התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

1Department of Biological Sciences, University of Delaware
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה ​​יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.

Introduction

משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) 1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) 1, הפגזת microparticle 1 (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים 3,4, דגי זברה 5, עכבר 6, צפרדע 7, ובקר 8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת 9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו 10-12.

השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto 10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר 11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו 15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה 18-21, תהליכים ביולוגיים תא 22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) 25-28.

Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק 3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ"מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה 29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ"מ 3-AT, חומצת 10 מ"מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization 30 ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת protamine סולפט (PS) מצופה צלחות

  1. הכן פתרון 1% מסולפט protamine (PS) על ידי הוספת 0.5 גרם של PS ל50 מיליליטר מים deionized, מזוקקים (DDH 2 O) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לנער היטב במהירות גבוהה על שייקר ספסל בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות כדי להבטיח פירוק של PS מלא. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 חודשים (הקפד לפזר משקע כמו ג'ל לגמרי לפני כל שימוש) 3.
  2. קח את השרוול של צלחות פטרי קלקר x 15 מ"מ 60 מ"מ ולהניח את שני מכסים ובתחתית על הספסל.
  3. יוצקים 1% פתרון נ.ב. בכל מנה (יכולים לשמש גם תחתית ומכסים) רק מספיק כדי לכסות את פני השטח, להשאיר למשך לפחות 2 דקות. פתרון PS השאריות ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות תוך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C.
  4. מקום שטופלה PS מנות בכוס מלאה במים מזוקקים (DH 2 O). השאר את הכוס תחת זרם DH 2 O לפחות10 דקות.
  5. ניתן להשתמש בו מנות מצופים נ.ב. מייד או אוויר יבש לאחסון. לכסות אותם כדי למנוע הצטברות אבק. הם יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך 1 חודש 3.

2. השג תאי המין של קיפוד ים ולשתק את הביצים על צלחת מצופה נ.ב. לMicroinjection

  1. קיפודי ים שרצים על ידי טלטול או הזרקת intracoelomic של עד 1 מיליליטר של .0.5% KCl כדי לגרום להתכווצות של שרירים חלקים כדי לשחרר תאי רבייה 3 (איור 2).
  2. אם בעל החיים הוא גברי, כפי שצוין על ידי הזרע בצבע הלבן, לאסוף יבש זרע מפני שטח של בעלי חיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. זרע יבש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של תפקוד ביולוגי.
  3. אם בעל החיים הוא נקבה, כפי שצוינה על ידי הצבע הצהוב בשל תוכן חלמון הביצה, לאסוף תאי הרבייה שלה על ידי טבילת gonopores בכוס מלאה במי ים. הביצים תשוחרר מgonopores ולהתיישב על ידי כוח הכבידה. </ Li>
  4. סנן את הביצים מפסולת כגון עמוד השדרה של בעלי חיים באמצעות 80 מסנן רשת ניילון מיקרומטר. התוצאות הטובות ביותר מושגות אם הביצים נמצאות בשימוש בתוך 5-7 שעות לאחר ההשרצה.
  5. Dejelly ביצים:
    1. הכן מי ים חומצי 100 מיליליטר כ 1 מיליליטר של ביצה. השתמש בחומצת לימון 0.5 M כדי להתאים את pH של מי ים מpH 8.0 ל5.1-5.2. נמוך מדי של pH יקטן הפריה וגבוהה מדי של ה-pH לא יאפשר ביצים לצרף צלחות נ.ב. מצופים.
    2. מוסיף את הביצים (יותר מ 1 מיליליטר לא) למים ים חומצי ולאפשר את הביצים להתיישב על קרח דק 10. לחלופין, הסרת מעיל הריבה ניתן להקל על ידי מתערבל עדין של הביצים בזמן הטיפול. אחד יכול למעשה dejelly ביצי purpuratus ס ב3-4 דק 'בדרך זו.
    3. יוצק בזהירות את מים לים חומצי, מוסיף מים ים טריים ולתת את הביצים להתיישב על קרח שוב. ניתן לאחסן ביצי Dejellied על קרח לתקופה של עד 6 שעות ללא בעיות הפריה

    3. בשורה הביצים

    1. הכן 1 פתרון M המניה של 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) על ידי המסת 0.84 גרם של 3-AT ב10 מיליליטר של DDH 2 O. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
    2. הכן 1 פתרון עובד מ"מ של 3-AT ידי הוספת 50 μl של פתרון M המניה 1 50 מיליליטר של מי ים prechilled. שמור את הפתרון על קרח.
    3. הכן את הפה פיפטה (איור 3) לטיפול עדין של הביצים:
      1. קצה פיפטה הוא משך באופן ידני מmicropipettes הזכוכית (100 x OD 1.09 מ"מ). החזק את micropipette בשתי הידיים מעל הלהבה הפתוחה. כזכוכית מתחילה להתמוסס, למשוך בזהירות את הקצוות של פיפטה בכיוונים מנוגדים.
      2. חבר את אחד משך את פיפטה לצינורות פלסטיק (מ"מ 1.14 ID), חותם חזק עם Parafilm. אורכו של הצינור צריך להיות כ 50-70 סנטימטר.
      3. הכנס קצה P20 או P200 מסונן סטרילי בסוף ההפך הצינור לצינור הזכוכית כדילשמש כחתיכת הפה.
      4. קליפ סוף micropipette הזכוכית עם מספריים כדי להתאים את הקוטר של הקצה. הקוטר האופטימלי מעט עולה על הקוטר של הביצה (80 מיקרומטר).
    4. יוצקים 4 מיליליטר של מ"מ המים ים 3-AT 1 לכל מנה מצופה PS (תחתון או מכסה).
    5. קח את פיפטה בפה, לשים את קצה P20/P200 בפה ולאבטח אותו עם השיניים. כדי לשאוב את הביצים, לשאוב ראשון כמות קטנה של מי ים. על ידי בעל טור של נוזל לפני טעינת הביצים, תהיה אחד שליטה מקסימלי על טכניקת pipetting פה.
    6. מקם את קצה micropipette ליד הביצים ולשאוב בעדינות בכמה מאות ביצים בפיפטה. להגביל את הביצים בתוך micropipette הזכוכית.
    7. שורת dejellied ביצים בקו ישר על צלחת בעדינות על ידי נושבת אותם מחוץ לפיפטה הפה תוך כדי התנועה את הקצה בקו ישר. בשורה הביצים ממש לפני הזריקות, בגלל בעיות הפריה עלולות להתרחש בשל prolonged חשיפה למים ים 3-AT 3. יתר על כן, דבקי קטיוני כמו PS יכולים להיות רעילים לביצים, וזה לא מומלץ לחשוף את העוברים לריאגנטים אלה לתקופות ארוכות, במיוחד אם את מעטפות ההפריה הוסרו.
    8. הפוך שריטה על הצלחת ליד הקו של ביצים חתרו באמצעות פיפטה מזכוכית. שריטה זה תהיה חשוב כדי לשבור את מחט הזריקה כדי להתאים את הזרימה של פתרון בהתאם לצורך. לחלופין, השריטות יכולות להתבצע לפני מזיגת מים לים 3-AT למנה.

    4. Microinjection של zygotes קיפודי הים

    1. הפעל תחנת microinjection. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת הזרקת Femtojet.
    2. משוך נימי הזרקה באמצעות חולץ מחט. דוגמא של מחט טובה מתוארת באיור 4. הערה: לקבלת זריקות RNA, צריכים להיות pretreated נימי הזרקה כדי למנוע זיהום RNAase יום 31:
      1. הנח נימי הזרקה לתוך 50 חרוטי מיליליטרצינורות ולהוסיף 50 מיליליטר של מסונן מתנול / HCl (09:01). לנער היטב ולהשאיר למשך הלילה לא יותר מ10 שעה.
      2. יוצקים את מתנול / HCl ולשטוף את הנימים 2x עם מתנול המסונן באותו הצינור.
      3. מסננים מתנול ככל האפשר וLyophilize נימי לילה על מנת להבטיח הסרת מלאה מתנול.
    3. הר בזהירות את נימי מחט על בעל טעינת מחט ולטעון אותו עם <0.5 μl של פתרון מדגם באמצעות טיפים microloader. פתרונות לדוגמא בדרך כלל מכילים גליצרול 20%, תלוי בחומר המוזרק 3.
    4. מניחים את הצלחת עם ביצים חתרו על הבמה מיקרוסקופ (צריכים להיות מיושרות ביצים אנכית כאשר נצפים מבעד עיניות) ולהתמקד בביצים.
    5. הר בזהירות את המחט הועמסה על בעל microinjecting המחט ולהתאים את המיקום של המחט ליש קצה בצורה מושלמת ממוקד באמצע השדה.
    6. ללחוץ על הלחצן כדי להחיל את הלחץ המקסימאלי עבורr ניקוי מחט. פתרון צריך לבוא מתוך המחט. התאם את הלחץ במידת צורך: לחץ הזרקה צריך להיות בטווח של 90-360 hPa, עם לחץ הפיצוי על כ 1/3 מלחץ ההזרקה.
    7. להתאים את זרימת הפתרון על ידי הזרקה לתוך ביצית מופרה. באמצעות micromanipulator ג'ויסטיק, לכוון את קצה המחט להזרקה לביצית מופרה. כדי להקל על כניסת מחט, ליצור רעידות קלות על ידי הקשה עדינה של הבמה עם חפץ קשה כגון מברג. בולוס הזרקה להרכיב בתוך הביצה יש לראות (איור 5).
    8. אם בולוס ההזרקה אינו גלוי, מעט להעלות את קצה המחט מעל הביצים, לאתר את השריטה על הצלחת ולהתאים אותו להיות ממוקם באמצע השדה. לטפוח בעדינות את קצה המחט לסימן השריטה לשבור את קצה מחט הזריקה. התאם את לחצי הזרקה ופיצוי על מנת להבטיח כי בולוס ההזרקה אינו עולה על 1/5 של tהוא הקוטר של הביצה (1-2 בערב).
    9. ברגע שבולוס ההזרקה מכויל, להפרות את הביצים על ידי הוספת זרע מדולל (1:1,000) או 1-2 μl של זרע. מערבבים היטב בזהירות כדי למנוע פירוק השורה של ביצים.
    10. להתחיל זריקות מייד לאחר מעטפת ההפריה הופכת לגלויה (איור 5). תנוע לאורך הקו של ביצים חתרו שימוש בבקר הבמה ולהזריק zygotes רבים ככל האפשר על ידי תוקע אותם עם המחט נשלטת על ידי micromanipulator ג'ויסטיק.
    11. אחרי 10-15 דקות, הביצים המופרות החדש תהפוך קשוחות ולא ניתן להזריק יותר. מוציא את המאפה מהבמה ובזהירות לשאוב את הזרע במי ים 3-AT באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק.
    12. אל תתנו zygotes יבש. להוסיף במהירות במי ים prechilled טריים כדי לכסות את המנה. דגירה את העוברים ב15 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בונה כתב ה-GFP וmCherry היתה במבחנה עיבד וmicroinjected לביצים מופרים שזה עתה. עוברים הודגרו ב15 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (עד שלב blastula) והדמיה באמצעות מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1. הזרקה של מבני כתב לא הביאה לכל ליקויים התפתחותיים (איור 6). לכימות של אותות ניאון, רכישת תמונה בוצעה בהגדלה נמוכה (100X) כדי ללכוד מקסימאלי פיקסלים ניאון (איורים 6D-F). אותות ניאון היו לכמת באמצעות AxioVision 4.8.2.0. סטיות ההתקן לעוצמת אותות ניאון בתוך האוכלוסייה של 100-200 blastulae לא יעלו על 1.5% (מידע לא מוצג).

איור 1
איור 1. התקנת microinjection. () Di מצופה PSsh עם ביצים משותקים ממוקם על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה (ב '). מחט Microinjection מחוברת לבעל מחט שמחובר ליחידת לחץ (ד) (ג). תנועה בx-,-ממדי z-Y, והיא נוהלה עם השימוש (E) micromanipulator או (F) מניפולטור הגס. (G) מברג עטוף במגבות נייר משמש כדי לנצל את הבמה מיקרוסקופ בעדינות כדי לגרום לרעידות קלות כדי להקל על כניסת מחט לתוך הביצית המופרית החדש.

איור 2
איור 2. השרצה של קיפודי הים. () קיפודי ים מושרה לשפוך על ידי הזרקת intracoelomic של .0.5% KCl. נקודות מחט קרום peristomial המקיף את פיו של בעל החיים, החלק הרך בלבד של בעלי החיים.(ב) קיפודי ים נקבה ממוקם עם gonapores השקוע במי הים בכוס פלסטיק לאסוף ביצים צהובות. (ג) זרע לבן הוא שוחרר מgonapores של קיפודי ים ממין הזכר.

איור 3
איור 3. . פיפטה בפה פיפטה בפה מורכבת משלושה חלקים: (א) מחט micropipette זכוכית, (ב) צינורות פלסטיק, וP20 המסונן סטרילי או טיפ P200 (C). Micropipette הזכוכית מוכנס לתוך צינורות הפלסטיק שמחובר לP20 או חתיכת הפה P200.

איור 4
איור 4. מחט microinjection. () מחט microinjection היא pulהוביל באמצעות חולץ מחט עם הגדרה ספציפית. ההגדרה של חולץ המחט צריכה להיקבע באופן אמפירי. שימוש Narishege חולץ מחט PC-10, אנו משתמשים 72.8 מעלות צלזיוס במשך חום הגדרת 1 ו83.7 מעלות צלזיוס במשך חום הגדרת 2. שימוש בשריטה על צלחתנו לשבור את קצה המחט כדי להקל על זרימת פתרון. (ב) מחט טובה צריכה באורך של 500-600 מיקרומטר מרוחב של 50 מיקרומטר בכתף עד 5 מיקרומטר בקצה.

איור 5
איור 5. הזרקה של ביצי קיפודי ים שהופרו זה עתה. ביצי Dejellied היו חתרו על צלחת מצופה PS ומופרה. ביצים מופרות שזה עתה הוזרקו אחד אחד תוך הזזת הבמה מיקרוסקופ לאורך קו zygotes (מלמעלה למטה). () בולוס הזרקה בבירור לראות כדי להרכיב בתוך מופרה החדשביצה בקצה המחט. (ב) מעטפת הפריה שקופה נוצר על הפריה. זרע (C) מופיע נקודות שחורות קטנות כמו ברקע. בר סולם הוא 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6
איור 6. zygotes microinjected התפתח blastulae ללא פגמים התפתחותיים או מורפולוגי. ביצים מופרות חדש הוזרקו סמני ניאון המאפשרים להם להבחין בין עוברי uninjected (המוצגים על ידי חצים) באופן ברור. (AC) עוברים צילם בהגדלה 400X. (DF) עוברים הם צילמו בהגדלה 100X כדי ללכוד את רוב אותות הקרינה הנפלטים לכימות אמין. לאחר 24 עמ 'שעהההפריה OST, blastulae נאסף וטופלה במי ים 2x למשך 2 דקות כדי לשתק את עוברי שחייה 3, ואחריו 1x לשטוף במי ים. תמונות שנרכשו עם מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1 והמצלמה monochromic AxioCam. (A, D) תמונות של דסק"ש blastulae. (B, E) תמונות של שכבות של עוברים הוזרקו במבחנה עיבד mCherry בקרינה וערוצי דסק"ש. (C, F) תמונות של שכבות של עוברים הוזרקו במבחנה עיבד ה-GFP בקרינה וערוצי דסק"ש. בר סולם הוא 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים 1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי microinjection.

זה חשוב מאוד לקחת בחשבון את המסיסות של הטיפול נמסר ואת עוצמת הזריקה. אם פתרון microinjected נוטה ליצור אפילו משקע קל, מחט microinjecting תהיה סתומה. באופן כללי מומלץ לצנטריפוגה הפתרון ליותר מ -15 דקות לפני הטעינה לתוך המחט לוודא כל משקע הוא להסיר את הפתרון 3. הגישה אחרת היא להעביר את הפתרון באמצעות עמודות ספין Millipore. אם זה לא אפשרי, כדי למנוע סתימה, יתכן שניתן יהיה לפתוח סתימת המחט על ידי עדין שבירת הקצה שוב,אבל זה הופך להיות קשה לשלוט על זרימת הפתרון, אם הקצה הוא רחב מדי. הכמות הגדולה של הפתרון המוזרק יכולה להיות רעילה לעובר, ומעבר לקצה הרחב מציג וריאציות גדולות יותר בין הנפחים של תמיסה מוזרקים לעוברי אדם. כמו כן, חשוב שכמות הנפח מוזרק לביציות המופרות החדש מותאמת. הנפח המוזרק יכול להיות מכויל על ידי משיכת המחטים בהגדרות שונות המיושמת על ידי הזרקת התמיסה לתוך שמן. זה מאפשר מדידת הקוטר (ולכן הנפח) של רביב 32. אנו מוצאים כי כמות מקובלת של פתרון הזרקה בביצית מופרה החדש שלא תעלה על 1/5 בקוטר של הביצית המופרית, כפי שמוצג באיור 5.

העצה העיקרית היא לטעון את המחט ממש לפני ההזרקה, לעבודה מהירה, ולעתים קרובות כדי להשתמש בפונקצית כפתור ניקוי של מזרק אשר מפעיל יישום של הלחץ זמין המרבי ללשקע בכדי לשטוף את מחט הזריקה החסומה.

לפעמים המחט עלולה לסתום מבחוץ, כאשר הזרע והפסולת מן הביצים מוזרקות בעבר להיצמד לקצה המחט. במקרה זה, כדאי להעלות את המחט כל הדרך עד ממי 3-AT בצלחת הזרקה. בדרך כלל את המתח שנגרם על ידי הממשק נוזל האוויר הוא מספיק כדי להסיר את הפסולת. לחלופין, בעדינות לצחצח את מחט הזריקה נגד השריטה על צלחת ההזרקה עשוי לעזור גם. במקרה הקיצוני, ניתן לנגב את קצה המחט עם Kimwipe הרטוב המטפטף. עם זאת, מנגב כזו מחייב זהירות ומעשה קיצוניים.

צבעי ניאון כגון 10,000 יזין האדום MW טקסס הואשמו dextran (2 מ"ג / מיליליטר) לייצר אות חזקה שניתן לאתרם ומשמש לנורמליזציה אמינה של הפתרון המוזרק. כאשר ה-mRNA הוא להיות מוזרקת, מומלץ לcoinject עם mCherry או GFP mRNAs יחד עם ה-mRNA של בterest כדי לוודא ששום השפלה mRNA התקיימה. במקרה זה הדמיה של אות הניאון תלויה בתרגום של mCherry או ה-GFP. אם השימוש בצבעי ניאון או מבנים אינו אפשרי, מומלץ לחתור כמות קטנה של ביצים על כל מנה בודדת על מנת לוודא כי כל הביצים מופרות החדש על המנה שמוזרקות.

לסיכום, microinjection הוא כלי רב ערך למחקר בגנטיקה, ביולוגיה מולקולרית, תאית, והתפתחותית. באמצעות טכניקה זו, הקהילה של קיפוד הים הפכה תרומה משמעותית להבנה של תא וביולוגיה התפתחותית כגון מפרט גורל תא, תפקוד גן, ויסות הגנים ומסלולים ביוכימיים התפתחות עוברית בסיסית 16 שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Acknowledgements

אנו מודים לסנטיאגו סוארז לקריאה ביקורתית של כתב היד ובטי קאוגיל לסיוע בצילום. אנו מודים גם מבקרים האנונימיים על המשוב הביקורתי שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר לאוניברסיטת דלאוור.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  2. Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
  3. Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
  4. Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
  5. Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
  6. Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
  7. Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
  8. O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
  9. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. (2011).
  10. Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
  11. Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
  12. Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
  13. Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
  14. Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
  15. Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
  16. McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
  17. Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
  19. Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
  20. Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
  21. Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
  22. Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
  23. Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
  24. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
  25. Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
  26. Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
  27. Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
  28. Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
  29. Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
  30. Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
  31. Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics