは、樹状スパイクとIPSP( 図9)の相対的なタイミングを変化させることにより、樹状ナトリウム/カルシウムスパイクのように、例えば、グルタミン酸イベントのGABA作動性抑制の効果を調べることが可能である両方のイベント、またはそれらの振幅の相対位置。 (全ての動物実験は、動物のケアのガイドラインに沿って実施し、ボン大学、神経変性疾患および状態ノルト·ウェストファリアのドイツ語センターの委員会を使用していた。)


図1。ピペット撤回によって決定イオン泳動排出グルタミン酸の空間的範囲。 100μMアレクサ594と初期位置(スケールバーは8μm)でイオン導入ピペットでいっぱいCA1錐体細胞の樹状突起の二光子画像の最大値投影。挿入図は、イオン導入ピペットとソーマで記録対応するイオン導入EPSPの収縮を示しています。矢印は、イオン導入ピペットチップの位置を示します。イオン導入ピペットチップの初期位置(≤1程度離れて樹状突起、N = 6の分岐から)に対してEPSP振幅のB)の距離依存性。これで、私たちは、体系後退ピペットによって広がるグルタミン酸の半径を見積もることができます。挿入図の代表例トレース。エラーバーは表す平均±SEM。 (ミュラーから適応。2012 9、エルゼビアの許可を得て転載)。

図2
図2。どのようにイオン導入ピペットは次のようになります。イオン導入ピペットの赤外線CCDイメージ60X対物レンズを用いてスケール。B)イオン導入ピペット60X対物レンズを用いて小さな5.5MΩパッチピペットに比べ。キャリブレーション:最小=10μmである。

図3
図3。テストパルス(10 NA、10ミリ秒、NPI電子、タム、でビルドを使用してイオン導入ピペットの容量補正ドイツ)。右ピペット抵抗を監視し、迅速かつ正確な神経伝達物質の適用を確実にするために正常に静電容量を補償することが重要である。

図4
図4。マイクロイオン導入の原理。全細胞パッチクランプの構成とグルタミン酸に満ちイオン導入ピペットでCA1錐体ニューロンのA)の模式図。グルタミン酸に悪影響をピペットに適用された正の電流がピペットから漏れるそれを維持するため、充電されている:電流が正である(左のパネル)を保持。ピペットからグルタミン酸を取り出すには、負の電流を適用(右パネル)。この方法ではグルタミン酸はピペットから強制され、シナプス後細胞における興奮のイベントを呼び起こすことができますB)Cの概略図全細胞パッチクランプの構成とGABAに満ちイオン導入ピペットでA1錐体ニューロン。 GABAは、積極的に低pHで充電される。したがって、負の電流はピペット(左パネル)から漏れるからそれを維持します。取り出すにはGABA(右パネル)正の電流を適用します。このようにGABAはピペットから出て来て、シナプス後細胞における抑制性のイベントを呼び起こすことができます。

図5
図5。良い面と悪いイオン導入ピペット。 CA1錐体ニューロンの樹状突起の枝上で生成イオン導入グルタミン酸EPSPの代表例。B)イオン導入樹状スパイクの代表例は、ピペットチップからの継続的な軽度のグルタミン酸漏れ海馬のCA1領域に樹の枝を生成しました。

図6
図6。シングルグルタミン酸マイクロトフォレーシス用の代表的な結果。パッチを適用したCA1錐体ニューロンの模式図とイオン導入ピペットはグルタミン酸でいっぱい。B)EPSPは、グルタミン酸イオン導入とのCA1錐体ニューロンに誘発。C)は、樹のNa + / Ca 2 +のスパイクはCA1錐体の近位樹状突起に誘発ニューロン、下のトレースは、電圧トレースの傾きを示し、ピークが樹状スパイクのピーク傾きを示している。D)は活動電位のしきい値を超えるまで、EPSPの振幅が大きくなりイオン導入に印加される電流を増やす場合。

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図7。樹状ツリー上の異なる場所でダブルグルタミン酸マイクロトフォレーシス用の代表的な結果。それぞれパッチを適用したCA1錐体ニューロンと2イオン導入ピペットグルタミン酸で満たされ、近位に位置している、および遠位樹状突起の概略図、CA1錐体ニューロン(1)の近位樹状突起に誘発。B)イオン導入EPSP。 C)イオン導入EPSPは、遠位樹状突起(2)で誘発。

図8
図8。 GABAマイクロトフォレーシス用の代表的な結果。パッチを適用したCA1錐体ニューロンとGABAに満ちイオン導入ピペットの概略図。B)イオン導入IPSP)がCA1錐体ニューロン。Cの近位樹状突起上で体系的に-400 PAから誘発イベントの逆転電位(現在の注射を決定するために、パッチピペット経由CA1錐体ニューロンへの振幅を変えるロング注入電流を誘発0〜PA)。アーティファクトはGABAイオン導入の時間ポイントを示します。誘発イベントは約-70 mVの(矢印)の逆転の可能性があることを示します。

図9
図9。同時グルタミン酸と抑制と興奮の統合を検討するGABAイオントフォレシスの代表的な結果。 A)パッチを適用した錐体ニューロンとグルタミン酸(緑)とし、GABA(オレンジ)と上に充填した1ピペットの模式図。B)は、イオン泳動誘発独り樹スパイクは、後続の掃引に、より低いトレースはdV / dtが、ピークが樹状スパイクを示す表示されます。C)イオン泳動。D)の両方、グルタミン酸とGABA作動性のイベントは一緒に一人でIPSPを誘発。

位置特異性 トランスミッタ特異 毒性/副作用 シナプス前刺激 長期実験 コスト/複雑さ
マイクロイオン導入 + + + + + + + - + + + +
2光子アンケージング + + + + + + + - + +
シナプス刺激 - - + + + + + + + + + + ++

表1。異なる技術の比較ニューロンを刺激するための手法の長所と短所は、異なる基準に従って。( - =悪い、+ =ではない最適な、+ + =良好、+ + + =最良)。

パッチピペット イオン導入ピペット
P()シングルプルのプリプル 最後プルP(B) プリプルP()シングルプル 最後プルP(B)
ヒートH 700 480 510 600
フォースプリプルF(TH) 018 035 018 008
距離閾値S(TH) 017 012 025 015
ディレイHeatstop T(H) 050 030 050 030
距離Heatstop秒(H) 030 000 030 000
遅延F(F1) 000 136 000 050
1 F1を引いて強制 000 065 200 400
距離プル2秒(F2) 000 005 000 001
2 F2を引いて強制 000 080 000 095
調整(AD) 121 000 121 000

表2。例示プラープロトコル。水平プラー用(DMZ-ユニバーサルプーラー、ザイツ·インスツルメンツ社、マルティンス、ドイツ)、パッチおよびイオン導入ピペットの両方にGB150F-8Pフィラメントを(科学製品、ホフハイム、ドイツ)を使用。

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Discussion

ここでは、樹状突起上のシナプス統合を調査するために、神経伝達物質の高速マイクロイオントフォレシスを適用する方法を説明します。この技術は、正常in vitroおよびin vivo 9,20-22 異なる脳領域におけるグルタミン酸とGABA作動性シナプス伝達を調査するために使用されている。マイクロイオントフォレーシスは60年以上も使用されてきたが、初期の頃には主に、ローカルまたは中間遅いタイムスケール23又はセル24内の物質のマイクロインジェクションのための神経伝達物質や薬物を適用するために使用した。

マイクロイオン導入は、高抵抗電極10,11の高速容量補正が装備されているアンプの導入以来樹統合を研究するために特に興味深いツールになりました。この改善で、それはRESEシナプス応答の結果について簡単に長方形のイオン導入電流を適用することが可能になったより現実的にシナプスのイベント10,25の時間経過をmbled。

マイクロイオントフォレシスを確立するときに、対処するための技術的要件と難しさは何ですか?イオン導入アンプは細かいイオン導入ピペットの高い静電容量の補正を可能にすることが必要である。高抵抗微小電極と一緒に高速動作が必要な場合は、容量の補償の正確な調整が非常に重要である。補償されていない浮遊容量は、測定器によって供給されイオン泳動電流から充電し、そのため、アプリケーションを遅くしています。きちんと容量を補正すると、ビデオで詳細に不可欠と説明されています。さらに、光学系は組織の光損傷を誘発することなく、樹状突起とイオン導入ピペットの良い蛍光像を与えることが重要です。最適には、二光子システムを使用して、レーザパワーを低下させ、を極力互換性の滞留時間まともな画質。多くの従来の光源が使用される場合、機械的なシャッターを使用して、または電気トリガすることによって、例えば、できるだけ露光時間を短縮することを確認してください。おそらく最も重要な点は、使用される神経伝達物質の定義された特定のアプリケーションを可能にするピペットデザインです。このステップでは、最適な設定を見つけるためにいくつかの労力と時間を必要とします。ここでは、他の神経伝達物質、遮断または変調器が使用される場合、その物質は、それが充電されていることを非常に濃縮し、さらに重要なことが必要である、グルタミン酸およびGABAイオン導入のためのプロトコルを提供する。 GABAが0のpHでゼロの正味電荷を有するので、例えば、pHは正味の正電荷をもたらす、(プロトコル·セクション2を参照)を調整しなければならない。

マイクロイオントフォレーシスが確立されると、ニューロンにおけるシナプス統合を研究するために拡張されたツールセットを提供する。それは選択的で興味のあるシナプスを刺激することができます特定の神経伝達物質。定義された位置、シナプス後電流と電位で選択した神経伝達物質を使用し、その伝播を調べることができる。さらに、いくつかのグルタミン酸作動性入力の統合を調べるか、または系統的に相対的なタイミングやイベントの強度を変更し、同時に複数のイオン泳動電極を使用することが可能である。

いくつかの一般的な臨界点は、マイクロイオントフォレーシスを使用する場合に考慮されなければならない。マイクロイオン導入後の神経伝達物質濃度のプロファイルは、内因性のリリースとは異なります。 Murnickなど10はイオントフォレシスの先端から放出の速度(約1ミリ)はミリ秒(0.2秒)26の画分に発生した小胞からシナプスのリリースよりも大幅に遅くなる可能性があることが報告また、シナプス間隙へとからの拡散は、おそらくイオン泳動適用された神経伝達物質の濃度上昇と減衰を減速している。さらに、マイクロイオントフォレーシス10-12を用いて吐出される神経伝達物質の体積は高抵抗電極は、単一のグルタミン酸作動性及び後シナプスが、しかしながら、生理学的に放出されたボリュームよりも高くなる可能性がある活性化することができる。数マイクロメートルの範囲内の空間選択性はまた、最近神経伝達物質3,4,27の二光子アンケージングによって達成されている。

かなり多くのコスト集約的つつ、二光子アンケージングは​​、マイクロイオントフォレーシスを介していくつかの利点を有する。特に、それは、複数のシナプスのサイトで同時に神経伝達物質を放出するように、微細電極先端の正確な位置決めを必要とせずに使用することができます。しかし、それはまた、特定の実験方法を選択する際に考慮すべきいくつかの重要な欠点を有している。多くのケージド化合物は、神経伝達物質受容体28の遮断などの望ましくない副作用を有する。例えば、多くのグルタミン酸およびGABAケージGABA作動性阻害を妨害することが報告されている。また、二光子アンケージングに必要な比較的高いレーザパワーは刺激が数分間にわたって繰り返し適用される場合は特に、シナプス後ニューロンの光損傷につながる可能性があります。マイクロイオントフォレーシスを刺激部位の数に制限しながらさらに、これらの部位は異なる脳領域から層状シナプス入力をシミュレートするために、遠位および基底樹状突起上に、例えば、ニューロンの樹状突起全体ツリー上で自由に選択することができる。二光子アンケージングは​​、それが現在最もグループによって使用される、(典型的には40X又は60X水浸)を使用目的に依存し、特に焦点面および視野内のシナプス部位に限定される。これは、両方の技術は、常に結果の解釈をより困難にすることができる外受容体の活性化を導くことを考慮しなければならない。

マイクロイオントフォレーシスの別の欠点は、そのはoNLYはポストシナプスが活性化することができる。シナプス機能と小胞リリース神経伝達物質の役割は実験的にフォーカスを設定する必要がある場合は、地域の電気シナプスの刺激は、選択した方法であってもよい。しかし、マイクロイオン導入に比べ、電気シナプス刺激の欠点は活性化され、シナプスの未知の場所と潜在的に他の神経伝達物質システム( 表1)に属する別の神経細胞集団からの軸索の共同活性化されています。

要約すると、マイクロイオントフォレーシスの最も重要な利点は、いくつかの異なる神経伝達物質を使用し、例えば樹状突起9とニューロンのコンパートメントにそれらの相互作用を研究することが可能であることを、我々の見解である。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

我々は慎重に原稿を読み取るためのハンス·ライナー干拓、マーティン·フールマンとウォーカージャクソンに感謝します。 、神経変性疾患におけるセンター·オブ·エクセレンス(COEN、著者は、国家ノルト-ウェストファリア(SR)、計算論的神経科学におけるBMBF-ProjekträgerDLR米国ドイツコラボレーション(SR CRCNS)の研究MIWF省から提供された資金提供を受けた; SR)、およびボン大学学内資金調達プログラム(BONFOR; SR)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany  
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA  
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent  
60X Objective, NA 0.9 Olympus  
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany  
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA  
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany  
  Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

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References

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