Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La découverte de l'augmentation de l'infiltration des macrophages dans le tissu adipeux (AT) de rongeurs obèses et les humains a conduit à une intensification de l'intérêt de la contribution des cellules immunitaires à l'insulino-résistance locale et systémique. L'isolement et la quantification des différentes populations de cellules immunitaires dans minces et obèses AT est maintenant une technique couramment utilisée dans les laboratoires de immunometabolism; soins encore extrême doit être pris à la fois dans l'isolement des cellules vasculaires stromales et dans l'analyse de cytométrie en flux de sorte que les données obtenues sont fiables et interprétables . Dans cette vidéo, nous démontrons comment mâche, digérer, et d'isoler la fraction vasculaire enrichie en cellules stromales immunitaire. Par la suite, nous montrons comment les macrophages de l'étiquette d'anticorps et des lymphocytes T et la manière de porte correctement sur eux des expériences de cytométrie en flux. Représentant parcelles de cytométrie de flux de matières grasses nourris gras nourris obèses souris maigres et élevé sont fournis. Un élément essentiel de cette analyse est l'utilisation d'anticorps qui nepas de fluorescence dans les canaux où AT macrophages sont naturellement autofluorescente, ainsi que l'utilisation des contrôles de compensation appropriées.

Introduction

Historiquement, le tissu adipeux (AT) a été considéré comme un organe inerte de stockage des lipides, qui se dilate et se contracte en réaction à l'équilibre énergétique. Nous comprenons maintenant que AT représente un organe endocrine qui sécrète dynamique activement un certain nombre d'hormones, qui influent directement sur le comportement alimentaire et l'homéostasie du glucose systémique. En outre, au cours de la dernière décennie, il ya eu une appréciation croissante pour les nombreuses populations de cellules immunitaires résidant dans l'AT fraction stroma vasculaire (SVF), ainsi que leur contribution à AT homéostasie.

La capacité de séparer le AT adipocyte et SVF en utilisant une collagénase digest suivie par centrifugation différentielle a d'abord été décrit par Rodbell en 1964 1. Collagénase II est le plus souvent utilisé pour la séparation des adipocytes et SVF pour cause de maintenance de récepteurs de l'insuline des adipocytes 1. Dès le début, le fractionnement enzymatique de AT a été principalement utilisé pour étudier adipoCyte métabolisme et d'isoler les pré-adipocytes. Plus récemment, cette technique, combinée avec la large disponibilité des cytomètres et le nombre sans cesse croissant d'anticorps conjugué à un fluorophore disponibles dans le commerce, a facilité la caractérisation des cellules immunitaires AT.

Bien que la présence de cellules immunitaires dans enflammée AT avait été décrit précédemment 2, les articles fondateurs de Weisberg et al. et Xu et al. publié en 2003 furent les premiers à documenter l'accumulation de macrophages AT (GAB) dans l'obésité, qui sécrètent des cytokines inflammatoires et en corrélation avec la résistance à l'insuline AT-spécifique et systémique 3,4. Ces observations ont servi de base d'un nouveau champ d'investigation récemment inventé, "immunometabolism," 5 et ont été suivies par des études impliquant différentes populations de cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques, les mastocytes 6 7, 8 cellules T -10, les cellules B, les cellules NKT 11 12 13, les éosinophiles, les neutrophiles et 14,15 dans le développement de l'obésité associée à une résistance à l'insuline.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la technique digest collagénase utilisée pour isoler les cellules de la SVF AT et de caractériser les guichets automatiques et AT cellules T via la cytométrie de flux. Ce protocole a été optimisé pour les souris AT; toutefois, les téléspectateurs peuvent bénéficier de la lecture d'un excellent article fournissant de nombreux détails sur l'optimisation de cette technique pour l'homme à 16 ans. Le public cible de cet article comprend des enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec la souris à effectuer et cytométrie de flux. Plusieurs considérations pratiques pour équilibrer le rendement et la viabilité cellulaire avec le temps et les ressources sont présentées ainsi que des contrôles de cytométrie de flux optimales pour caractériser les populations de cellules immunitaires. En plus de notre protocole, les lecteurs sont referred à un article de JoVE récente par Basu et al. pour une excellente discussion de quelques-uns des aspects techniques de cytométrie en flux pour inclure des contrôles et des compensations adéquates 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Réactifs et Consommables

Avant de lancer ce protocole expérimental, préparer les réactifs suivants:

  1. Éthanol à 70%
  2. PBS 1X
  3. 1X DPBS (sans Ca et Mg) supplémenté avec 0,5% de BSA
  4. FACS tampon: 1X DPBS (sans Ca et Mg), EDTA 2 mM, et 1% de SVF
  5. Tampon ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 et 0,1 mM Na 2 EDTA dans l'eau

2. La récolte et la préparation du tissu adipeux

  1. Euthanasier les souris selon des procédures IACUC approuvées propres à chaque institution.
  2. Bien mouiller le pelage avec de l'éthanol à 70%.
  3. Faire une incision au niveau de l'appendice xiphoïde (partie inférieure du sternum) et ouvrir la cage thoracique pour exposer le cœur, en prenant soin de ne pas couper tous les principaux vaisseaux sanguins.

Remarque: À ce stade, il est également utile de laisser le diaphragme intact autant quepossible et à faire une entaille sur le côté droit de la cage thoracique pour permettre au sang et perfusat de s'écouler hors de la cavité thoracique.

  1. Coupez l'oreillette droite pour permettre au sang et perfusat d'échapper au système circulatoire.

Remarque: Lorsque vous traitez avec des souris obèses, l'excès de péricardiques AT devra peut-être être enlevé pour permettre l'accès au cœur.

  1. Saisir le cœur avec une pince et insérer doucement une aiguille dans le ventricule gauche par le sommet. Perfuser lentement la souris avec 15 ml de PBS stérile.

Note: réduire le taux de perfusion si les poumons commencent à se remplir et se développer.

  1. Ouvrez la cavité péritonéale et retirer les coussinets adipeux perigonadal utilisant soin d'éviter les tissus gonadiques.
  2. Placez coussinets adipeux dans un bateau pèse sur la glace contenant 2 ml 1X DPBS (sans Mg, Ca) complémenté avec 0,5% de BSA, et émincez l'AT en petits morceaux.

Note: Limitez la quantité d'AT par bateau pèse 1,2 g. Si le montant de AT dépasse 1,2 g, diviser uniformément entre deux pesées bateaux.

  1. Conserver à des échantillons sur la glace et préparer la solution 3 ml de collagénase digest par AT échantillon constitué de 1X DPBS complété avec 0,5% de BSA, 10 mM CaCl 2 et 4 mg / ml de collagénase de type II.

3. digestion à la collagénase

  1. Transfert AT à 50 ml tubes coniques en versant le broyat et le rinçage du bateau peser avec 1 ml de DPBS (BSA à 0,5%) et la solution 3 ml de collagénase II digest.
  2. Incuber à broyat dans un shaker rotatif (200 rpm) à 37 ° C pendant 20 min.
  3. Ajouter 10 ml (DPBS 0,5% BSA) à tubes coniques et les placer sur la glace.
  4. Triturer homogénat de nombreuses fois à l'aide d'une pipette sérologique 10 ml, et de passer des suspensions cellulaires à travers le filtre 100 um dans un nouveau tube conique de 50 ml.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 10 min à 4 & Dpar exemple; C.
  6. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans 3 ml de tampon ACK lyse contaminer les érythrocytes.
  7. Ajouter 12 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C.
  8. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS.

Remarque: Utilisez la taille du culot cellulaire comme un guide pour combien de tampon FACS pour remettre po Si le culot cellulaire recouvre le fond du tube conique de 50 ml, utiliser un tampon FACS 0,5-1 ml, sinon, remettre en suspension dans 0,25-0,5 ml.

  1. Placer les échantillons sur la glace et préparer les portions de dilution 1:10 de chaque échantillon pour le comptage des cellules en mélangeant 40 pi de tampon FACS, solution de bleu trypan 50 pi (0,2%), et 10 suspension cellulaire ul.
  2. Compter les cellules viables sur la base exclusion du bleu trypan et diluer les suspensions cellulaires à une concentration finale de 5-10 x 10 6 cellules / ml.

4. La coloration des antigènes de surface cellulaire

Ajouter anti-souris CD16/CD32 anticorps (bloc Fc) à une concentration finale de 0,5-1 μg/10 6 cellules et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  • échantillons de transfert (≥ 10 6 cellules) à 12 x tubes à fond rond de polystyrène de 75 mm. Préparer des tubes séparés si l'analyse des cellules T et DAB, et de combiner des cellules supplémentaires pour préparer un nombre suffisant de tubes pour accueillir la compensation requise et la fluorescence modifié Minus One (FMO) contrôles.
  • Note: Par exemple, lors de la quantification de la proportion de guichets automatiques basé sur F4/80 et CD11b, la rémunération suivante et contrôles FMO devra être préparé:

    - Non marqué (cellules)

    - DAPI ou l'iodure de propidium (PI) taches simples (cellules; n'ajoutent pas de colorant de viabilité jusqu'à l'étape 5.1)

    - F4/80 APC (cellules ou des perles de compensation) simples tache

    - CD11b FITC cellules ou simples tache (perles de compensation)

    - FMO 1 (cellules): Rat IgG2a κ isotype contrôle APC + CD11b FITC + colorant de viabilité (ajouté à l'étape 5.1)

    - FMO 2 (cellules): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype contrôle FITC + colorant de viabilité (ajouté à l'étape 5.1)

    1. Ajouter anticorps primaires fluorophores conjugués et / ou contrôles isotypiques à la concentration appropriée (voir le tableau des réactifs et du matériel).
    2. Protéger les échantillons de la lumière et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    3. Ajouter 2 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS 2 ml.
    5. Centrifugeuse cellule suspension 500 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension SVF culot cellulaire chez ≥ 400 pi de tampon FACS.
    6. Transférer des échantillons de 12 x 75 tubes à fond rond de polystyrène mm équipé d'un 35 um cellule passoire bustiers tubulaires.
    7. Protéger de conserver les échantillons lumière, et à 4 ° C jusqu'à l'analyse FACS.

    Note: Pour des résultats optimaux cellules doivent être analysées immeadiately; toutefois, l'analyse FACS avec ce protocole a été menée avec succès sur des cellules marquées stockées dans un tampon FACS pendant 1-2 heures à 4 ° C. Si les cellules doivent être fixés pour augmenter le temps de stockage, les cellules marquées peuvent être fixés à 2% de paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 heures avant l'analyse FACS. sociétés d'anticorps suggèrent que les cellules marquées peuvent être stockées pendant une semaine, mais cela n'a pas été testé dans le cadre de cette procédure.

    5. Analyse FACS

    1. Avant l'analyse FACS, ajouter colorant de viabilité des échantillons et des contrôles appropriés pour permettre la discrimination de cellules vivantes / mortes.

    Note: De nombreux colorants de viabilité sont disponibles dans le commerce, mais DAPI et PI sont recommandées en fonction de l'excitation / émission profiles de l'anticorps conjugué à un fluorophore étant utilisés. DAPI et iodure de propidium sont ajoutés à chaque échantillon à une concentration finale de 0,2 mg / ml.

    1. Utilisez un échantillon de contrôle négatif sans tache, de préférence des cellules isolées à partir du même tissu que les échantillons expérimentaux, pour ajuster la diffusion latérale (SSC) et diffusion vers l'avant (FSC) de sorte que la population cellulaire (s) d'intérêt sont sur la balance.

    Note: Pour l'analyse des AT cellules de la FSV, il est recommandé de SSC être affiché dans une échelle logarithmique en fonction de FSC dans une échelle linéaire. L'utilisation d'une échelle logarithmique pour SSC est particulièrement important lorsque l'on analyse les guichets automatiques, qui sont souvent très importantes et granulaire.

    1. Dessiner une grille de diffusion de la lumière initiale basée sur le type de cellule (s) en cours d'analyse, et d'ajuster le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l'extrême gauche d'un histogramme à un seul paramètre (environ centrée sur 10 2) pour les voies appropriées. </ Li>

    Note: Il est recommandé que les lymphocytes et les macrophages (ou d'autres cellules myéloïdes) être analysés séparément en raison de différences dans les auto-fluorescence.

    1. Utilisez des commandes simples ou colorés capture anticorps perles de compensation pour effectuer une compensation multi-couleur.

    Note: L'utilisation de billes d'indemnisation est recommandée; toutefois, la compatibilité de chaque anticorps doit être assurée. Par exemple, des perles de compensation peuvent pas de réaction croisée avec des anticorps de lapin, dans ce cas, les cellules isolées sont nécessaires pour obtenir un contrôle tache unique approprié.

    1. Réglez portes expérimentales basées sur les contrôles FMO modifiés.
    2. Réglez le cytomètre de flux pour recueillir le nombre approprié d'événements basés sur la prévalence de la population d'intérêt et enregistrer des données expérimentales.
    3. Les fichiers de données exportation FCS pour l'analyse hors ligne. Il existe de nombreux programmes disponibles pour cytometr de débitl'analyse des données y. Nous recommandons Cytobank, une plate-forme basée sur le Web qui permet aux investigatores pour stocker et analyser les données et de générer des chiffres depuis n'importe quel ordinateur avec accès internet 18. En outre, Cytobank offre la possibilité de rendre accessible données publiques ou restreindre l'accès à des collaborateurs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Collagénase digestion d'AT suivie par centrifugation différentielle a été utilisée pour isoler le SVF de coussinets adipeux épididymaires de souris C57BL/6J mâles nourris avec une faible teneur en gras (10% kcal provenant du gras) ou riche en graisses (60% kcal provenant du gras) régime (LFD et HFD , respectivement) pendant 16 semaines. Les cellules de la FSV ont ensuite été marquées avec des anticorps primaires fluorophore conjugué à quantifier la proportion de guichets automatiques viable (figure 1) et AT cellules T (Figure 2) par analyse FACS. Déclenchement initial, y compris diffusion de la lumière, de la discrimination doublet, et les portes de viabilité sont représentées dans les figures 1A et 2A. Il convient de souligner que la grille de diffusion de la lumière initiale à la figure 2A est limitée à la population de lymphocytes afin d'éviter notamment les cellules myéloïdes autofluorescentes. Un exemple d'utilisation modifié FMO contrôle pour définir portes expérimentales est représenté sur la figure 1B. Dans cet exemple, la F4/80 (colonne de gauche) et les anticorps CD11b (colonne de droite) sont remplacés par des contrôles isotypiques appropriés pour tenir compte de liaison autofluorescence et non spécifique. Portes Quadrant sont ensuite tirées d'identifier viable guichets automatiques (F4/80 + CD11b +). Déclenchement de CD4 + et CD8 + au niveau des cellules T est illustré à la figure 2B. Viable lymphocytes sont d'abord fermée pour TCRβ (colonne de gauche). Par la suite, les cellules TCRβ + AT T sont bloquées pour CD4 et CD8 (colonne de droite).

    Figure 1
    Figure 1. macrophages du tissu adipeux. L'SVF a été isolé à partir de l'épididyme AT de souris C57BL/6J mâles nourris avec un régime alimentaire faible en gras ou riche en graisses pendant 16 semaines en utilisant le protocole digest collagénase. Ultéquent, les cellules de la FSV ont été colorées pour F4/80 et CD11b et l'analyse FACS a été réalisée en utilisant un cytomètre de flux pour identifier les distributeurs automatiques de billets. (A) dispersion de la lumière initiale et portes de viabilité. (B) Mise à jour FMO contrôle incorporant des anticorps d'isotype pour F4/80 et CD11b ont été utilisés pour aligner quadrant portes. (C) Comparaison de la proportion de F4/80 + CD11b + guichets automatiques de la au bas de la souris nourries matières grasses et élevé. Cliquez ici pour agrandir la figure .

    Figure 2
    Figure 2. lymphocytes T dans les tissus adipeux. L'SVF a été isolé du tissu adipeux épididymaire de souris C57BL/6J mâles nourris avec une faible teneur en gras ou régime riche en graisses pendant 16 semaines en utilisant til protocole digest collagénase. Par la suite, les cellules de la FSV ont été colorées pour TCRβ, CD4, et CD8a et l'analyse FACS a été réalisée en utilisant un cytomètre de flux pour caractériser les cellules T AT. (A) dispersion de la lumière initiale et portes de viabilité. (BC) Comparaison de la proportion de TCRβ + cellules T (colonne de gauche) et des CD4 + et CD8 + T (colonne de droite) de l'AT de (B) faible en gras et nourri des souris en matières grasses (C). Cliquez ici pour agrandir la figure .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    L'intérêt croissant pour le rôle du système immunitaire dans les conséquences métaboliques de l'obésité a conduit à l'utilisation généralisée de la cytométrie en flux pour caractériser les cellules immunitaires de l'AT. Bien que le protocole exact variera entre laboratoires basés sur leur propre expérience et de l'équipement disponible, les étapes essentielles comprennent digestion à la collagénase, centrifugation différentielle, et la surface des cellules antigène étiquetage. L'objectif du présent article est de fournir un protocole détaillé et un guide pratique pour l'isolement de l'AT SVF aux enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec AT et / ou d'effectuer la cytométrie de flux.

    Comme avec n'importe quelle technique expérimentale, il existe de nombreuses variantes qui peuvent ou peuvent ne pas avoir une incidence significative le résultat souhaité. Basé sur notre expérience, le protocole détaillé ici représente le compromis le plus efficace entre temps, les ressources, le rendement cellulaire et la viabilité cellulaire. Par exemple, nous avons constaté que l'augmentation de ladurée de digestion de collagénase II à autant que 60 minutes à des concentrations similaires de la collagénase a un impact négligeable sur le rendement cellulaire; donc, nous utilisons une digestion de 20 minutes afin de réduire la durée d'exposition de la collagénase. Collagénase II est la collagénase plus couramment utilisé pour les digestions du tissu adipeux. Une description de toutes les différentes collagénases et leurs utilisations primaires peuvent être trouvées sur le site de Sigma. Les rendements cellulaires typiques du protocole ci-dessus sont 2-3 x 10 6 et 4-5 x 10 6 cellules / g à partir de souris nourries avec une faible teneur en gras (10% kcal provenant du gras) et riche en graisses (60% kcal provenant des graisses) pour 16 semaines respectivement. En plus de faire varier la collagénase digérer fois, il ya un certain nombre de modifications possibles à l'actuel protocole selon le modèle expérimental utilisé, y compris le traitement diététique. Tout d'abord, lors de la récolte AT de souris nourris avec un régime enrichi en acides gras saturés ou de cholestérol, éviter de garder les échantillons sur la glace avant hachage car la UneT va se solidifier et faire hacher difficile. Deuxièmement, notre protocole comprend une étape de lyse des érythrocytes (3,6), mais une perfusion initiale réussie rend souvent cette étape inutile. Troisièmement, il faut prendre soin de ne pas ajouter plus de 10 mM CaCl2 à la solution d'analyse de la collagénase (5 mM concentration finale), des concentrations supérieures de calcium peuvent entraîner la formation d'un précipité de phosphate de calcium. Si ce précipité se forme à la suite de l'étape de centrifugation initiale (3.5), ajouter deux étapes de lavage avec 20 ml de tampon FACS (contenant de l'EDTA) avant l'étape de lyse des érythrocytes pour éliminer le précipité. Quatrièmement, nous recommandons que les enquêteurs utilisent tout au moins un coussinet adipeux perigonadal lorsqu'on isole le SVF. Nous faisons cette recommandation n'est pas à cause des limitations de rendement cellulaire, mais parce que les différentes populations cellulaires afficher différentes distributions régionales 19. Ainsi, les résultats peuvent être biaisés lorsque seulement une partie du coussinet adipeux est perigonadal noused à isoler les cellules immunitaires résidant dans le AT. Si l'ensemble de coussinet adipeux est plus grande que 1,2 gramme, diviser le tissu adipeux longitudinalement à partir de l'extrémité rostrale à caudal. Si divisée en deux cette façon, chaque semestre devrait fournir une population représentative des cellules et ne doit généralement être inférieure à 1,2 grammes. Toutefois, dans le cas où cela est encore plus de 1,2 grammes, nous vous recommandons d'effectuer des digestions de la collagénase de 1,2 gramme segments dans des tubes séparés, puis en combinant toutes les cellules de la FSV pour la cytométrie en flux. En outre, les souris maigres, il peut être nécessaire de combiner les coussinets adipeux de 2 ou 3 souris pour obtenir des cellules FSV assez pour l'analyse par cytométrie de flux. La nécessité d'une souris supplémentaires devraient être pris en compte lors de la conception des expériences. Enfin, une autre façon d'afficher les données est le nombre de cellules par gramme de tissu. Si la densité cellulaire est souhaitée, l'AT doit être pesé avant le hachage et la digestion.

    En ce qui concerne la caractérisation AT cellules SVF par cytométrie de flux, deuxpoints méritent d'être soulignés. Tout d'abord, tous les anticorps primaires fluorophores conjugués devraient être validées pour une utilisation avec AT cellules de la FSV et correctement dosés. Même si nous avons démontré compensation avec des perles, nous avions déjà titré ces anticorps avec AT SVF. Lors de la caractérisation des macrophages, nous déconseillons l'utilisation de colorants en tandem (par exemple PE-Cy7), comme nous avons eu des résultats mitigés en ce qui concerne la liaison non-spécifique de GAB en utilisant des anticorps conjugués à ces colorants. En outre, les fluorophores tels que le PE et FITC doivent être utilisés uniquement après ajustement prudent de la manière décrite ci-dessus. Une liste des anticorps spécifiques, nous couramment utilisé pour caractériser AT cellules de la FSV avec des concentrations recommandées peut être trouvée dans le fournis dans le tableau 1. Deuxièmement, parce que les guichets automatiques exposition forte autofluorescence et un certain nombre d'anticorps affichent un faible niveau de liaison non spécifique lorsqu'il est utilisé à une concentration élevée, nous recommandons l'utilisation de modification FMO contrôle pour définir portes expérimentales.FMO contrôles sont générés par coloration d'un ensemble d'échantillons de contrôle avec tous sauf l'un des anticorps utilisés pour étiqueter les échantillons expérimentaux 20. Nous avons modifié les commandes FMO dans notre protocole pour remplacer l'un des anticorps avec un contrôle isotypique fluorophore conjugué approprié plutôt que de simplement le supprimer. Dans la pratique, il peut être acceptable de renoncer à des contrôles FMO pour les anticorps qui assurent une séparation exceptionnelle entre les populations positives et négatives. En plus de ces contrôles, vous noterez que, avant déclenchement sur les anticorps, nous avons présélectionné pour les populations de lymphocytes et de macrophages basé sur prodiffusion et de côté. Cela permettra d'éliminer la détection des macrophages autofluorescentes lors de l'analyse des populations de lymphocytes avec des fluorophores tels que le FITC et colorants tandem.

    Bien que les protocoles détaillés sont au-delà de la portée de cet article, la technique d'isolation décrit sert une première étape importante pour de nombreuses techniques visant à caractèreterizing cellules immunitaires résidant dans l'AT. Par exemple, l'isolement au-dessus et le protocole de coloration peuvent être utilisés pour faciliter le tri des populations spécifiques à partir de laquelle l'ARNm peut être isolé pour analyser l'expression des gènes. En outre, de simples modifications au protocole peuvent être faites pour permettre un traitement ex vivo des guichets automatiques. Ces modifications incluraient en utilisant des techniques stériles pour obtenir le SVF, qui sera ensuite lavé deux fois et remis en suspension dans un milieu de culture de cellules appropriées. Plutôt que d'ajouter des anticorps conjugué à un fluorophore pour colorer les antigènes de surface cellulaire, le SVF peut être ajouté à des plaques de culture de tissus non traités pour enrichir les guichets automatiques via adhérence plastique (bien que cela ne peut être prétendu être une population pure comme les fibroblastes et les pré-adipocytes peuvent également adhérer ). Ceci est accompli par la culture de la SVF pour 2-4 heures à 37 ° C suivie de deux étapes de lavage pour éliminer les cellules non-adhérentes. GAB peut alors être traitée en conséquence et récolté à l'aide d'une dissociation des cellules EDTA basée sortetion de la cytométrie en flux ou lysées dans du tampon RIPA Trizol ou pour l'isolement d'ARN ou de protéines, respectivement. Indépendamment de la demande en aval, la technique digest collagénase pour isoler adipocytes et des cellules FSV première décrits par Rodbell en 1964 1 continue d'être un outil précieux pour la caractérisation des AT cellules immunitaires et leur contribution aux conséquences métaboliques de l'obésité.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Nous n'avons rien à révéler.

    Acknowledgements

    JSO est soutenu par une NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de l'American Diabetes Association (7-10-MI-05), et AHH est soutenu par une bourse de chercheur de l'American Heart Association Établi (12EIA8270000). expériences de cytométrie de flux ont été réalisées dans le MVC cytométrie en flux ressource partagée. Le MVC cytométrie en flux ressource partagée est soutenue par la Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
    2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
    3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
    4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
    5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
    6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
    7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
    8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
    9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
    10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
    11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
    12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. 1143-1152 (2012).
    13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
    14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
    15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
    16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
    17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
    18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
    19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
    20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics