Isolering af fedtvæv immunceller

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fedtvæv (AT) er et site for intens immun celle aktivering og interaktion. Næsten alle celler i immunsystemet er til stede i AT og deres forhold ændres ved fedme. Korrekt isolation, kvantificering og karakterisering af AT immun cellepopulationer er afgørende for at forstå deres rolle i immunometabolic sygdom.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Opdagelsen af ​​øget makrofaginfiltration i fedtvæv (AT) af fede gnavere og mennesker har ført til en intensivering af interesse i immun celle bidrag til lokal og systemisk insulinresistens. Isolering og kvantificering af forskellige immun cellepopulationer i lean og fede AT er nu en almindeligt brugt teknik i immunometabolism laboratorier endnu ekstrem forsigtighed skal træffes både i stromal vaskulære celle isolation og i flowcytometrianalyse så de indhentede oplysninger er pålidelig og fortolkelige . I denne video viser vi, hvordan man hakkekød, fordøje og isolere immun celle-beriget stromal vaskulære fraktion. Efterfølgende viser vi, hvordan antistof label makrofager og T-lymfocytter, og hvordan man korrekt gate på dem i flowcytometri eksperimenter. Repræsentative flowcytometri plots fra fedtfattig-fodret magert og højt fedtindhold-fodret overvægtige mus leveres. Et kritisk element af denne analyse er anvendelsen af ​​antistoffer, der gørikke fluorescerer i kanaler, hvor AT makrofager er naturligt autofluorescerende, samt brugen af ​​ordentlig kompensation kontrol.

Introduction

Historisk har fedtvæv (AT) blevet set som et indifferent organ af lipid opbevaring, som udvider sig og trækker i respons på energibalancen. Vi forstår nu, at AT repræsenterer en dynamisk endokrint organ, der aktivt udskiller en række hormoner, som har direkte indflydelse spiseadfærd og systemisk glukose homøostase. Derudover er der i det sidste årti har været en stigende forståelse for de talrige populationer af immunceller bosiddende i AT stromal vaskulære fraktion (SVF), samt deres bidrag til AT homeostase.

Evnen til at adskille AT fedtcellerne og SVF med en collagenase fordøjelse efterfulgt af differentiel centrifugering blev først beskrevet af Rodbell i 1964 1. Collagenase II er oftest bruges til fedtcellerne og SVF separation på grund af vedligeholdelse af adipocyt insulin receptorer 1.. Tidligt, enzymatisk fraktionering af AT var primært ansat til at studere adipoCYTE metabolisme og at isolere præadipocytter. På det seneste har denne teknik, kombineret med den udbredte tilgængelighed af flowcytometre og det stadigt stigende antal kommercielt tilgængelige fluoroforen-konjugerede antistoffer, lettet karakterisering af AT immunceller.

Selv om tilstedeværelsen af immunceller i betændt på havde tidligere blevet beskrevet 2, seminal papirer Weisberg et al. og Xu et al. blev offentliggjort i 2003, var den første til at dokumentere ophobning af AT makrofager (ATM) i fedme, som udskiller inflammatoriske cytokiner og korrelerer med AT-specifikke og systemisk insulinresistens 3,4. Disse observationer dannede grundlag for et nyt felt for efterforskning nyligt opfundet, "immunometabolism," 5 og er blevet fulgt op af undersøgelser implicerer forskellige immun cellepopulationer, herunder dendritiske celler 6, mastceller 7, T-celler 8 -10, B-celler 11, NKT celler 12, eosinofiler 13, og neutrofiler 14,15 i udviklingen af fedme associeret insulinresistens.

Målet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af collagenase fordøje teknik, der anvendes til at isolere celler af AT SVF og at beskrive pengeautomater og AT T-celler via flowcytometri. Denne protokol er optimeret til mus AT, dog kan seerne glæde af at læse en fremragende artikel yde omfattende detaljer om optimering af denne teknik til human AT 16.. Målgruppen for denne artikel indeholder efterforskerne med begrænset erfaring med at arbejde med musen på og udføre flowcytometri. Adskillige praktiske overvejelser til afbalancering cellulær udbytte og levedygtighed med tid og ressourcer præsenteres, samt optimale flowcytometri kontroller til at karakterisere AT immuncelletyper befolkninger. Ud over vores protokollen er læserne referred en nylig JOVE artikel af Basu et al. for en fremragende diskussion af nogle af de tekniske aspekter af flowcytometri til at omfatte ordentlig kontrol og kompensationer 17..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Reagenser og tilbehør

Før iværksættelse af denne forsøgsprotokol, forberede følgende reagenser:

  1. 70% ethanol
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBS (uden Ca og Mg) suppleret med 0,5% BSA
  4. FACS buffer: 1X DPBS (uden Ca og Mg), 2 mM EDTA, og 1% FCS
  5. ACK buffer: 150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, og 0,1 mM Na2EDTA i vand

2.. Høst og klargøring af fedtvæv

  1. Afliv mus ifølge IACUC-godkendte specifikke procedurer for hver institution.
  2. Grundigt våd pels med 70% ethanol.
  3. Lave et snit på niveau xiphoideus proces (nederste del af brystbenet), og åbn brysthulen at blotlægge hjertet, pas på ikke at afskære nogen større blodkar.

Bemærk: På dette tidspunkt er det også nyttigt at lade membranen intakt så meget sommuligt og at skære et hak ud af den højre side af brystkassen for at tillade blod og perfusatet for at strømme ud af brysthulen.

  1. Klem højre atrium for at tillade blod og perfusatet for at undslippe kredsløbssygdomme.

Bemærk: Når der beskæftiger sig med fede mus, overskydende perikardielle AT muligvis skal fjernes for at give adgang til hjertet.

  1. Tag fat i hjertet med en pincet og forsigtigt indsætte en nål i venstre ventrikel gennem spidsen. Langsomt perfundere musen med 15 ml sterilt PBS.

Bemærk: Reducer antallet af perfusion, hvis lungerne begynder at fylde og udvide.

  1. Åbn bughulen og fjern de perigonadal fedtpuder hjælp omhu for at undgå eventuelle gonadale væv.
  2. Placer fedtpuder i en vejer båd på is med 2 ml 1X DPBS (uden Mg eller Ca) suppleret med 0,5% BSA, og hakkekød AT i fine stykker.

Bemærk: Begræns mængden af AT per vejer båd til 1,2 g. Hvis mængden af ​​AT overstiger 1,2 g, deler det jævnt mellem to veje både.

  1. Opbevares ved prøverne på is og forberede 3 ml collagenase analyseopløsning per AT prøve bestående af 1X DPBS suppleret med 0,5% BSA, 10 mM CaCl2, og 4 mg / ml collagenase, type II.

3.. Collagenasefordøjelse

  1. Overførsel AT til 50 ml koniske rør ved at hælde homogenatet og skylning indvejningen båd med 1 ml DPBS (0,5% BSA) og 3 ml collagenase II analyseopløsning.
  2. Inkuber ved homogenat i et roterende rysteapparat (200 rpm) ved 37 ° C i 20 min.
  3. Tilføj 10 ml DPBS (0,5% BSA) til koniske rør og anbring på is.
  4. Tritureres homogenat adskillige gange med en 10 ml serologisk pipette og passere cellesuspensioner gennem 100 um filter i en ny 50 ml konisk rør.
  5. Centrifuger cellesuspensionen ved 500 xg i 10 min ved 4 & deg; C.
  6. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepelleten i 3 ml ACK buffer til lysering kontaminerende erythrocytter.
  7. Tilføj 12 ml FACS buffer og centrifugeres cellesuspensionen ved 500 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  8. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepelleten i FACS-buffer.

Bemærk: Brug størrelsen af cellepellet som en guide til hvor meget FACS buffer at resuspendere i. Hvis cellepelleten dækker bunden af 50 ml konisk rør, bruge 0.5-1 ml FACS buffer, ellers resuspenderes i 0,25-0,5 ml.

  1. Anbring prøverne på is og forbered 1:10 fortynding alikvoter af hver prøve til celletælling ved at blande 40 pi FACS buffer, 50 ul trypanblåt-opløsning (0,2%), og 10 pi cellesuspension.
  2. Tælle levedygtige celler baseret på trypanblåteksklusion og fortyndes cellesuspensioner til en endelig koncentration på 5-10 x 10 6 celler / ml.

4.. Farvning af celleoverfladeantigener

Tilføj anti-muse CD16/CD32 antistof (Fc blok) til en slutkoncentration på 0,5-1 μg/10 6 celler, og der inkuberes på is i 10 min.
  • Transfer prøver (≥ 10 6 celler) til 12 x 75 mm polystyren rundbundede rør. Forbered separate rør, hvis analysere pengeautomater og T-celler, og kombinere ekstra celler til at forberede et passende antal rør til at rumme den nødvendige kompensation og modificeret fluorescens minus én (FMO) kontrol.
  • Bemærk: Som et eksempel, hvornår vil kvantificere andelen af pengeautomater baseret på F4/80 og CD11b, følgende erstatning og FMO kontroller skal være forberedt:

    - Ufarvet (celler)

    - DAPI eller propidiumiodid (PI) enkelt plet (celler ikke føjer levedygtighed farvestof indtil trin 5.1)

    - F4/80 APC enkelt plet (celler eller kompensation perler)

    - CD11 FITC enkelt plet (celler ellerkompensation perler)

    - FMO 1 (celler): Rotte IgG2a κ isotypekontrol APC + CD11b FITC + levedygtighed farvestof (tilsat ved trin 5.1)

    - FMO 2 (celler): F4/80 APC + Rotte-IgG2b κ isotypekontrol FITC + levedygtighed farvestof (tilsat ved trin 5.1)

    1. Tilføj fluoroforen-konjugerede primære antistoffer og / eller isotype kontroller i den rigtige koncentration (se tabel af reagenser og materialer).
    2. Beskyt prøver fra lys og inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
    3. Tilsæt 2 ml FACS buffer og centrifugeres cellesuspensionen ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    4. Dekanter supernatanten og resuspender SVF cellepelleten i 2 ml FACS buffer.
    5. Centrifuger cellesuspension 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og resuspender SVF cellepelleten i ≥ 400 pi FACS buffer.
    6. Overfør prøver til 12 x 75 mm polystyren rund bund rør udstyret med en 35 um cellefilter rør toppe.
    7. Beskyt mod lys, og gem prøver ved 4 ° C indtil FACS analyse.

    Bemærk: For optimale resultater cellerne skal analyseres immeadiately, men har FACS-analyse med denne protokol blevet gennemført på mærkede celler, opbevaret i FACS-buffer i 1-2 timer ved 4 ° C. Hvis cellerne skal løses for at øge opbevaring tid, kan mærkede celler fikseret med 2% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 timer før FACS-analyse. Antistof-selskaber tyder på, at mærkede celler kan opbevares i op til en uge, men dette er ikke blevet testet i forbindelse med denne procedure.

    5.. FACS-analyse

    1. Forud for FACS-analyse, tilføjer levedygtighed farvestof til prøver og passende kontrol for at tillade levende / døde celler diskrimination.

    Bemærk: Talrige levedygtighed farvestoffer er kommercielt tilgængelige, men DAPI og PI anbefales afhængigt excitation / emission prof.Iles af fluoroforen-konjugerede antistoffer, der anvendes. DAPI og Propidiumiodid tilsættes til hver prøve ved en endelig koncentration på 0,2 mg / ml.

    1. Brug et ufarvet negativ kontrolprøve, fortrinsvis celler isoleret fra det samme væv som de eksperimentelle prøver at justere side scatter (SSC) og fremadrettet lysspredning (FSC), således at cellepopulationen (erne) af interesse er på skalaen.

    Bemærk: Til analyse af AT SVF celler, anbefales det, at SSC vises i en logaritmisk skala versus FSC i en lineær skala. Anvendelsen af ​​en logaritmisk skala til SSC er især vigtigt, når man analyserer pengeautomater, som ofte er meget store og granulat.

    1. Tegn en indledende lysspredning gate baseret på den type af celle (r), der analyseres, og juster fotomultiplikatorrør (PMT) gevinst, således at de ufarvede celler er længst til venstre af en enkelt parameter histogram (ca. centreret på 10 2) for de relevante kanaler. </ Li>

    Bemærk: Det anbefales, at lymfocytter og makrofager (eller andre myeloide celler) analyseres særskilt på grund af forskelle i autofluorescens.

    1. Brug enkelt farvede kontroller eller antistof capture kompensation perler til at udføre multi-color kompensation.

    Bemærk: Brugen af kompensation perler anbefales, dog skal foreneligheden af hvert antistof sikres. For eksempel kan kompensation perlerne ikke krydsreagerer med kanin-antistoffer, i hvilket tilfælde isolerede celler kræves for at opnå en passende enkelt plet kontrol.

    1. Set eksperimentelle porte er baseret på modificeret FMO kontrol.
    2. Sæt flowcytometret at samle det nødvendige antal hændelser er baseret på forekomsten af ​​befolkningen i renter og registrere eksperimentelle data.
    3. Eksport FCS datafiler til offline analyse. Der er mange programmer til rådighed for flow cytometry dataanalyse. Vi anbefaler Cytobank, en webbaseret platform, der giver investigatores at gemme og analysere data og generere tal fra enhver computer med internetadgang 18. Derudover Cytobank giver mulighed for at gøre data offentligt tilgængelige eller begrænse adgangen til samarbejdspartnere.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Collagenasefordøjelse af AT efterfulgt af differentiel centrifugering blev anvendt til at isolere SVF fra epididymale fedtpuder mandlige C57BL/6J-mus fodret et lavt fedtindhold (10% kcal fra fedt) eller højt fedtindhold (60% kcal fra fedt) kost (LFD og HFD , henholdsvis) i 16 uger. Celler af SVF blev derefter mærket med fluoroforen-konjugerede primære antistoffer til at kvantificere andelen af levedygtige pengeautomater (figur 1) og AT T-celler (fig. 2) via FACS-analyse. Initial gating, herunder lysspredning, dublet forskelsbehandling og levedygtighed porte er afbildet i figur 1A og 2A. Det skal understreges, at den oprindelige lysspredning gate i figur 2A er begrænset til lymfocytpopulationen for at undgå at medtage autofluorescerende myeloide celler. Et eksempel på brug af modificeret FMO til at indstille eksperimentelle porte er afbildet i figur 1B. I dette eksempel (den F4/80venstre kolonne) og CD11 (højre kolonne) antistoffer erstattes med passende isotype kontrol til konto for autofluorescens og ikke-specifik binding. Quadrant porte trækkes derefter at identificere levedygtige pengeautomater (F4/80 + CD11b +). Gating for CD4 + og CD8 + ved T-celler er vist i figur 2B. Gennemførligt lymfocytter er først gated for TCRβ (venstre kolonne). Efterfølgende TCRβ + AT T-celler er gated for CD4 og CD8 (højre kolonne).

    Figur 1
    Figur 1. Fedtvæv makrofager. SVF blev isoleret fra epididymis AT mandlige C57BL/6J-mus fodret en fedtfattig eller højt fedtindhold kost i 16 uger ved hjælp af collagenase fordøjelse protokollen. Efterfølgende blev SVF-celler farvet for F4/80 og CD11b og FACS-analyse blev udført ved anvendelse af et flowcytometer at identificere pengeautomater. (A) Initial lysspredning og levedygtighed porte. (B) Modificeret FMO styrer indarbejde isotype antistoffer til F4/80 og CD11b blev anvendt til at justere kvadrant porte. (C) Sammenligning af andelen af F4/80 + CD11b + pengeautomater fra AT af lave fedtindhold og højt fedtindhold fodret mus. Klik her for at se større figur .

    Figur 2
    Figur 2. Fedtvæv T-celler. SVF blev isoleret fra epididymis fedtvæv af mandlige C57BL/6J-mus fodret en fedtfattig eller højt fedtindhold kost i 16 uger ved hjælp af than collagenase fordøjelse protokol. Efterfølgende blev SVF-celler farvet for TCRβ, CD4 og CD8a og FACS-analyse blev udført ved anvendelse af et flowcytometer at karakterisere AT T-celler. (A) Initial lysspredning og levedygtighed porte. (BC) Sammenligning af andelen af TCRβ + T-celler (venstre kolonne) og antallet af CD4 + og CD8 + T-celler (højre kolonne) fra AT af (B) lav fedt og (C) højt fedtindhold fodret mus. Klik her for at se større figur .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Stigende interesse i rollen af ​​immunsystemet i de metaboliske konsekvenser af fedme har ført til den udbredte brug af flowcytometri at karakterisere immunceller af AT. Selv om den nøjagtige protokol vil variere mellem laboratorier baseret på deres egne erfaringer og tilgængeligt udstyr, de kritiske skridt omfatter collagenasefordøjelse, differentialcentrifugering og celleoverfladeantigen mærkning. Målet med denne artikel er at give en detaljeret protokol og praktisk vejledning til isolering af AT SVF til efterforskerne med begrænset erfaring med at arbejde med AT og / eller udførelse af flowcytometri.

    Som med enhver eksperimentel teknik, er der talrige variationer, der måske eller måske ikke signifikant påvirke det ønskede resultat. Baseret på vores erfaringer, repræsenterer protokollen detaljeret heri den mest effektive afvejning mellem tid, ressourcer, cellulære udbytte og cellelevedygtighed. For eksempel har vi fundet, at forøgelse afvarighed af collagenase II fordøjelse til så meget som 60 minutter ved lignende koncentrationer af kollagenase har en ubetydelig indvirkning på cellulær udbytte således, anvender vi en 20 min fordøjelse for at reducere længden af ​​collagenase eksponering. Collagenase II er den mest almindeligt anvendte kollagenase til fedtvæv fordøjelser. En beskrivelse af alle de forskellige collagenaser og deres primære anvendelser kan findes på Sigma hjemmeside. Typiske cellulære udbytter fra ovenstående protokollen er 2-3 x 10 6 og 4-5 x 10 6 celler / g ved fra mus fodret med en fedtfattig (10% kcal fra fedt) og højt fedtindhold (60% kcal fra fedt) kost for 16 uger hhv. Ud over at varierende kollagenase fordøje tider, er der en række potentielle ændringer til den gældende protokol afhængig af den eksperimentelle model, der anvendes, herunder kosten behandling. Først, når høst AT fra mus fodret med en kost beriget for kolesterol eller mættede fedtsyrer, undgå at holde prøverne på is før hakning, fordi AT vil størkne og gøre hakkes vanskelig. For det andet, vores protokol omfatter en erythrocyt lysis trin (3,6), men en vellykket indledende perfusion ofte gør dette trin unødvendigt. Tredje, skal man være omhyggelig med ikke tilføje mere end 10 mM CaCl2 til collagenase analyseopløsningen (5 mM slutkoncentration), større calcium koncentrationer kan resultere i dannelsen af et calciumphosphat-præcipitat. Hvis dette bundfald danner efter den første centrifugeringstrin (3,5), tilsættes to vasketrin med 20 ml FACS buffer (indeholdende EDTA) forud for erythrocyt lysis trin for at fjerne bundfaldet. Fjerde, anbefaler vi, at efterforskerne anvende mindst én hel perigonadal fedtpude når isolere SVF. Vi gør denne anbefaling ikke på grund af begrænsninger i cellulær udbytte, men fordi forskellige cellepopulationer vise forskellige regionale fordelinger 19.. Således kan resultaterne forspændt, når kun en del af den perigonadal fedtpuden er osed at isolere immunceller bosiddende i AT. Hvis hele fedtpuden er større end 1,2 g, opdele fedtvæv længderetningen fra rostralt kaudale ender. Hvis delt i halve denne måde, bør hver halvdel et repræsentativt population af celler og bør generelt være mindre end 1,2 gram. Men i tilfælde af at dette er stadig mere end 1,2 g, anbefaler vi udfører collagenase fordøjelse af 1,2 gram segmenter i separate rør, og derefter kombinere alle de SVF celler til flowcytometri. Derudover, for lean mus kan det være nødvendigt at kombinere fedtpuder fra 2 eller 3 mus for at opnå tilstrækkeligt SVF-celler til flowcytometrisk analyse. Behovet for yderligere mus skal der redegøres for, når designe eksperimenter. Endelig en anden måde at vise de data er antallet af celler pr gram væv. Hvis celletæthed ønskes, bør AT vejes før hakningen og fordøjelse.

    Med hensyn til karakterisering AT SVF celler via flowcytometri, topunkter bør fremhæves. Først skal alle fluorophoren-konjugerede primære antistoffer blive valideret til brug sammen med AT SVF-celler og ordentligt titreres. Selvom vi demonstreret kompensation med perler, havde vi tidligere titreres disse antistoffer med AT SVF. Når karakterisering makrofager, anbefaler vi imod anvendelsen af tandem farvestoffer (f.eks PE-Cy7), som vi har haft blandede resultater med hensyn til ikke-specifik binding af pengeautomater når anvendelse af antistoffer konjugeret til disse farvestoffer. Desuden bør fluoroforer såsom PE og FITC kun anvendes efter titrering som beskrevet ovenfor. En liste over specifikke antistoffer, vi almindeligvis anvendes til at karakterisere AT SVF celler sammen med anbefalede koncentrationer kan findes i den medfølgende i tabel 1.. For det andet, fordi pengeautomater udstille stærk autofluorescens og en række antistoffer viser et lavt niveau af ikke-specifik binding, når de anvendes i en høj koncentration, anbefaler vi brug af modificeret FMO til at indstille eksperimentelle porte.FMO kontroller genereres ved farvning et sæt kontrolprøver med alle, men en af de antistoffer, der anvendes til at mærke eksperimentelle prøver 20. Vi har ændret FMO kontroller i vores protokol at udskifte en af ​​antistofferne med en passende fluoroforen-konjugeret isotypekontrol snarere end blot at fjerne det. I praksis kan det være acceptabelt at give afkald FMO kontroller for antistoffer, der giver exceptionel adskillelse mellem positive og negative befolkninger. Ud over disse kontroller, vil du bemærke, at der forud for gating på antistoffer vi selektere for lymfocyt og makrofag populationer baseret på forward og sidespredning. Dette vil fjerne påvisning af autofluorescerende makrofager, når man analyserer lymfocytpopulationer med fluoroforer såsom FITC og tandem farvestoffer.

    Selvom detaljerede protokoller er uden for rammerne af denne artikel, den isolation beskrevne teknik fungerer som et vigtigt første skridt for en lang række teknikker til formål at karakteterizing immunceller bosiddende i AT. For eksempel kan ovennævnte isolation og farvningsprotokol anvendes til at lette sorteringen af ​​specifikke populationer, hvorfra mRNA kan isoleres til at analysere genekspression. Desuden kan simple ændringer af protokollen, at der kan ex vivo behandling af pengeautomater. Sådanne ændringer kan omfatte anvendelse af sterile teknikker til at opnå SVF, som derefter vaskes to gange og resuspenderet i et passende celledyrkningsmedier. Snarere end at tilføje fluoroforen-konjugerede antistoffer til farvning celleoverfladeantigener kan SVF føjes til ikke-behandlede vævsdyrkningsplader at berige til pengeautomater via plastic vedhæftning (selvom dette ikke kan hævdes at være en ren population som fibroblaster og præ-adipocytter kan også klæbe ). Dette opnås ved dyrkning af SVF i ​​2-4 timer ved 37 ° C efterfulgt af to vasketrin for at fjerne ikke-adhærerende celler. Pengeautomater kan derefter behandles i overensstemmelse hermed og høstet ved hjælp af en EDTA-baserede celledissociering sålution for flowcytometri eller lyseret i Trizol eller RIPA-buffer til isolering af RNA eller protein. Uanset den nedstrøms ansøgningen, collagenase fordøje teknik til at isolere adipocytter og SVF-celler først beskrevet af Rodbell i 1964 1 fortsætter med at være et uvurderligt værktøj til karakterisering af AT immunceller og deres bidrag til de metaboliske konsekvenser af fedme.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har intet at afsløre.

    Acknowledgements

    JSO er understøttet af en NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) er AK støttes af en postdoc Fellowship fra American Diabetes Association (7-10-MI-05), og AHH er understøttet af en American Heart Association Etableret Investigator Award (12EIA8270000). Flowcytometri blev udført i VMC Flowcytometri delt ressource. VMC Flowcytometri fælles ressource understøttes af Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
    DAPI Life Technologies D3571
    BSA Sigma A2153-100G
    collagenase Sigma C6885-5G
    propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
    stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
    20 microliter filter tips Rainin SRL10F
    stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
    1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
    1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
    250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
    FC Block BD Biosciences 553142
    fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
    medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
    aluminum foil Fisherbrand 1213100
    mincing scissors Fisherbrand 089531B
    Vortex Fisherbrand 2215365
    50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
    filter top FACS tubes BD Falcon 352235
    10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
    round bottom tubes BD Falcon 352058
    5 ml syringe BD Falcon 309646
    V Bottom Plates Costar 07-200-107
    transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
    Shaker Thermo Scientific 11 676 071
    Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
    Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
    Adapters Sorvall 75003723
    Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
    Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 17-4321
    Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
    Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 11/1/4031
    Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: Dec-88
    Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC108P
    Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
    Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: IC013P
    Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 553956
    Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
    Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 552784
    Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
    Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
    Isotype control catalog number: 557963

    Table 1. List of Materials and Reagents.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
    2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
    3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
    4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
    5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
    6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
    7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
    8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
    9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
    10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
    11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
    12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. 1143-1152 (2012).
    13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
    14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
    15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
    16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
    17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
    18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
    19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
    20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics