सहसंयोजक एक स्व इकट्ठे monolayer दृष्टिकोण का उपयोग कर सतहों पर बीएमपी -2 के बंधन

Chemistry

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Summary

हम सतहों पर बीएमपी -2 के कुशल स्थिरीकरण को पूरा करने के लिए एक विधि का वर्णन. हमारा दृष्टिकोण अपनी स्वतंत्र amine अवशेषों के माध्यम से बीएमपी -2 के बंधन सहसंयोजक प्राप्त करने के लिए एक आत्म इकट्ठे monolayer के गठन पर आधारित है. इस विधि कोशिका झिल्ली पर संकेतन अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है.

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Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

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Abstract

हड्डी morphogenetic प्रोटीन 2 (बीएमपी 2) अस्थि ऊतक के बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड एक वृद्धि कारक है. इस प्रकार चिकित्सा और डी नोवो हड्डी गठन उत्तेजक अस्थिकोरक में mesenchymal सेल भेदभाव के ट्रिगर के रूप में बीएमपी 2 कार्य करता है,. scaffolds के साथ संयोजन के रूप में पुनः संयोजक मानव बीएमपी -2 (rhBMP -2) का उपयोग नैदानिक ​​प्रस्तुति के मोड पर आधारित है, हाल ही में विवादों को उठाया गया है और राशि वितरित किया जाना है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं पर इन विट्रो अध्ययन के लिए बीएमपी -2 वितरित करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है. हम एक heterobifunctional लिंकर से मिलकर एक आत्म इकट्ठे monolayer फार्म करने के लिए कैसे का वर्णन है, और rhBMP-2 के सहसंयोजक स्थिरीकरण प्राप्त करने के बाद के बंधन कदम दिखा. इस दृष्टिकोण के साथ यह प्रोटीन की जैविक गतिविधि को बनाए रखते हुए बीएमपी -2 के एक निरंतर प्रस्तुति को प्राप्त करने के लिए संभव है. वास्तव में, बीएमपी -2 के सतह स्थिरीकरण unspecific विज्ञापनों को रोकने के द्वारा लक्षित जांच की अनुमति देता हैorption, वृद्धि कारक की मात्रा को कम करने और जबकि, सबसे विशेष रूप से, सतह से अनियंत्रित रिहाई निरोधक. कोशिकाओं covalently immobilized rhBMP -2 पेश सतहों को उजागर कर रहे हैं जब बीएमपी 2 से चालू होने वाले दोनों छोटी और लंबी अवधि के संकेत घटनाओं बीएमपी -2 उत्तेजना को सेल प्रतिक्रियाओं पर इन विट्रो अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण से उपयुक्त है, जिससे जगह ले रहे हैं.

Introduction

हड्डी morphogenetic प्रोटीन 2 (बीएमपी -2) बदलने वृद्धि कारक (TGF-β) परिवार और डी नोवो हड्डी गठन की inducer के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण के विकास और वयस्क दौरान कई ऊतकों के नियामक के रूप में कार्य करता है 1-3 homeostasis के एक सदस्य है. जैविक रूप से सक्रिय homodimeric बीएमपी -2 प्रोटीन की प्रत्येक monomer अत्यधिक सभी BMPs 4 में संरक्षित है जो एक "सिस्टीन गाँठ" मूल भाव शामिल हैं. सातवें सिस्टीन दो monomers 5,6 के बीच एक intermolecular बांड बनाने, dimerization में शामिल है जबकि सात सिस्टीन अवशेषों के छह, प्रत्येक मोनोमर को स्थिर कि intramolecular डाइसल्फ़ाइड बांड फार्म. यह अत्यधिक संरक्षित सिस्टीन गाँठ बीएमपी -2 प्रोटीन के तीन आयामी संरचना को परिभाषित करता है और इस तरह की गर्मी, denaturants और अम्लीय पीएच 7-9 के खिलाफ प्रतिरोध के रूप में अपनी अद्वितीय गुण, निर्धारित करता है. बीएमपी -2, जिससे संकेत पारगमन उत्प्रेरण, सेरीन / threonine kinase transmembrane रिसेप्टर्स करने के लिए बांध 12-14 के रूप में विशिष्ट लक्ष्य जीन,.

हड्डी में, बीएमपी -2 के इस प्रकार उपचार और हड्डी का नए सिरे से गठन के उत्तेजक, अस्थिकोरक में mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करता है. वर्तमान में, recombinantly बीएमपी 2 खंडित साइटों के उपचार बढ़ाने के लिए चिकित्सकीय लागू किया जाता है व्यक्त की है. अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में एक आम रणनीति स्थानीय वितरण प्रणाली की तुलना में कम आक्रामक है जो इंजेक्शन वृद्धि कारकों का इस्तेमाल होता है. हालांकि, vivo अध्ययन और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों से पता चला है कि कम जैविक आधा जीवन, unspecific नियंत्रण रेखाalization और बीएमपी -2 के तेजी से स्थानीय निकासी कई स्थानीय अस्थानिक और प्रणालीगत समस्याओं 15 को जन्म दे सकती. इसलिए, एक प्रभावी प्रस्तुति, सामग्री के भीतर या पर बीएमपी -2 के फंसाने या स्थिरीकरण प्राप्त करने के लिए लक्ष्य साइट पर अपने स्थानीय और निरंतर वितरण के लिए आवश्यक है. निरंतर वितरण जैसे भौतिक फंसाने, सोखना या आयन complexation के रूप में 16 गैर सहसंयोजक प्रतिधारण दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, यह ज्ञात है कि अणुओं की 17 विकृतीकरण में सतहों के लिए प्रोटीन की unspecific सोखना मई का परिणाम है. वृद्धि कारकों के बंधन सहसंयोजक के लिए, समर्थन के विभिन्न प्रकार पिछले दशक में विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए प्रोटीन के अमीनो या carboxyl समूहों को लक्षित कि bifunctional जोड़ने अणुओं का उपयोग करते हैं, जरूरी नहीं कि इसके स्थिरीकरण प्राप्त करने के लिए प्रोटीन संशोधन की आवश्यकता नहीं है कि दृष्टिकोण का एक प्रकार है. वास्तव में, जबकि प्रोटीन संशोधन, प्रोटीन उन्मुखीकरण को नियंत्रित करने का लाभ प्रदान करता हैकृत्रिम डोमेन, पेप्टाइड टैग और साइट विशेष चेन की शुरूआत के विकास की जैविक गतिविधि 17 कारकों को बदल सकता है. इस प्रकार, कारण समर्थन सामग्री के साथ बातचीत करने के लिए विकृतीकरण नाकाम करने के लिए, सतहों वांछित कारक 18 के युग्मन के बाद एक लिंक के अणु का एक आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम), के साथ, उदाहरण के लिए, पहले से क्रियाशील किया जा सकता है. हम अपनी स्वतंत्र amine अवशेषों को लक्षित करके covalently एक सतह पर बीएमपी -2 स्थिर करने के लिए एक सैम आधारित दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है और immobilized प्रोटीन अपनी छोटी और लंबी अवधि के जैविक गतिविधि 19 दोनों को बरकरार रखे हुए दिखाया है. इस प्रोटोकॉल कोशिका झिल्ली में पाए जाते हैं और osteogenic संकेतन के लिए जिम्मेदार intracellular संकेत विनियमित जो तंत्र पर इन विट्रो अध्ययन के लिए कोशिकाओं को बीएमपी -2 वितरित करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है.

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Protocol

1. 11-Mercaptoundecanoyl एन hydroxysuccinimide एस्टर (एम यू एन एच एस) के संश्लेषण

  1. कमरे के तापमान (आर टी) पर 40 एमएल dichloromethane (देहात) में 10 मिलीलीटर एसीटोन (देहात) में (dimethylamino) pyridine जी 1 के लिए 11-mercaptoundecanoic एसिड - एक 500 मिलीग्राम एन hydroxysuccinimide का समाधान और 30 मिलीग्राम 4 dropwise जोड़ें.
  2. 0 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया कूल और dropwise 1.1 जी एन, (नाइट्रोजन वातावरण के तहत) 10 मिलीलीटर dichloromethane में 'एन-dicyclohexylcarbodiimide जोड़ें. 1 घंटे के लिए कम तापमान पर प्रतिक्रिया रखें और फिर रात भर आरटी पर हलचल.
  3. वेग तक और कम दबाव के तहत शुष्क. 1:1 के अनुपात में पेट्रोलियम बेंजीन और एथिल एसीटेट (देहात) के साथ फ्लैश क्रोमैटोग्राफी द्वारा उत्पाद शुद्ध.

2. सजातीय गोल्ड परतों की तैयारी

  1. प्रेसिजन पोंछे के साथ और एथिल एसीटेट (देहात) और मेथनॉल (देहात) के एक 1:1 मिश्रण युक्त समाधान में 5 मिनट के लिए उन्हें sonicate स्वच्छ कांच coverslips. Rinsई मेथनॉल के साथ substrates और नाइट्रोजन प्रवाह के तहत बंद सूखी.
  2. धूम कोटिंग डिवाइस में साफ substrates रखें. चैम्बर खाली. 60 सेकंड के लिए sputtering द्वारा क्रोमियम लक्ष्य से ऊपरवाला क्रोमियम ऑक्साइड परत निकालें. धातु बीम और एक 40 एनएम सोने की परत के साथ कोटिंग के बाद 10 एनएम क्रोमियम परत के साथ कोट उनके नीचे नमूने रखें.

3. बीएमपी 2 की सतह स्थिरीकरण

  1. लगभग 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए उत्तर में म्यू एन एच एस, एन dimethlyformamide (DMF) को भंग करने और नाइट्रोजन वातावरण के तहत 4 घंटे के लिए आरटी पर म्यू-एनएचएस समाधान में सोने substrates सेते हैं.
  2. 2 मिनट के लिए DMF में Sonicate सतहों, DMF और MeOH से कुल्ला और नाइट्रोजन प्रवाह के तहत बंद सूखी.
  3. 100 माइक्रोग्राम / एमएल (-80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots) के एक एकाग्रता के साथ बाँझ 4 मिमी एचसीएल में rhBMP-2 के एक शेयर समाधान तैयार करें. काम करने dilutions (3.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए, पीबीएस / NaCl (पीबीएस 1 एम NaCl युक्त) और एक में शेयर समाधान पतलाउपयोग करने के लिए तुरंत पहले पीएच 8.5 djust.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर rhBMP-2 काम समाधान में म्यू-एनएचएस क्रियाशील सतहों सेते हैं. ऊष्मायन सतह पर तैरनेवाला निकालें. Sonicate 2 मिनट के लिए पीबीएस / NaCl में सतहों और बाँझ पीबीएस / NaCl के साथ 3x धो लो.

4. सतह विशेषताओं

  1. एंटीबॉडी के unspecific सोखना ब्लॉक करने के लिए एक 5% BSA के साथ सतहों सेते (w / v) एक विरोधी बीएमपी -2 एंटीबॉडी (1:100 1 में% (w / v साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस समाधान में आरटी पर 1 घंटे के लिए) / BSA पीबीएस समाधान). पीबीएस और 30 सेकंड के लिए sonicate के साथ दो बार सतहों धो लें.
  2. फिर पीबीएस के साथ दो बार धोने, आरटी पर 30 मिनट के लिए एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1,000 1 में% (w / v) / BSA पीबीएस समाधान) के साथ substrates सेते हैं.
  3. एक प्लेट रीडर के साथ 570 एनएम पर एचआरपी enzymatic गतिविधि को मापने के लिए Ampliflu लाल परख करें.

5. जैविक गतिविधि का विश्लेषण

  1. 6 अच्छी तरह से पी एल में अच्छी तरह से प्रति बीज 1 एक्स 10 5 माउस C2C12 myoblasts10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए उन्हें सेते के साथ पूरक पाइरूवेट युक्त एक उच्च ग्लूकोज DMEM से मिलकर मध्यम विकास में Ates,.
  2. Immobilized बीएमपी -2 के साथ सजाया सतहों पर बोने के लिए पहले 3-5 घंटे के लिए सीरम मुक्त DMEM में कोशिकाओं को भूखा.
  3. अल्पकालिक संकेतन प्रेरण की जांच के लिए, 200 μl ताजा सीरम मुक्त DMEM से मध्यम जगह और कोशिकाओं के ऊपर से स्थिर बीएमपी -2 सतहों जगह है. सतह scratching से बचने के लिए ठीक टिप चिमटी के साथ संभाला जाना चाहिए.
  4. धीरे सतहों निकालें और एक विंदुक के साथ मध्यम aspirate, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. सेल प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें.
  5. लंबी अवधि के जैविक गतिविधि, प्लेट कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए पर छह दिनों के लिए कम सीरम शर्तों (2% FBS) में 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 सतहों और संस्कृति उन्हें.

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Representative Results

यह एक जैविक रूप से unspecific लेकिन रासायनिक tunable प्रणाली प्रदान करता है के बाद से हमारे सेटअप में, सोने excipient के रूप में चुना गया था. इसके अलावा, स्वयं कोडांतरण monolayers के आवेदन कई लाभ जरूरत पर जोर देता: उनके कार्यात्मक अंत समूहों आगे संशोधित किया जा सकता है, जबकि SAMs अनायास, धातुओं और कुछ दोष के साथ फार्म monolayers पर उनके "सिर समूहों" के माध्यम से सोखना. इस प्रकार वे एक नियंत्रित अभी तक अत्यधिक अनुकूल तरीके से 20 में इंटरफ़ेस के गुण दर्जी के लिए एक मंच प्रदान करते हैं.

सोने में लिपटे सतहों पर बीएमपी -2 के स्थिरीकरण के लिए, हम एक दो कदम दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया: 1) 2)) चित्रा 1 देखें (प्रोटीन के साथ linker प्रतिक्रिया तो सोने की परत म्यू-एनएचएस लिंकर बंधन, और. RhBMP-2 के बंधन को साबित करने के लिए, हम एक एंजाइम प्रतिरक्षा इस्तेमाल किया. इस परख में, rhBMP-2 एक बीएमपी -2 विशिष्ट एंटीबॉडी और एचआरपी के साथ संयुग्मित एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे immobilized पेश सतहों. बाद के बंधन घ जा सकता हैएक Ampliflu लाल समाधान का उपयोग etermined. हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में, एचआरपी फ्लोरोसेंट परिसर resorufin में बेरंग Ampliflu लाल (10-acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) के रूपांतरण catalyzes. हम immobilized सतह का पता चला rhBMP -2 (iBMP -2) से पहले और functionalized सतहों के साथ ऊपर से पक्षपाती कोशिकाओं के करीब पहुंच गया है. Ampliflu लाल परख के साथ rhBMP का पता लगाने के लिए, नमूने कई ऊष्मायन कदम और उपचार के अधीन हैं कि कृपया ध्यान दें. इसलिए, यह. चित्रा 2A विरोधी बीएमपी 2 आईजीजी द्वारा मान्यता प्राप्त एक रचना में सतह को rhBMP -2 का सफल बंधन से पता चलता है और इससे पहले सेल उत्तेजना के बाद ही सतह की जांच के लिए संभव नहीं है. चित्रा 2B से पता चलता है एक iBMP- पूर्व एचआरपी immunoassay को 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि 2 सतह. यहां तक ​​कि सेल उत्तेजना के बाद प्रोटीन की सतह पर पाया जाता है.

Immobilized आरएच पेश सतहों के लिए सेल प्रतिक्रियाबीएमपी -2 का मूल्यांकन और गैर इलाज सोने substrates (नकारात्मक नियंत्रण) के प्रभाव की तुलना में थे. अल्पकालिक संकेतन के विश्लेषण पर आसंजन प्रक्रिया के प्रभाव को कम करने के लिए, एक विशेष सेट अप सेल उत्तेजना के लिए विकसित किया गया था. इधर, C2C12 कोशिकाओं ऊपर से आ rhBMP -2 functionalized सतहों से 30 मिनट के लिए प्रेरित किया गया. माउस myoblast सेल लाइन C2C12 व्यापक रूप से मांसपेशियों के ऊतकों में हड्डी गठन के दौरान osteogenic भेदभाव के प्रारंभिक चरण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है जो एक pluripotent mesenchymal अग्रदूत सेल लाइन, है. इस मॉडल में, बीएमपी -2 multinucleated myotubes में कोशिकाओं के भेदभाव को रोकता है और अस्थिकोरक 21 phenotypes लाती है. बीएमपी 2 संकेतन मार्ग के बहाव के पत्रकारों हैं जो Smad 1/5/8 के सक्रियण, पश्चिमी सोख्ता से विश्लेषण किया है. चित्रा 3 में दिखाया गया है Smad 1/5/8 का कोई phosphorylation तब होती है, जबकि Smad phosphorylation, iBMP-2 से 30 मिनट उत्तेजना के बाद मनाया जाता हैकोशिकाओं में अनुपचारित सोने के नमूनों से अवगत कराया. इस परिणाम स्थिरीकरण प्रक्रिया बीएमपी 2 अल्पकालिक गतिविधि में परिवर्तन और Smad संकेतन में प्रारंभिक कदम चलाता नहीं है कि इंगित करता है.

IBMP-2 लंबी अवधि osteogenic भेदभाव को प्रभावित करता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, alkaline फॉस्फेट (एएलपी) की अभिव्यक्ति के स्तर, एक osteogenic मार्कर, एक वर्णमिति परख द्वारा जांच की गई. C2C12 कोशिकाओं की एएलपी गतिविधि सादे सोने (नियंत्रण) और iBMP -2 सतहों पर 6 दिनों के लिए कोशिकाओं incubating के बाद मापा गया था. IBMP -2 सतहों पर संवर्धित कोशिकाओं की lysates में एएलपी गतिविधि नियंत्रण (3B चित्रा) की तुलना में काफी अधिक अवशोषण से पता चलता है. इस परिणाम iBMP -2 C2C12 कोशिकाओं में osteogenic मार्कर एएलपी की अभिव्यक्ति लाती है कि पता चलता है. इस सेल लाइन जिससे myotubes बनाने और विशेषता myogenic प्रोटीन व्यक्त, कम सीरम शर्त के तहत तक पहुंचने confluency पर अंतर करने के लिए जाना जाता है. हालांकि, बीएमपी -2 के साथ उपचार में एक बदलाव का कारण बनता हैइसलिए myotubes के गठन को दबा osteoblastic को myoblastic से भेदभाव मार्ग,. Myogenesis पर iBMP-2 के प्रभाव की जांच करने के लिए, C2C12 कोशिकाओं सोना (नियंत्रण) या क्रियाशील सतहों और भेदभाव (कम सीरम) की शर्तों के तहत सुसंस्कृत पर सीधे चढ़ाया गया. 6 दिन बाद, मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) के धुंधला प्रदर्शन किया गया था. चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, C2C12 कोशिकाओं iBMP -2 की उपस्थिति में MHC सकारात्मक myotubes फार्म करने के लिए असफल हो, लेकिन नहीं सोना substrates पर.

चित्रा 1
चित्रा 1. सोने की सतहों पर rhBMP-2 के स्थिरीकरण की प्रक्रिया की योजना. कांच coverslips एक सोने की परत के साथ लेपित और बाद में एक एनएचएस क्रियाशील आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम) में जिसके परिणामस्वरूप एक heterobifunctional linker (एम यू एन एच एस) के साथ incubated हैं. बीएमपी -2 के प्राथमिक amines सहयोग करने के लिए अग्रणी linker के साथ प्रतिक्रियासब्सट्रेट पर valently immobilized प्रोटीन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. RhBMP -2 (ए) से पहले एंजाइमी immunoassay ने पता लगाया है और साथ ही (बी) सेल उत्तेजना प्रयोगों. Immobilized rhBMP -2 Ampliflu लाल वर्णमिति परख का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया गया था, के बाद किया जा सकता भूतल बाध्य. अवशोषण 570 एनएम पर मापा गया था और डेटा (सोना सतहों गैर इलाज) मूल्यों को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत थे. त्रुटि सलाखों मतलब N> 3 से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Immobilized rhBMP -2 जैविक रूप से सक्रिय रहता है और के रूप में अल्पकालिक लातीसाथ ही लंबी अवधि के संकेत घटनाओं. (ए) C2C12 कोशिकाओं covalently immobilized rhBMP -2 (iBMP -2) ऊपर से निकट के साथ सोने की सतहों (नियंत्रण) और सतहों के संपर्क से 30 मिनट के लिए प्रेरित किया गया. सेल के बाद, नमूने p-Smad1/5/8 और β-actin के लिए immunoblotted गया. (बी) alkaline फॉस्फेट के enzymatic गतिविधि (एएलपी) C2C12 कोशिकाओं की osteogenic भेदभाव को इंगित करता है और एक 6 दिन ऊष्मायन के बाद सेल lysates से मापा गया था नियंत्रण या क्रमशः iBMP -2 सतहों पर अवधि. एएलपी गतिविधि 405 एनएम पर absorbance के रूप में मापा गया था. बार ग्राफ दिखाता एक 60 मिनट की प्रतिक्रिया के बाद प्राप्त आंकड़ों. त्रुटि सलाखों 0.01. (सी) C2C12 कोशिकाओं myogenesis अनुमति देने के लिए कम सीरम परिस्थितियों में 6 दिनों के लिए संकेत दिया सतहों और सुसंस्कृत पर वरीयता प्राप्त थे * <पी, मानक विचलन का संकेत मिलता है, N = 3. छवियाँ मायोसिन भारी श्रृंखला multinucleated myotubes की (MHC) धुंधला (हरा) और DAPI नाभिक धुंधला (नीला) दिखा. छवि बढ़ाई 20x.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम bioactive rhBMP-2 के साथ क्रियाशील सतहों की तैयारी का वर्णन है. ; RhBMP -2 प्रोटीन की 2) सहसंयोजक स्थिरीकरण सोने की सतह पर एक bifunctional लिंकर की एक स्वयं कोडांतरण monolayer (एसएएम) का 1) प्रारंभिक गठन: यह दृष्टिकोण दो कदम शामिल हैं. पिछले काम में, हम bifunctional लिंकर और वृद्धि कारक के प्रभावी बंधन मान्य, और सतह से स्थिर rhBMP-2 अपने जैविक गतिविधि 19 का कहना है कि प्रदर्शन किया. एक स्थिर रूप में प्रस्तुत किया वृद्धि कारकों की bioactivity भी प्रोटीन की रिहाई और उनके बाद internalization सेल उत्तेजना 24,25 के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं यह दर्शाता है कि अन्य अध्ययनों में दिखाया गया है. कोशिका झिल्ली 22,2 पर क्योंकि रिसेप्टर्स के विभिन्न प्रकार का बढ़ाया अधिभोग दर का एक प्रभावी खुराक को बनाए रखते हुए वास्तव में, वृद्धि कारकों के सहसंयोजक स्थिरीकरण लक्ष्य कोशिकाओं की निरंतर उत्तेजना की अनुमति देता है3,26-28.

Immobilized rhBMP -2, देखभाल पेश सतहों की तैयारी के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान सतहों से निपटने में और rhBMP-2 समाधान की तैयारी में लिया जाना चाहिए. कांच coverslips साफ और शुष्क होना चाहिए और दोष या दोष का कोई संकेत नहीं दिखाई जानी चाहिए. चिमटी और pipettes साथ सतह scratching से बचा जाना चाहिए. RhBMP-2 का उपयोग कर सतह functionalization कदम के लिए, यह सतह पर वाहक की अवांछित स्थिरीकरण से बचने के लिए, तैयारी में जोड़ी गोजातीय सीरम albumin के बिना एक वाहक से मुक्त पुनः संयोजक प्रोटीन, यानी उपयोग करने के लिए आवश्यक है. rhBMP-2 शेयर (100 माइक्रोग्राम / एमएल) 4 मिमी एचसीएल में भंग कर रहा है. सतहों rhBMP-2 समाधान के साथ incubated रहे हैं, पीएच सतह बाध्य linker के एन एच एस समूह के साथ प्रोटीन के अमीनो समूह की प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए मामूली क्षारीय पीएच तटस्थ समायोजित किया जाना चाहिए. पीएच बहुत कम है, तो यह बुद्धि प्रतिक्रिया कर सकते हैं, इससे पहले कि एनएचएस समूह hydrolyzed जा सकता हैप्रोटीन की ज एमिनो समूहों. हम 1 एम NaCl 29 पीबीएस युक्त का उपयोग करें और शेयर से rhBMP-2 जोड़ सकते हैं और तब KOH (10 मिमी) के साथ पीएच को समायोजित.

क्योंकि इस प्रोटोकॉल के साथ हम सतहों पर bioactive rhBMP -2 का सफल स्थिरीकरण हासिल की: 1) हम एक दो कदम दृष्टिकोण की स्थापना, 2) हम सतह से दूरी प्राप्त करने के लिए और पर प्रमुख हस्तक्षेप के बिना प्रोटीन बाध्य करने के लिए एक उपयुक्त लिंकर इसके प्रयुक्त रिसेप्टर के साथ बातचीत. amine प्रतिक्रियाशील alkanethiol, 11-mercaptoundecanoyl एन hydroxysuccinimide एस्टर (एम यू एन एच एस), पहला कदम में सोने सब्सट्रेट करने के लिए सीमित किया गया था. Alkanethiols के रूप में एक उच्च आदेश दिया monolayer के गठन, सोने जैसी धातुओं पर स्वयं को इकट्ठा, वे linker अणुओं की एक किस्म 30-32 के साथ सतहों की सजावट की सुविधा. सैम जिससे विकृतीकरण 32 के जोखिम को कम करने, ठोस सतह के साथ सीधे संपर्क में आने से biomolecules ढालें. इसके अलावा, लिंकर की लंबाई भी इसकी वजह यह निर्धारित करता हैसैम की ctivity. चिंटू एनएचएस की तरह कम से कम ग्यारह कार्बन परमाणुओं से मिलकर linkers की एनएचएस समूहों, छोटे linkers 34 के लिए बाध्य करने की तुलना में वृद्धि हुई प्रोटीन स्थिरीकरण, जिसके परिणामस्वरूप अधिक सुलभ हैं. rhBMP-2 का स्थिरीकरण प्रोटीन की 34 लाइसिन अवशेषों से एन एच एस समूह के विस्थापन के माध्यम से होता है. केवल steric पर्यावरण को ध्यान में रखते, सतह immobilized एनएचएस समूहों की प्रतिक्रिया की संभावना सबसे अधिक लचीला एन टर्मिनल अवशेषों 35 में जगह लेता है. अन्य ligands के लिए दिखाया गया है लेकिन, जैसा कि लंबाई और linker का लचीलापन इस प्रकार प्रतिकूल अभिविन्यास 36,37 के लिए compensating, अन्यथा sterically बाध्यकारी साइटों रुकावट के साथ बातचीत के लिए सक्षम हो सकता है. अप्रकाशित काम में हम एक दो कदम स्थिरीकरण रणनीति के साथ एक कदम की तुलना में. प्रोटीन और linkers, और linker और प्रोटीन के बंधन अनुक्रमिक सतह दोनों युक्त समाधान का उपयोग कर के बीच तुलना से पता चला है कि केवल दोकदम रणनीति bioactive ligand स्थिरीकरण में हुई. यह तो सोने पर जगह ले सकता है कि प्रोटीन विकृतीकरण hinders जो सैम के एक परिरक्षण प्रभाव के कारण हो सकता है. लिंकर पहले से ही सतह पर लंगर डाले है, क्योंकि इसके अलावा, लिंकर और उनके परिणामस्वरूप निष्क्रियता के अंत समूहों के माध्यम से प्रोटीन के बीच पार से उठाना 38 circumvented रहे हैं.

सतह से स्थिर rhBMP-2 के साथ प्रेरित कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए, यह C2C12 सब्सट्रेट पर उन्हें बोने से पहले की संस्कृति फ्लास्क में myotubes फार्म नहीं था कि पहले से निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, कोशिकाओं संस्कृति में subconfluent रखा जाना चाहिए. संवर्धन के लिए और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल भ्रूण गोजातीय सीरम के बैच कोई osteogenic उत्तेजनाओं मौजूद हैं यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जाना है. यह हड्डी morphogenetic प्रोटीन का पता लगाने के लिए Quantikine परख का उपयोग करके और osteogenic भेदभाव मार्करों के लिए कोशिकाओं के परीक्षण के द्वारा किया जाता है, जैसे alkal ine फॉस्फेट अभिव्यक्ति. संस्कृतियों के ऊपर से उत्तेजना के लिए substrates उठाते वक्त यह चिमटी के साथ किसी भी खरोंच से बचने के लिए फिर से महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं की संस्कृति और फैलाएंगे के सूखने अन्यथा सेल विरूपण और मौत नकारात्मक बीएमपी -2 उत्तेजना के जवाब को प्रभावित करेगा, किसी भी मामले में बचा जाना चाहिए. हम कोशिकाओं कोशिकाओं पर सब्सट्रेट लागू करने से पहले सुसंस्कृत हैं, जहां 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में pipetting DMEM के लगभग 100 μl की सलाह देते हैं. कोशिकाओं कोई morphological परिवर्तन संस्कृतियों के शीर्ष पर सतहों की मौजूदगी से शुरू हो रहे हैं विश्वास दिलाता हूं कि खुर्दबीन के नीचे देखा जाना चाहिए. Substrates को हटाने के अंत में, जब एक तरफ ध्यान से चिमटी के साथ उठाया है और सब्सट्रेट धीरे से खुली है. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ किसी भी कोशिका क्षति के लिए एक तत्काल जाँच के रूप में अच्छी तरह से किसी भी सेल tethers या प्रमुख दोष मौजूद हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए substrates की एक जाँच के रूप में, प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

_content "> अंत में, प्रस्तुत दो कदम प्रक्रिया सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अपने amine अवशेषों के माध्यम से substrates पर rhBMP -2 स्थिर करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. वर्णित रणनीति कई लाभों को जोड़ती है. एक ओर, यह नहीं है बीएमपी -2 के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन वे एक उच्च संरक्षित अमीनो एसिड संरचना मौजूद है के बाद से यह भी, बीएमपी परिवार के अन्य विकास कारकों के लिए लागू किया जा सकता है. दूसरी ओर, unspecific सोखना रोकने के द्वारा, इस दृष्टिकोण बीएमपी 2 की जांच लक्षित में सक्षम बनाता है वृद्धि कारक की मात्रा को कम करने और, जबकि, सबसे विशेष रूप से, सतह से अनियंत्रित रिहाई निरोधक.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उसकी तरह की सहायता के लिए प्रो जेपी Spatz (biophysical रसायन विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय के हीडलबर्ग और नई सामग्री और Biosystems विभाग, इंटेलिजेंट सिस्टम के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट, स्टटगार्ट) धन्यवाद. मैक्स प्लैंक-Gesellschaft और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (ईएसी-A के लिए DFG SFB/TR79.) से वित्तीय सहायता भी बहुत स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

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