סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sun, M., Bernard, L. P., DiBona, V. L., Wu, Q., Zhang, H. Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (81), e50808, doi:10.3791/50808 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

Introduction

הנוירונים עיקריים הם אחד מסוגי התאים בצורה הקשה ביותר לtransfect כפי שהם postmitotic ורגישים מאוד לשינויי מיקרו סביבתיים. ישנם ארבעה סוגים נפוצים של שיטות לביטוי של גנים אקסוגניים וRNAs קצר סיכה (shRNAs) בתאים אלה 1. לכל אחד יש יתרונות משלה וחסרונות. לדוגמא, electroporation מבוצע בדרך כלל על נוירונים מבודדים טרי 2, כמו תאים חייבים להיות מועברים לcuvettes עבור transfection. זיהום בנגיף בדרך כלל ניתן להשיג יעילות גבוהה מאוד 3, אבל הוא יותר עתיר עבודה ומסוכנת למפעילים. ריאגנטים transfection בתיווך שומנים רבים זמינים באופן מסחרי, בדרגות שונות של הצלחה בתאי עצב ורמות שונות של cytotoxicity.

transfection סידן פוספט מייצג שיטה נוחה וחסכונית להחדרת גנים זרים לתוך תאי עצב. השיטה שימשה לראשונה להציג את ה-DNA adenovirus לתוך cel היונקיםls ידי גרהם ואן דר Eb (1973) 4. Transfection בוצע על ידי ערבוב של סידן כלורי עם ה-DNA רקומביננטי בחיץ פוספט. זה מאפשר היווצרות של פוספט DNA / סידן שוקע בו, כאשר ירד בהדרגה על monolayer של תאים, לדבוק בתא השטח, נתפס על ידי אנדוציטוזה וסופו של דבר להיכנס לגרעין 5. תהליך זה יביא לביטוי של גנים זרים הציגו בתא היעד. יעילות אופיינית למגוון transfection סידן פוספט בין 0.5-5% 6-8. עם זאת, עם אופטימיזציה מדוקדקת וביצוע של פרוטוקול הניסוי עולה בקנה אחד, אפשר להגיע ליעילות transfection של כמעט 50%. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים, אשר cocultured עם תאי astroglial בפורמט כריך 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת עכברוש astrocyte תרבות למדיה אוויר וastrocyte נוירון cocultures.

  1. הכן את חיץ דיסקציה (BSS, ראה טבלת מס '1 למתכון) ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
  2. הרדימי גורי ילוד חולדה (P0-P2) עם isoflurane בכוס 500 מיליליטר.
  3. כאשר גורים הם נייחים, תרסיס עם אתנול 70% ולערוף.
  4. הסר את המוח.
    1. חזק היטב את הראש עם זוג דומון # 5 מלקחיים, ולהשתמש במספריים בסדר לעשות חתך קו האמצע דרך העור והגולגולת.
    2. לחשוף את המוח על ידי המשקף את הגולגולת לצדדים, ולהסיר את המוח לתוך צלחת המכילה BSS הקר.
  5. הפרד את אונות המוח מdiencephalon וגזע המוח תחת בהיקף לנתח. מוציא בזהירות את כל קרומי המוח על ידי ייצוב הרקמות עם זוג אחד של מלקחיים ומשייכתו בעדינות משם קרומי המוח עם זוג נוסף של מלקחיים.
  6. לאסוף את כל אונות in אחד 60 מנה מ"מ. בעזרת מספריים קטנים, רקמת בשר טחון כדק ככל האפשר. לאחר מכן להעביר את הרקמות טחונות לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
  7. הוסף 1.5 מיליליטר של 1% DNase אני וטריפסין 1.5 מיליליטר של .2.5% ו12 מיליליטר של BSS (נפח כולל של 15ml) למוח. דגירה באמבט מים רועד במשך 15 דקות ב37 ° C. כדי להבטיח ערבוב טוב, צינור התערבל ביד כל 5 דקות.
  8. העברת supernatant דרך מסננת 70 מיקרומטר תא מעל צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. הוסף 3 מיליליטר FBS לsupernatant זה.
  9. לחתיכות שנותרו, להוסיף 13.5 מיליליטר של BSS וטריפסין 1.5 מיליליטר 2.5% דגירה בwaterbath הרועדת לעוד דקות 15.
  10. מעביר את supernatant שנותר דרך מסננת התא ולשלב עם supernatant משלב 1.8.
  11. צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
  12. כדורי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת גליה. Supernatant ניתן centrifuged שוב לגלולת התאים הנותרים.
  13. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  14. cel פלייטls בצפיפות של 1 x 10 7 סנטימטר ל150 2 בקבוק.
  15. שינוי בתקשורת לתקשורת גליה טרי היום לאחר ציפוי. לאחר מכן, תאים להאכיל פעמיים בשבוע עם תקשורת גליה.
  16. כאשר תאים הגיעו confluency> 80% (כ 10 ימים לאחר ציפוי), להקפיא את התאים למטה ב90% בסרום סוס וDMSO 10% ולהחזיק מלאי בחנקן נוזלי. תאים קפואים ב2 x 10 6 לכל בקבוקון. אפשר להקפיא כ 5 בקבוקונים מבקבוק אחד.
  17. על 10-14 ימים לפני הגדרת התרבות בהיפוקמפוס, ותאי גלייה הם מצופים מהמניות הקפואות. בדרך כלל אנחנו צלחת חמש 6 צלחות היטב, וזה מספיק כדי לתמוך בצמיחה של 90 coverslips של נוירונים בהיפוקמפוס (שלושה coverslips 15 מ"מ עגול לכל טוב). אנחנו גם צלחת שמונה עד עשר מנות נוספות 60 מ"מ של תאי גליה, המשמשת לתקשורת N2.1 האוויר עבור transfection. היום לפני התרבות עצבית, צריכים להיות מוזנים בתאים עם תקשורת NB27. האסטרוציטים אידיאלי צריכים להיות מחוברות 90%> ב ההוא נקודה. אנו מוצאים כי הקפאה מקטינה באופן משמעותי את מספר מיקרוגליה בתרבויות astroglial. מאז רעילות העצבית מוגברת נצפתה כאשר מיקרוגליה קיים בתרבויות astroglial, אנחנו תמיד משתמשים בתרבות astroglial הוכנה ממניות קפוא לcoculture עם הנוירונים.

2. עצבי תרבות

  1. coverslips זכוכית נקי על ידי השטיפה הראשונה ב2x המים milliQ. אז הם ספוגים בחומצה חנקתית מרוכזת ל24 שעות, ולשטוף עם מים milliQ לפחות חמש פעמים על סך של 2 שעות. Coverslips הם מיובשים ועיקור על ידי אפייה בתנור בחום של C ° 225 במשך 6 שעות.
  2. העברת coverslips 60 מ"מ מנות לאחר עיקור. הנח ארבע נקודות של פרפין סטרילי ליד הקצה החיצוני של כל coverslip כדי לשמור על תאי עצב להיפרד מתאי גליה במהלך coculture.
  3. coverslips מעיל עם 1 מ"ג / פולי-L-ליזין מיליליטר במאגר M 0.1 borate לילה בחממת 37 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, לשטוף coverslips פעמיים במ 'סטריליilliQ מים לפחות 15 דקות כל אחד. אז הם מודגרות לילה בתקשורת ציפוי ב37 ° C חממה.
  5. להרדים חולדה בהריון (E18) על ידי הרדמה isoflurane אחרי חזה אוויר, ולהרדים חולדות עוברי על ידי עריפת ראש. הסר את המוח ולנתח את אונות המוח כפי שתואר לעיל.
  6. לנתח את hippocampi מחץ כדור מוחין. מניחים את כל hippocampi לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, ולעכל עם טריפסין 0.25% (0.5 מיליליטר 2.5% טריפסין, 4.5 מיליליטר BSS) על 37 ℃ במשך 15 דקות.
  7. hippocampi מתעכלת הם שטופים ב3x BSS במשך 5 דקות כל אחד. אז הם נכתשו עם זכוכית פיפטה פסטר, וצפיפות התאים נקבעת באמצעות hemocytometer. אז נוירונים הם זורעים בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל 60 מנה מ"מ.
  8. כ 2-4 שעות לאחר ציפוי, העברת coverslips עם הנוירונים מחוברים למנות המכילות תאי astroglial, עם הנוירונים פונים כלפי מטה לכיוון גליה. בDIV3, להוסיף arabinoside ציטוזין לתאים בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לעצור התפשטות גליה.

3. Transfection סידן

  1. תקשורת N2.1 מצב על גליה היום לפני transfection.
  2. ביום transfection, לקחת תקשורת N2.1 התנתה הנחה של גליה ולהעביר לתוך צלחת חדשה. העברת coverslips עם נוירונים לתוך תקשורת N2.1 המותנה. תן לאזן באינקובטור במשך 10-30 דקות.
  3. לקבוצה אחת של צינורות סטרילי, לשלב 1-4 מיקרוגרם של ה-DNA, 12.5 μl של 2 מ 'CaCl 2, וסטרילי H 2 O להיקף כולל של 100 μl. לסט שני של צינורות, להוסיף של 2x HBS 100 μl.
  4. הוספת ⅛ נפח של 2x HBS (12.5 μl) בכל פעם לצינור המכיל את תערובת CaCl 2 / ה-DNA, vortexing לכמה שניות בכל פעם. לאפשר הצינורות לשבת במשך 15 דקות.
  5. לאחר 15 דגירה דקות, מוסיף את dropwise תערובת transfection לתאים. דגירה של 1-1.5 שעה. שכבה של משקעים כמו חול צריכה להיות גלויהתחת מיקרוסקופ באמצעות מטרת 10X.
  6. לאחר דגירה, לשטוף coverslips פעמיים עם חיץ לשטוף HBS חם.
  7. לחזור coverslips למנות מקוריות עם גליה, להוסיף חומצת kynurenic לריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
  8. ניתן הדמיה נוירונים transfected חי או מעובד לimmunocytochemistry כבר ביום שלמחרת. נוירונים יכולים לשרוד עד שלושה שבועות לאחר transfection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר הפרמטרים השונים של transfection מותאמים ונשלטים בקפידה מניסוי לניסוי, ניתן להשיג יעילות transfection של עד 50%. איור 1 מציג שדה של נוירונים שהם transfected עם GFP על DIV4. השדה מכיל בסך הכל 28 נוירונים, ביניהם 16 היו transfected. זה מייצג את יעילות של מעל 50%. דגימה של שדות אחרים באותו coverslip מראה את היעילות הכוללת היא 50% בערך (מידע לא מוצג). עם מערכת coculture astroglial, הנוירונים להישאר בריאים ולהתפתח באופן נורמלי לאחר transfection. איור 2 מראה נוירון בהיפוקמפוס בDIV15, 10 ימים לאחר transfection עם מבנה PSD-95-GFP. נוירון פיתח קוצים בצורת פטרייה בוגרים רבים הדנדריטים, אשר מציין את תאי העצב בריאים. יעילות transfection הגבוהה והרעילות מינימאלית של פרוטוקול זה הופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פונקציות גן בהיפופוטם עיקרינוירונים campal. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי לtransfect תרבויות של סוגים אחרים של תאי עצב במוח, כמו גם סוגי תאים שקשה transfect אחרים.

איור 1
איור 1. נוירונים בהיפוקמפוס transfected עם GFP בDIV4, מראים יעילות transfection גבוהה. 16 מתוך 28 נוירונים בתחום הם חיוביים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. נוירון היפוקמפוס transfected עם PSD-95-GFP בDIV15, מראה עמוד השדרה בצורת פטרייה בוגרת רב הדנדריטים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

טבלת 1. / מתכוני מדיה מאגר.

מגיב רכיבים
גליה מדיה 425 מיליליטר MEM
5 מיליליטר Glutamax
5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ"מ
גלוקוז 15 מיליליטר 20%
FBS 25 מיליליטר (סופי 5%)
עגל בסרום 25 מיליליטר (5% סופיים)
5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין
0.1M Borate הצפת חומצה בור 2.48 גרם
tetraborate נתרן 3.9 g (בורקס)
800 מיליליטר milliQ H2O
pH עם NaOH ל8.5
סנן לעקר
ציפוי מדיה 425 מיליליטר MEM
5 מיליליטר Glutamax
5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ"מ
גרם 15 מיליליטר 20%lucose
50 מיליליטר FBS
NB27 מדיה 485 מיליליטר Neurobasal מדיה
5 מיליליטר Glutamax
2 תוסף B27 מיליליטר (50x)
נתיחה חוצץ (BSS) 50 מיליליטר 10x HBSS
5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.3
5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין
440 מיליליטר H 2 O
N2.1 מדיה 425 מיליליטר MEM
5 מיליליטר Glutamax
5 פירובט מיליליטר נתרן, 100 מ"מ
גלוקוז 15 מיליליטר 20%
ovalbumin 50 מיליליטר, 1% בממ
תוסף N2 5 מיליליטר
2x HEPES נאגרו מלוח (HBS), סטרילי 274 מ"מ NaCl
9.5 מ"מ KCl
15 מ"מ גלוקוז
42 HEPES מ"מ
1.4 מ"מ Na 2 HPO 4
הכן את קבוצות של 3 pH שונה (7.05, 7.10, 7.15)
הצפת לשטוף (HEPES ופר) 50 מיליליטר 10x HBSS
5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.3
445 מיליליטר H 2 O
50 מ"מ Kynurenic חומצה ממיסים 0.473 גרם של חומצת kynurenic ב 1x PBS. להוסיף טיפות של NaOH כדי לקבל אותו לפתרון. ואז להשתמש HCl להתאים בחזרה ל-pH 7.0

טבלה 2. קו זמן להכנת תרבות.

יום פעולה
לפני שמתחיל הכן את תרבות astrocyte ולהקפיא את תאים. צרור אחד של תרבות astrocyte בדרך כלל יכול לתמוך בכמה חודשים של תרבויות בהיפוקמפוס.
שבוע השנייה 1 להפשיר האסטרוציטים.
שבוע שלישי 1 להאכיל את האסטרוציטים.
שבוע שישי 1 להאכיל את האסטרוציטים.
שבוע 2 שני להאכיל את האסטרוציטים. יש לשטוף coverslips ב H 2 O, ולאחר מכן לטבול בחומצה חנקתית ל24 שעות.
שבוע 2 יום שלישי ריןse coverslips 5x. יבש לעקר coverslips.
שבוע 2 יום רביעי הנח נקודות פרפין על coverslips. מעיל coverslips עם פולי-L-ליזין.
שבוע 2 יום חמישי יש לשטוף coverslips המצופה בH2O סטרילי, אז דגירה coverslips בציפוי מדיה הלילה בשעה 37 ° C. שינוי בתקשורת על האסטרוציטים לNB27.
שבוע 2 יום שישי נתיחה בהיפוקמפוס וציפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר פרמטרים מרכזיים שצריך להיות מבוקרים בקפידה לtransfections המוצלח באופן עקבי 10,11. הפרמטר הקריטי ביותר עבור transfection סידן פוספט הוא ערך ה-pH של 2x HBS, אשר בידיים שלנו בדרך כלל נע בין 7.10-7.15. אנו ממליצים להכין שלוש קבוצות של מניות עם ערכי ה-pH ב0.05 מרווחים כדי להסביר את ההבדל בין pH מטר. לחלופין, ערכת transfection היונקים Clontech מספקת 2x הרוורד כי באופן עקבי תשואות יעילות טובה. יש לזכור כי ה-pH של התמיסה תשתנה במשך זמן, גם כאשר הם מאוחסנים במקפיא. אנחנו בדרך כלל לשמור aliquots של 2x HBS על 4 מעלות צלזיוס עד לחודש אחד, וב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.

הפרמטר השני הוא ה-pH של המדיום לתרבות. כדי לשמור בינוני N2.1 זו עולה בקנה אחד, מותנים באופן שיגרתי על תרבויות astroglial לילה אבל לא יותר מ24 שעות. בנוסף, אנו מנסים להשתמש בתרבויות astroglial הבדומה בconfluency. השימוש במדיה ממוזג גליה גם עוזר להפחית את רעילות לתאי עצב במהלך transfection. מדיה אוויר הם equilibrated בחממה לפני transfection כדי לשמור את ה-pH עולה בקנה אחד.

הגודל והצפיפות של משקעים סידן פוספט הוא מפתח לtransfection המוצלח. משקעים קטנים יובילו ליעילות transfection נמוכה, ואילו משקעים גדולים, מגושמים בדרך כלל להוביל לcytotoxicity 10. כדי להבטיח היווצרות משקע סידן זרחה עולה בקנה אחד, אנו משתמשים vortexing לסירוגין כאשר ערבוב DNA / CaCl 2 ו 2x 11 HBS. שיטה הנפוצה נוספת לערבוב היא באמצעות פיצוץ בועות אוויר באמצעות פיפטה פסטר 12. מצאנו vortexing לסירוגין להניב היווצרות משקע עקבית יותר, במיוחד לנפחים קטנים של תערובת transfection.

משתנים אחרים לשקול לכלול באיכות של ה-DNA, ואת גיליו של נוירוNS. אנו מוצאים כי transfection להתחיל לעבוד באופן עקבי כאשר נוירונים להגיע DIV2, עם זאת, את היעילות מתחילה לרדת כאשר נוירונים הם מעבר DIV10. לבסוף, את בריאותם של התרבויות עצביות עצמם מייצג עוד פרמטר חשוב. אנו מוצאים את השימוש במערכת coculture להיות הדרך הטובה ביותר כדי ליצור תרבויות בהיפוקמפוס הראשוני בריאים. אם הנוירונים אינם בריאים, הם לא ישרדו זמן רב לאחר transfection. עם מערכת coculture, הנוירונים בצפיפות נמוכים יכולים לשרוד לתקופה של עד 3 שבועות לאחר transfection, המאפשר לימודים לטווח ארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי מעוניינים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק NS065183 וקרנות הזנק מבית הספר לרפואת ראטגרס רוברט ווד ג'ונסון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-20
Fine scissors Fine Science Tools 14090-09 straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors Fine Science Tools 15008-08 angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-16
Student surgical scissors Fine Science Tools 91401-14 blunt / 14.5 cm
Spring scissors Fine Science Tools 15006-09 angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane Webster Veterinary 14043-225-06
Poly-L-lysine Sigma P2636
MEM Sigma M2279
100 mM Sodium pyruvate Sigma S8636
Glucose Sigma G8270
10x HBSS Sigma H4385
1 M HEPES, pH 7.3 Gibco/Invitrogen 15630-080
GlutaMAX Gibco/Invitrogen 35050-061
Neurobasal Media Gibco/Invitrogen 21130-049
B27 Supplement (50x) Gibco/Invitrogen 17504-044
N2 Supplement Gibco/Invitrogen 17502-048
Ovalbumin Sigma A5503
Penicillin/Streptomycin Gibco/Invitrogen 15070-063
2.5% Trypsin Gibco/Invitrogen 15090-046
DNase I Sigma DN-25
Cytosine arabinoside Calbiochem/EMD Millipore 251010
Kynurenic acid Sigma K3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  2. Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
  3. Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
  4. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  5. Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  6. Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
  8. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
  9. Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  10. Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
  11. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  12. Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).

Comments

2 Comments

  1. Hi,

    How can I watch the video?
    Thank you.

    Fatin

    Reply
    Posted by: fatin n.
    December 9, 2013 - 10:48 PM
  2. Hi Fatin, please contact me at zhang29(AT)rutgers.edu and we will arrange to share the video with you.
    Huaye

    Reply
    Posted by: Huaye Z.
    January 10, 2014 - 2:49 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics